基因工程笔记(30页).doc

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1、-基因工程笔记-第 29 页绪论第一节 基因工程的诞生第二节 基因工程的安全性第三节 基因工程的应用第四节 基因工程技术的商业化发展一、定义 Genetic engineering： 在体外将核酸分子 插入病毒, 质粒或其它载体系统中 ,构成遗传物质的新组合 再整合到那些本来不含该类物质的宿主中 从而形成一种新的可连续繁殖的有机体 就是有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。 Clone:从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。二、特征1. 跨物种性 外源基因到另一种不同的生物细胞内进行

2、繁殖。2. 无性扩增 外源DNA在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达。三、基因工程的主要操作内容（供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件） 1. 目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消 化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。 2. 重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。 3.重组体的转化; 将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。 4.克隆鉴定:挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因） 5.目的基因表达:使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。安全性一、基因工程的安全措施 （1）实验室的物理安全

3、 P1级实验室一般装备良好的普通微生物实验室。 P2 级实验室 在P1级实验室的基础上还装备有 负压的安全操作柜。 P3 级实验室全负压的实验室，同时装备安全操作柜 P4级实验室专用的实验大楼，周围与其它建筑物应有隔离带。具有最高安全防护措施 （2）实验室的生物安全（分3 级（大肠杆菌）：EK1EK3级。）EK1：在自然环境中一般都要死亡。 EK2：在自然环境中无法存活。 EK3；应该是失去了自我迁移的能力。（3） 载体的安全 应该是失去了自我迁移的能力。不会自动从“安全”的菌株转移到“不安全”的菌株中。（容易构建）。如pMB9，pBR322等基因工程的应用 ppt 20页左右第一章 基因操作

4、的主要技术原理第一节 DNA的提取与纯化第二节 DNA的凝胶电泳第三节 核酸的分子杂交第四节 基因 扩增技术-PCR第五节 DNA序列分析第六节 酵母双杂交系统DNA的提取与纯化 DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。强碱复性中性 原理闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。所用的试剂作用 溶菌酶 能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的b-1，4糖苷键。在碱性条件（pH8）下有活性 葡萄糖 增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡

5、）的作用而降解 EDTA Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。 NaOH-SDS NaOH：强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。 NaAc-HAc缓冲液冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性，高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀 乙醇 用于沉淀DNA ，DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。 RNase A 降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的R

6、NA。 TE缓冲液：DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解 酚-氯仿（选用）蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。提取质粒DNA的步骤 溶菌 破膜 蛋白质和DNA变性 中和 离心除去沉淀 纯化DNA 沉淀DNA 溶菌：使用“溶液”溶解细菌细胞壁。溶液： 50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA，4-5mg/ml溶菌酶，RNase A溶液II0.2N NaOH，1.0%SDS溶液III3

7、M 醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8） 影响质粒DNA产量的因素 菌株的遗传背景，质粒自身的拷贝数DNA的定量和纯度测定1. 紫外光谱法（DNA（或 RNA）在260nm波长处有特异的紫外吸收峰。蛋白质280）2. 琼脂糖凝胶电泳估计（溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能发 红色荧光与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。）DNA分子量的估计一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知。MarkerDNA的凝胶电泳原理：1. 带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为移率。2. 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所

8、带的净电荷数目成正比。3. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。 电场条件相同分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状。闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，伸展开环状最慢。琼脂糖凝胶电泳（空隙大小决定其分辨分子大小的能力。）聚丙烯酰胺凝胶电泳 优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。辨别一个碱基差迁移速率影响因素核酸的分子杂交 DNA-DNA或DNA-RNA链杂交。用放射性同位素（32P或125I）标记的DNA或RNA探针。 探针的标记：原理:Southern杂交：Northern blot：用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。Western blot：Western 杂交

9、的总体过程也与 Southern 杂交相似，只不过在 Blotting 过程中转移的是蛋白质而不是 DNA ，这种将蛋白质样品从 SDS-PAGE 凝胶通过电转移方式转移到滤膜的方法，称为 Western blotting 。几种核酸分子杂交比较作用材料 目的Southern杂交 DNA 判断某生物样品中是否含有某一基 因。Northern blot RNA 检测细胞或组织样品中是否存在与探针同源的 mRNA 分子，从而判断在转录水平上某基因是否表达。 Western blot 蛋白 Western 杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在能被某抗体识别的蛋白质，从而判断在翻译水平上某基因是否

