细胞培养精选PPT.ppt

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1、关于细胞培养关于细胞培养第1页，讲稿共46张，创作于星期二第一章第一章 绪论及基本理论知识绪论及基本理论知识l第一节第一节 绪论绪论l一、组织培养基本概念一、组织培养基本概念l从体内取出组织模拟体内生理环境，在无菌、从体内取出组织模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。并维持其结构和功能的方法。第2页，讲稿共46张，创作于星期二第3页，讲稿共46张，创作于星期二二、对组织培养的评价二、对组织培养的评价l长时间观察活细胞长时间观察活细胞l便于记录便于记录l细胞种类广泛细胞种类广泛l便于各种不同测试方法便于

2、各种不同测试方法l与体内相同的基因组与体内相同的基因组l易于实验研究易于实验研究l性价比高性价比高l生物制品主要的手段生物制品主要的手段第4页，讲稿共46张，创作于星期二三、组织培养发展简史三、组织培养发展简史第5页，讲稿共46张，创作于星期二l19071907，Harrison Harrison 悬滴培养法，取蛙胚一片组织，悬滴培养法，取蛙胚一片组织，采用成蛙淋巴做培养基，能存活一周。采用成蛙淋巴做培养基，能存活一周。19101910，Burrows Burrows 用鸡血浆作为鸡胚组织的支持和用鸡血浆作为鸡胚组织的支持和营养物质。比淋巴好，能使神经组织、心脏组织及皮肤营养物质。比淋巴好，能

3、使神经组织、心脏组织及皮肤生长良好。生长良好。lBurrowsBurrows和和Carrel Carrel 成功培养了成年狗、猫、小鼠、豚鼠成功培养了成年狗、猫、小鼠、豚鼠以及恶性组织的外植物。此外，证明传代可延长细胞的寿命。以及恶性组织的外植物。此外，证明传代可延长细胞的寿命。同时，若把胚胎提取液与血浆混合使用，存活的更好。同时，若把胚胎提取液与血浆混合使用，存活的更好。lCarrelCarrel（外科大夫）（外科大夫）发明卡式培养瓶发明卡式培养瓶lW.H.LewisW.H.Lewis和和M.R.Lewis M.R.Lewis 发展出许多合成培养基发展出许多合成培养基l19291929，Fe

4、ll Fell 组织培养组织培养l我国始于我国始于2020世纪世纪3030年代年代第6页，讲稿共46张，创作于星期二第二节第二节 组织培养细胞生物学组织培养细胞生物学l细胞生长指细胞体积增大细胞生长指细胞体积增大;细胞增殖是细胞数量增多。细胞增殖是细胞数量增多。l一、体内外细胞的差异一、体内外细胞的差异l增殖使细胞数量增多增殖使细胞数量增多,分化使机体结构和功能多样化。分化使机体结构和功能多样化。此间每个细胞的生命活动此间每个细胞的生命活动,均听命于外源信号均听命于外源信号,通过相关基通过相关基因的调控因的调控,使之发生增殖或分化的表达。当细胞被离体培使之发生增殖或分化的表达。当细胞被离体培养

5、后养后,信号来源切断信号来源切断,特定基因分化表达减弱或停止，而进特定基因分化表达减弱或停止，而进化中保守的细胞增殖活动却可维持，遂使体内外细胞出现化中保守的细胞增殖活动却可维持，遂使体内外细胞出现了差异，这种差异从细胞离体培养的刹那就开始了。了差异，这种差异从细胞离体培养的刹那就开始了。第7页，讲稿共46张，创作于星期二二、培养细胞的分化l1.1.不适应不适应:细胞在体内时所拥有的分化特性减弱或不显细胞在体内时所拥有的分化特性减弱或不显l2.2.脱分化或去分化：即细胞失掉发生分化的能力。脱分化或去分化：即细胞失掉发生分化的能力。l 不适应是因生存条件的改变使分化发生阻抑不适应是因生存条件的改