10、表达。原位杂交：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落（原位杂交就是将细菌菌落影印到滤膜上，或将菌种点种在滤膜上然后再生长出可见的菌落，对滤膜上的菌体进行原位裂解使 DNA 释放出来，并使之固定在滤膜上。然后通过分子杂交，判断哪个或哪些菌落含有与探针同源的 DNA 。菌落杂交主要用来从用质粒或 Cosmid 构建的基因文库中寻找阳性克隆子，当得到阳性克隆子后，再通过 Southern 杂交进一步验证。通过这种方法在一张直径为 9cm 的滤膜上，可检测成几百到一千甚至上万个菌落，达到高通量筛选的目的。）斑点杂交：斑点杂交是分子杂交中最简单的一种，直接将 DNA 或 RNA 分子以斑点的

11、形式固定在滤膜上，然后进行分子杂交。第四节 基因 扩增技术-PCR基因扩增指生物体内或体外人工方式使基因拷贝数大规模增加。有下列五种方式PCR体系复性50oC 1min变性94oC 1min延伸72oC 2min模板TAQ酶PrimedNTPS氯化镁溶液10*bufferdd水物质体系进行前先95oC 5min2. PCR技术的原理PCR的过程：（1）第一步 变性（denature）94-95 oC下5分钟模板DNA双链完全变性成单链。 （2）第二步 复性（anneal）50-60 oC下1分钟，引物优先与模板复性。优先的原因是因为引物的浓度高，链短 （3）第三步 延伸（extend）72 o

12、C下1-2分钟，Taq DNA聚合酶在引物的3端上加上核苷酸。 （4）第四步 变性（denature）94 oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。 （5）第五步 重复（repeat）反应体系：（注意添加顺序，考虑经济原则） Dd水 10*buffer 氯化镁 dNTPS PRIME TAQ酶 模板 影响 PCR的因素 （1）Taq DNA聚合酶 热稳定性 最适温度高 Taq酶的功能缺点：具53聚合酶活性和53外切酶活性，但没有35外切酶活性。因此不能修复错误的碱基配对（合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序） Taq DNA聚合酶的激活剂：当dNTP

13、（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。需做正交试验得到结果。 （2）引物（primer) 位置与待扩增的模板DNA区段的两3端序列互补（ 5端相同）的短DNA。引物的长度一般引物设计为长1530bp（按概率与特异性计算得到）引物的碱基序列：3端必须与模板正确配对，5端可以不配对。5端另有很多作用引物的碱基组成：尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力避免连续相同碱基排列或内部回文序列 （形成发夹结构）； 引物的Tm值：原始按照计算公式计算，现程序设计。套嵌引物（nested primers) 设计多组引物，结合位点依次位于前一

14、组引物之间。增加扩增产物的特异性。（3）dNTPs 一般反应体系中dNTP混合液终浓度用0.2mmol/L。浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性并增加错配率。（4）模板（template） 纯度：但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。 模板的量：不能太多，100ml反应体系中100ng足够。PCR技术的扩展PCR技术荧光实时定量PCR 借助于荧光信号来检测PCR产物。可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据Ct值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。 反向PCR 扩增两个引物外侧的未知序列把线性D

15、NA模板转变成环形分子。不对称PCR 用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。反转录PCR（RT-PCR) 把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。NA病毒。PCR技术的应用 （1）扩增某一段DNA （2）基因的体外诱变 （3）基因组的比较研究 DNA序列分析 一、双脱氧链终止法 双脱氧核苷酸分子的脱氧核糖的 3 位置的 -OH 缺失。当它与其他正常核苷酸混合在同一个扩增反应体系中时，在 DNA 多聚酶的作用下，虽然它也能够象正常核苷酸一样参与 DNA 合成，以其 5 位置的磷酸基，与上位脱氧核苷酸的 3 位置的 -OH 结合，但是，由于它自身 3 位置 -OH 的缺失，

16、至使下位核苷酸的 5 磷酸基无法与之结合。 1. 原理 （1）DNA复制是以一条链为模板，按碱基配对的原则进行的。（2）脱氧核糖的连接是以35磷酸二脂键。（3）复制反应可以在体外进行。（4）2和3双脱氧的ddNTP会使复制反应终止。技术要点： （1）制备单链DNA模板 （2）特殊的DNA多聚酶 （3）制备2和3双脱氧的ddNTP 。dNTP / ddNTP = 100 / 1 （4）制备一小段单链引物（DNA或RNA）带有放射性或荧光标记批注：不能有53和35的外切酶活性；与模板的亲和力高，不会提前脱离模板。 （高保真） 还有很多测序方法：见ppt。留意自动测序。 基因工程工具酶核酸酶聚合酶连

17、接酶修饰酶 拓扑异构酶第二章 基因工程的酶学基础一、(II类)限制性内切酶 （1）识别位点 48bp，回文结构（2） 内切酶与识别序列的结合模式：二聚体与靶序列结合 （3）切割位点（识别位置处）切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。（4）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）： 5端凸出（如EcoR I切点）或 3端凸出（如EcoR I切点）（5）同尾酶(Isocaudamers）识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等（同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原

18、来的酶识别。） DNA末端长度对限制酶切割的影响：限制酶切割 DNA 时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性 位点偏爱（Site preference）某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。 星号（*）活性 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星号（*）活性。 ：酶切反应条件;缓冲液反应温度反应时间终止酶切的方法（1）缓冲液的化学组成MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度；ris-HCl

19、： 维持pH；二硫苏糖醇（DTT）： 保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等： 有助于酶的稳定；温度：不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求40-65oC。 反应时间：反应时间通常为1小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶的用量。终止酶切的方法：EDTA + 加热 + 苯酚EDTA 可鏊合镁离子，从而可终止酶切反应，终止浓度为 10mM ；加热是常用的方法，对于最佳反应温度为 37 的酶，在 65 或 80 处理 20 分钟可使酶活性大部分丧失。对于在 80 作用 20 分钟也有不失活的酶可用苯酚抽提去除蛋白，或用试剂盒纯化 DNA 。 完全消化 与局部消化 1）、完全

20、消化：内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。2）、局部消化：只有有限数量的酶切位点被切开。 影响限制性内切酶活性的因素:外因：外因是可预见和控制的，如反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应体积的选择以及反应时间的长短等等 内因：内因包括位点偏爱性、甲基化底物、底物的构象。构象的影响主要指切割线性 DNA 和超螺旋 DNA 时的活性，如与切割 lDNA 相比， EcoR、Pst、Sal 需要至少 2.5-10 倍的酶来切割 pBR322 的超螺旋 DNA 位点偏爱（Site preference）某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对

21、不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。二、连接酶两种DNA连接酶 大肠杆菌连接酶 T4噬菌体连接酶 只能连接粘性末端。 不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端。连接条件：（1）必须是两条双链DNA（2）DNA3端有游离的-OH， 5端有一个磷酸基团（P）（3）需要能量 连接反应的温度：最佳温度为37度但实际温度为4-16度。（考虑到氢键的稳定性）影响连接反应的因素：1、 插入片段与载体的浓度比例 （10-20倍） 增加机会。防止自连2、 反应温度 4-16三、修饰酶 末端脱氧核苷酸转移酶用途：1.同聚物加尾 给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有

22、效地连接。（2）再生酶切位点（3）非放射性标记DNA片断的3端 碱性磷酸酶 分类（1）细菌性碱性磷酸酶（2）小牛肠碱性磷酸酶碱性磷酸酶的功能 1）防止线性化的载体份子自我连接第三章 基因工程的载体载体：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体基因工程载体质粒型载体病毒型载体质粒+病毒型载体人工染色体载体 基因工程对载体 有哪些要求：（1）在宿主细胞内能独立复制。（2）有选择性标记。（3）有一段多克隆位点。外源DNA插入其中不影响载体的复制。（4）分子量小，拷贝数多。（5）容易从宿主细胞中分离纯化。一、质粒型载体人工构建的质粒载体的类型（1）高拷贝数的质粒载体（2）低拷