6、变使分化发生阻抑;从从分子水平考虑，脱分化很可能是基因变异所致，因此分子水平考虑，脱分化很可能是基因变异所致，因此应分析体外培养细胞分化的改变属何种性质。很多细应分析体外培养细胞分化的改变属何种性质。很多细胞在培养中的改变只是因培养环境的改变和分化因子胞在培养中的改变只是因培养环境的改变和分化因子的缺乏，导致细胞分化表达受阻、分化基因表达抑制的缺乏，导致细胞分化表达受阻、分化基因表达抑制或不充分而已。即便是脱分化也并不意味着细胞分化或不充分而已。即便是脱分化也并不意味着细胞分化能力完全丧失。能力完全丧失。第8页，讲稿共46张，创作于星期二三、培养细胞形态分类 l1.1.贴附型贴附型 ：只赖于贴

7、附才能生长的细胞称贴附性细胞：只赖于贴附才能生长的细胞称贴附性细胞或锚着依存性细胞。当细胞贴附在支持物上之后或锚着依存性细胞。当细胞贴附在支持物上之后,易失易失去它们在体内时原有的特征去它们在体内时原有的特征,细胞分化现象常变得不显著。细胞分化现象常变得不显著。在形态上常表现单一化的现象在形态上常表现单一化的现象,并常反映其胚层起源并常反映其胚层起源,呈呈现类似前述现类似前述“反祖现象反祖现象”。如来源于内、外胚层的细胞多。如来源于内、外胚层的细胞多呈上皮型呈上皮型;来自中胚层的则易呈成纤维细胞型来自中胚层的则易呈成纤维细胞型,显然与细显然与细胞分化有关。由于上述原因胞分化有关。由于上述原因,

8、体外培养细胞形态常表体外培养细胞形态常表现有一般化的倾向。因此在判定培养细胞形态时现有一般化的倾向。因此在判定培养细胞形态时,很很难再按体内细胞标准确定。难再按体内细胞标准确定。第9页，讲稿共46张，创作于星期二la.a.成纤维型细胞成纤维型细胞:本型细胞形态与体内成纤维细胞本型细胞形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名的形态相似而得名;细胞体呈梭形或不规则三角形，细胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质向外伸出中央有卵圆形核，胞质向外伸出2-32-3个长短不同的突个长短不同的突起。细胞在生长时多呈放射状、火焰状或旋涡状走行。起。细胞在生长时多呈放射状、火焰状或旋涡状走行。除真正的成纤维

9、细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等呈本类形态。如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等呈本类形态。第10页，讲稿共46张，创作于星期二lb.b.上上皮皮型型细细胞胞:本本型型细细胞胞具具有有扁扁平平不不规规则则多多角角形形,中中有有圆圆形形核核,细细胞胞紧紧密密相相连连成成单单层层膜膜。起起源源于于内内、外外胚胚层层细细胞胞如如皮皮肤肤表表皮皮及及其其衍衍生生物物、消消化化管管上上皮皮、肝肝、胰胰和和肺肺泡泡上上皮皮等等组组织织培培养养时时,皆皆呈呈上上皮皮型型形形态态。上上皮皮型型细细胞胞生生长长时时,尤尤其

10、其是是外外胚胚层层起起源源的的细细胞胞,细细胞胞之之间间常常出出现现所所谓谓“拉拉网网”,即即在在构构成成上上皮皮膜膜状状生生长长的的细细胞胞群群中中一一些些细细胞胞常常相相互互分分离离卷卷曲曲,致致使使上上皮皮细细胞胞膜膜中中形形成成网网眼眼状状空空洞洞。拉网的形成可能与细胞分泌透明质酸酶有关。拉网的形成可能与细胞分泌透明质酸酶有关。第11页，讲稿共46张，创作于星期二lc.c.游走型细胞游走型细胞:l 本本型型细细胞胞在在支支持持物物上上散散在在生生长长，一一般般不不连连接接成成片片。细细胞胞质质经经常常伸伸出出伪伪足足或或突突起起，呈呈活活跃跃的的游游走走或或变变形形运运动动，速速度度快