23、贝数的质粒载体（3）失控的质粒载体（4） 插入失活型质粒载体（5）正选择的质粒载体（6） 表达型质粒载体 质粒（plasmid） 是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。质粒的类型（大肠杆菌中）质粒的复制类型质粒的选择标记及其工作原理氨苄青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性 （Kanr）四环素抗 （Tetr）链霉素抗性 （Strr）氯霉素抗性 （Cmlr）有关质粒载体的构建天然质粒的局限性（1）分子量大，拷贝数低2）筛选标志不理想经典的大肠杆菌质粒载体：1、 pBR322（F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工构建载体。） （1）元件来源 复制起点 ori pMB

24、1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点 Ampr基因pSP2124质粒的Ampr基因 Tetr基因pSC101的Tetr 基因。 （2）长度 4363bp （3）选择标记 氨苄青霉素和四环素抗性 （4）克隆位点 24个克隆位点 （5）pBR322的优点 双抗菌素抗性选择标记（没有获得载体的寄主细胞在Amp或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞在Amp或Tet其中之一中死亡。） 分子小，克隆能力大 高拷贝数 氯霉素扩增后达到1000-3000拷贝 安全 失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。3、 PUC系列（University of California的

25、J. Messing和J. Vieria于 1978年，在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。）（1）元件来源 复制起点 pBR322的 ori Ampr 基因 pBR322的Ampr基因 lacZ的启动子 大肠杆菌 lacZ基因 大肠杆菌lacZ的a-肽链序列， 是LacZ 的氨基端片断。（2）长度 约2.7kb（3）克隆位点 10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ基因的5端。（4）选择标记 Ampicillin 抗性和 lacZ的a肽互补（蓝白斑）相结合。蓝白斑选择原理： Xgal b-半乳糖苷酶Xgal显色反应：b-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的

26、物质5-溴-4-氯靛蓝。 lacZ的a肽互补1）a-肽（ lacZ ）：b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。lacZ只有在4聚体的状态下才有功能，受体菌基因组的b-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失a肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal 。pUC质粒载体上的lacZ 编码a肽与这个缺失突变的b-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解Xgal。产生蓝色物质。pUC载体上LacZ的5端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ的合成。不能互补。 IPTG的诱导作用 IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转

27、录，使受体菌基因组中的lacZ 的C端部分和载体的lacZa肽都表达。从而互补。但载体MCS上插入外源DNA后，仍然不能产生a肽（5）pUC系列载体的优点 更小的分子量： 选择方便 克隆便利 测序方便（pUC的MCS与M13噬菌体载体的MCS完全相同，便于把外源DNA转移到M13载体上测序。）由质粒载体演化而来的载体3. 穿梭质粒载体（shuttle plasmid vectors）人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。穿梭载体的优点： 利用大肠杆菌进行基因克隆、表达 也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。 可

28、以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。二、噬菌体型载体 噬菌体（一类细菌病毒）的一般特性 结构：蛋白质外壳内包裹着DNA（双链、单链、线性、环状等）。噬菌体的生活周期 1. 溶菌周期：烈性噬菌体（virulent phage)感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。2. 溶原周期：温和噬菌体（temperate phage) 感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化（lysogenization)（整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。）三、单链噬菌体载

29、体单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：M13（典型）1. 单链DNA噬菌体的特点（1）+DNA。（ssDNA）（2）复制型（RF）是双链环状DNA。（3）RF DNA和ssDNA都能转染感受态 大肠杆菌。并产生噬菌斑。（4）不存在包装限制。（5）可产生大量的含有外源DNA插入片断的单链分子，便于作探针或测序。2. M13 噬菌体（1）寄主 M13噬菌体只感染雄性大肠杆菌。但M13 DNA可以转染雌性大肠杆菌。（2）DNA长度 6407bp（3）DNA提纯 RF dsDNA在寄主细胞内以高拷贝形式存在。成熟的噬菌体里只包装有 + DNA，也容易提取。（4）M13的生活周期（5）没有包装限制包装过

30、程;3. M13载体的构建：（1）克隆区域的选定 基因间隔区（intergenic region, IG区基因2与5之间507bp）（2）加入酶切位点4. M13系列载体的优点（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段（2） Xgal显色反应，可供直接选择（3）无包装限制，克隆能力大（4）可以克隆双链DNA分子中的每一条链（双酶切）子代M13噬菌体中包含的是单连+DNA。5. M13载体的缺点 插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降 实际克隆能力小于1500bp。虽无包装限制，并非无限包装！6. 噬菌粒载体（phagemid vectors）由质粒载体与单链噬菌体载体的复制起点结合而成的新型载体系列

31、。（1）噬菌粒载体的特点分子量小（3000bp）克隆能力大（可插入10kb外源基因）两种复制形式（既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点。既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，又能在噬菌体内进行单链复制。）2.pUC118/pUC119 构成 1）M13的基因间隔区（带有M13的复制起点）（IG）2）pUC18/pUC19质粒载体：质粒复制起点Ampr lacZ MCS pUC118/119的复制模式1）双链质粒复制模式 每个细胞500个拷贝 2）单链滚环噬菌体复制模式 噬菌粒载体的包装1）辅助噬菌体：自身的复制起点发生了突变，复制效率低下，但感染细菌后能表达出外壳蛋白和复制蛋白，帮助噬

32、菌粒载体复制。2）包装：如右图（5）PCR产物克隆载体结构：pUC的质粒部分、fi噬菌体ori、Kanr和Ampr抗性。 特点MCS的中部已经切开，各有一个3端突出的T。PCR产物往往在3端突出一个A，所以能与这个载体直接连接。Promega 公司的T载体系列四、双链噬菌体载体l载体1. lDNA分子的特点 （1）长度为48502 bp；（2）双链线性DNA；（3）但在两端有cos位点，可以环化。lDNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链互补区域称为cos位点2. l噬菌体的基因组特点 lDNA上有至少61个基因，有一半是必须的，与自身的活动有关，成簇排列。其他约1/3是非必须基因

33、（位于尾部合成至阻遏之间的区段）。3. lDNA的复制 模型1.早期是q型复制 。晚期是（2）滚环复制形成多联体lDAN分子。这种多联体分子必须在cos位点被切断成单体分子才能被包装起来。4. l噬菌体载体的构建（1）构建原理：删除l噬菌体的非必需区，留出插入空间。（2）构建过程在这个非必须区内制造限制酶切点引进某些突变表型，作为选择标记突变某些基因，使它成为安全载体删除lDNA必须区段上常用的限制酶切点（3）人工构建的l噬菌体载体有两种类型：免疫功能失活：插入导致载体不能合成阻遏物， l载体DNA不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。没有外源DNA插入的l载体感染受体菌形成混浊噬

34、菌斑。 替换型载体（substitution vectors)（4）l载体的筛选标记 置换型载体 可取代片断中如果包含LacZ，可用Xgal显色作筛选标记 插入型载体根据插入所引起的表型突变5. l载体的体外包装 l DNA象质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低。（必须利用噬菌体外壳的作用！）体外包装：在试管中与l噬菌体的头部和尾部蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组DNA注入受体菌中。体外包装的容量限制：必须在正常野生型容量的75%105%（3651kb）之间。野生型lDNA的必须区是28kb，所以l载体的最大克隆容量是23kb。（实际上为15kb）。（既不能超过正常野生

35、型容量的5%；又不能低于正常野生型容量的75%）（4）lDNA载体的优点比一般的质粒载体的容量大的多。用在真核生物基因组文库的建立。6. cosmid载体（粘粒）1978年J. Collins和B. Hohn等人发展出cosmid vector（cos site-carrying plasmid)（1）大小 4-6kb （2）组成 一是lDNAcos序列和控制包装的的序列。二是PBR322的质粒的复制子、抗药性基因、几个限制性酶的单一位点（3）cosmid vector的特点 具有l噬菌体的特性：在寄主细胞内形成环化DNA（但不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌 ）。克隆外源DNA后可以体外包装成噬菌

36、体颗粒。具有质粒载体的特性：大多带有pMB1或ColE1的复制子，能象质粒一样复制。方便的选择：有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位点。高容量的克隆能力：45kb （最少不能低于30kb）。51kb-5kb=45kb（5）cosmid cloning 应用cosmid载体在大肠杆菌中克隆大片端的真核基因组DNA技术，叫“柯斯克隆”（cosmid cloning）。理论依据：cos位点:包装识别。2：“多联体”复制：l噬菌体的生命周期中，会产生数百个lDNA通过cos位点连接的“多联体”分子。Ter体系：在包装的时候， l噬菌体具有位点特异的末端酶（terminase）体系（Ter体系），识别c