11、快而而且且不不规规则则。此此型型细细胞胞不不很很稳稳定定，有有时时亦亦难和其它型细胞相区别。难和其它型细胞相区别。ld.d.多形型细胞多形型细胞:l 除除上上述述三三型型细细胞胞外外，还还有有一一些些组组织织和和细细胞胞，如如神神经经组组织织的的细细胞胞等等，难难以以确确定定它它们们规规律律的的形形态态，可可统归入多形型细胞。统归入多形型细胞。第12页，讲稿共46张，创作于星期二第13页，讲稿共46张，创作于星期二l2.2.悬浮型悬浮型l 有有的的细细胞胞在在培培养养时时不不贴贴附附于于支支持持物物上上，而而呈呈悬悬浮浮状状态态生生长长，如如某某些些癌癌细细胞胞和和血血液液白白细细胞胞可可呈呈

12、悬悬浮浮型型。细细胞胞悬悬浮浮生生长长时时，胞胞体体为为圆圆形形，观观察察时时不不如如贴贴附附型型方方便便。其其优优点点是是细细胞胞悬悬浮浮在在培培养养液液中中生生长长，生生存存空空间间大大，容容许许长长时时间间生生长长，能能繁繁殖殖多多量细胞，便于做细胞代谢等研究。量细胞，便于做细胞代谢等研究。第14页，讲稿共46张，创作于星期二四、培养细胞形态结构l1.1.大体形态：悬浮生长：胞体基本呈圆形大体形态：悬浮生长：胞体基本呈圆形l贴附于支持物：开始为圆形贴附于支持物：开始为圆形,很快经形态演变过渡扁平很快经形态演变过渡扁平形态。附于球体表面时形态。附于球体表面时,细胞与球体呈同心圆细胞与球体呈

13、同心圆,支持物表支持物表面平坦时面平坦时,则细胞先由圆形延展成圆饼形则细胞先由圆形延展成圆饼形,此时的细胞可此时的细胞可称之为放射延展细胞称之为放射延展细胞,其细胞质可区分为其细胞质可区分为:中心区或中心区或内质内质外质或板层区外质或板层区:活跃与不活跃部分。放射延展细活跃与不活跃部分。放射延展细胞持续胞持续0.5-2h0.5-2h过渡为极性细胞。当细胞相互接壤成片后过渡为极性细胞。当细胞相互接壤成片后,极性常变得不明显极性常变得不明显,外质周边部也无明显活跃部分与不外质周边部也无明显活跃部分与不活跃部分的区别。活跃部分的区别。第15页，讲稿共46张，创作于星期二第16页，讲稿共46张，创作于

14、星期二2.2.超微结构超微结构:电镜观察细胞膜分为三层结构，双层类脂电镜观察细胞膜分为三层结构，双层类脂分子组成；细胞膜向外凸出形成微绒毛；即使细胞连接分子组成；细胞膜向外凸出形成微绒毛；即使细胞连接成片时，在细胞之间仍存在着一定的间隙；细胞相互接成片时，在细胞之间仍存在着一定的间隙；细胞相互接触部并可见到桥粒，桥粒的有无可作为识别上皮细胞的触部并可见到桥粒，桥粒的有无可作为识别上皮细胞的标志；细胞膜表面常附有由细胞分泌物形成的糖蛋白膜，标志；细胞膜表面常附有由细胞分泌物形成的糖蛋白膜，即细胞外衣，它对细胞的运动，尤其对细胞贴附于支持即细胞外衣，它对细胞的运动，尤其对细胞贴附于支持物生长有很大

15、作用；微丝存在于细胞膜下面的胞质区膜物生长有很大作用；微丝存在于细胞膜下面的胞质区膜下皮质层；细胞质中的其它结构如线粒体、内质网、高下皮质层；细胞质中的其它结构如线粒体、内质网、高尔基氏复合体、中心体和溶酶体等多集中在细胞内质尔基氏复合体、中心体和溶酶体等多集中在细胞内质第17页，讲稿共46张，创作于星期二l3.3.细胞骨架观察细胞骨架观察(CSL):(CSL):细胞骨架细胞骨架(微丝和微管微丝和微管)是细胞是细胞质中重要结构之一质中重要结构之一,与细胞运动以及细胞转化有密切关与细胞运动以及细胞转化有密切关系。系。l鬼笔环肽显示微丝蛋白染色法：鬼笔环肽显示微丝蛋白染色法：l(1)(1)盖片培养

16、细胞盖片培养细胞(70%-80%(70%-80%汇合汇合),PBS),PBS洗洗3 3次次;l(2)2%(2)2%的甲醛的甲醛/PBS/PBS液液(甲醛按甲醛按37%)37%)固定固定3min;3min;l(3)0.5%(3)0.5%三硝基甲苯三硝基甲苯/PBS/PBS处理处理3 3次次,每次每次10min,PBS10min,PBS洗洗3 3次次;l(4)(4)用罗丹明标记的鬼笔环肽用罗丹明标记的鬼笔环肽(1:10)(1:10)室温中反室温中反15min,PBS15min,PBS洗洗3 3次次;l(5)60%(5)60%甘油十荧光防淬剂封片甘油十荧光防淬剂封片,荧光显微镜检。荧光显微镜检。第1

17、8页，讲稿共46张，创作于星期二l抗管蛋白免疫染色法抗管蛋白免疫染色法:微管主要成分为管蛋白微管主要成分为管蛋白 l(1)(1)支持物培养法支持物培养法,培养在盖片上培养在盖片上,PBS,PBS中洗中洗330s;330s;l(2)3%(2)3%甲醛液固定甲醛液固定20min,PBS20min,PBS洗洗31min,31min,吸干多余吸干多余PBS;PBS;l(3)(3)冷丙酮冷丙酮(-10(-10-20),-20),令细胞面向上令细胞面向上,作用作用7min,7min,PBSPBS中洗中洗31min,31min,吸干多余的吸干多余的PBS;PBS;l(4)(4)直径直径6cm6cm碟皿碟皿,

18、中央滴浓度为中央滴浓度为0.1-0.2mg/ml0.1-0.2mg/ml的一级抗的一级抗管蛋白抗体管蛋白抗体,细胞面向下细胞面向下,置置3737温箱中温箱中45min45min至至1h1hl(5)(5)令盖片浮在令盖片浮在PBSPBS液面液面,用镊子挟出用镊子挟出,PBS,PBS洗，洗，l(6)(6)二级荧光抗体处理二级荧光抗体处理:按按(4)(4)进行进行,漂洗漂洗l(7)(7)封片封片,荧光显微镜下观察。荧光显微镜下观察。第19页，讲稿共46张，创作于星期二第20页，讲稿共46张，创作于星期二l考马斯亮蓝考马斯亮蓝:l(1)(1)支持物盖片培养支持物盖片培养,戊二醛固定戊二醛固定15min

19、,15min,蒸馏水漂洗；蒸馏水漂洗；l(2)(2)考马斯亮蓝液中染色考马斯亮蓝液中染色60min,60min,漂洗；漂洗；l(3)(3)分化分化:置入含甲醇冰醋酸液中置入含甲醇冰醋酸液中,微丝逐渐明显微丝逐渐明显,终止终止;l(4)(4)漂洗，脱水，各度酒精，二甲苯，树胶封片。漂洗，脱水，各度酒精，二甲苯，树胶封片。l细胞内微丝呈蓝色细胞内微丝呈蓝色,如分化较好时背地清亮如分化较好时背地清亮,反之会影响反之会影响微丝的清晰度。微丝的清晰度。第21页，讲稿共46张，创作于星期二五、组织培养细胞的生长和增殖过程l1.1.组织培养细胞生命期：是指细胞在培养中持续组织培养细胞生命期：是指细胞在培养中