37、os位点，把多联体切成单个lDNA长度。包装限制：两个cos位点之间，必须保持3845kb的DNA，Ter体系才能识别。（6）cosmid克隆的一般过程克服载体自体连接的改良方案：用碱性磷酸酶除去线性质粒片断5端的磷酸，可防止载体自体连接。用特定的核酸内切酶消化真核生物DNA。用同样的内切酶消化cosmid载体。连接产物中将有一定比例的分子是两端各有一个cos位点、长度40kb左右的真核DNA与载体的连接物。 Ter体系识别并切割切割合适长度的杂种DNA连接物，并包装入噬菌体头部。感染大肠杆菌注入到细菌体内的杂种DNA分子环化，并按质粒的方式复制。（7）cosmid载体克隆的缺点载体片断自我连

38、接。外源DNA片断自我连接。多个本来不在一起的外源DNA片断连接起来同时插入载体（8）cosmid载体的改良第四章 目的基因的获取目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。第一节 基因组DNA片断化 用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。1. 优点 由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！ 二、随机片断化1. 限制性内切酶局部消化法：控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。（1）限制性内切酶的选用原则 内切酶识别位点的碱基数（4或6bp的概率不同） 内切酶粘性末端能与常用克隆位点

39、相连。2. 机械切割法第二节 化学合成目的基因1976年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。一、目前常用的方法磷酸二酯法、亚磷酸三酯法、磷酸三酯法、固相合成法 、自动化合成法。1. 磷酸二酯法（1）原理 保护dNTP的5端P 或3端-OH保证反应定向进行。 带保护的单核苷酸连接带5保护的单核苷酸与带3保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。 用酸或碱的脱保护2. 磷酸三酯法原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3端磷酸和5-OH上都先连接了一个保护基团。二、 化学合成DNA片

40、断的组装（化学合成的DNA片断一般在200bp以内。）1. 互补连接法（1）互补配对预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域形成有断点的完整双链。（2）5端磷酸化用T4多核苷酸激酶使各个片段的5端带上磷酸。（3）连接酶连成完整双链2. 互补延伸连接法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。右下图三、 寡聚核苷酸化学合成的优点1. 直接合成基因2. 合成引物（20bp左右）3. 合成探针序列4. 定点突变合成（合成带有定点突变的基因片断。）5. 合成人工接头或衔接物第三节 目的基因的保存和扩增基因文库：（gene lib

41、erary）;指在细菌中增殖来自某一生物的染色体DNA或cDNA所形成的全部DNA片段克隆集合体。基因库（gene pool）：天然存在于该生物物种体内的全部完整DNA序列的基因集合体。基因银行（genebank）：所有物种的DNA或cDNA或mRNA的序列都是经过测定的（称为基因组数据库更合适）。2. 构建基因文库的载体选用（载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。）（1）对载体的要求 载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少（片断越大）。（2）目前常用的载体 l载体系列：容量为24kp；cosmid载体：容量为50kb ；YAC：容量为1Mb。BAC:

42、 容量为 300kb 3. 基因文库构建的一般步骤（1）染色体DNA大片段的制备 断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。 物理切割法：超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。 酶切法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。（2）载体与基因组DNA大片段的连接（直接连接、人工接头或同聚物加尾。）4. 基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。p: 文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f: 插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数N：所需的重组载体数（克隆数） 记住书上的两个例子的算法二、

43、cDNA文库的构建以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。 cDNA library利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行繁殖、保存和扩增，称cDNA文库。3. cDNA文库的特点（1）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达。（3）包含了所有编码蛋白质的基因。（4）比DNA文库小的多，容易构建。4. 构建cDNA文库的一般步骤（1）总RNA（total RNA）提取（商业化的试剂盒）（2）mRNA的分离纯化 1原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-2%。 mRNA的分离纯化 分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。（3）cDNA的合成 cDNA第一链合成逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。 降解mRNA模板用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。 cDNA第二链合成（很多方法见教材，大