20、持续增殖和生长的时间。增殖和生长的时间。l细胞生存过程中经历以下三个阶段：细胞生存过程中经历以下三个阶段：la.a.原代培养期原代培养期:也称初代培养也称初代培养,即从体内取出组织接即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段种培养到第一次传代阶段,一般持续一般持续1-41-4周。此期细周。此期细胞呈活跃的移动胞呈活跃的移动,可见细胞分裂可见细胞分裂,但不旺盛。细胞群但不旺盛。细胞群是异质的是异质的,也即各细胞的遗传性状互不相同也即各细胞的遗传性状互不相同,细胞细胞相互依存性强相互依存性强,由于原代培养细胞和体内细胞性状由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大相似性大,是检测药物很好的实验对象。是检

21、测药物很好的实验对象。第22页，讲稿共46张，创作于星期二lb.b.传代期传代期:初代培养细胞一经传代后便改称做初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长。细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛。并能在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛。并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质，应在初代体细胞系。为保持二倍体细胞性质，应在初代培养期或传代后早期冻存。一般情况下当传代培养期或传代后早期冻存。一般情况下当传代30-5030-50次后，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停次后

22、，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。止，细胞进入第三期。第23页，讲稿共46张，创作于星期二lc.c.衰退期衰退期:此期细胞仍然生存此期细胞仍然生存,但增殖很慢或不增殖但增殖很慢或不增殖;细细胞形态轮廓增强胞形态轮廓增强,最后衰退凋亡。在少数情况下最后衰退凋亡。在少数情况下,以上以上三期任何一点，由子某种因素的影响，细胞可能发生自发三期任何一点，由子某种因素的影响，细胞可能发生自发转化，转化的标志之一是细胞可获得永生性或恶性性。细转化，转化的标志之一是细胞可获得永生性或恶性性。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细

23、胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系。无限细胞系的细胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体性后，核型大多变成异倍体,细胞转化亦可用人工方法诱细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。第24页，讲稿共46张，创作于星期二第25页，讲稿共46张，创作于星期二l2.2.组织培养细胞一代生存期组织培养细胞一代生存期l 所谓细胞所谓细胞“一代一代”一词，系仅指从细胞接种到分一词，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，

24、如某一细胞系为第离再培养时的一段时间，如某一细胞系为第153153代细代细胞，即指该细胞系已传代胞，即指该细胞系已传代153153次。它与细胞世代或倍次。它与细胞世代或倍增不同增不同;在细胞一代中，细胞能倍增在细胞一代中，细胞能倍增3-63-6次。细胞传一代次。细胞传一代后，一般要经过三个阶段。后，一般要经过三个阶段。第26页，讲稿共46张，创作于星期二la.a.潜伏期潜伏期:先经过悬浮期先经过悬浮期,此时细胞胞质回缩此时细胞胞质回缩,胞体呈圆胞体呈圆球形。接着是贴壁球形。接着是贴壁,悬浮期结束。细胞贴附支持物后悬浮期结束。细胞贴附支持物后,除除先经过前述延展过程变成极性细胞先经过前述延展过程

25、变成极性细胞,还要经过一个潜伏还要经过一个潜伏阶段阶段,才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时,可可有运动活动有运动活动,基本无增殖基本无增殖,少见分裂相。初代培养细胞潜少见分裂相。初代培养细胞潜伏期长伏期长,约约24-9624-96小时或更长小时或更长,连续细胞系和肿瘤细胞连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短潜伏期短,仅仅6-246-24小时小时;细胞接种密度大时潜伏期短。细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时,标志细胞已进标志细胞已进入指数增生期。入指数增生期。第27页，讲稿共46张，创作于星期二lb.b.指数增

26、生期指数增生期:细胞分裂相数量可作为判定细胞生长细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数(MI)(MI)表示，即细胞群中每表示，即细胞群中每10001000个细胞中的分裂相数。一个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5%,0.1%-0.5%,初代细胞分裂指初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%-3%-5%(5%(肿瘤细胞偏高肿瘤细胞偏高)。指数增生期是细胞一代中活力。指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实脸最好

27、的和最主要最好的时期，因此是进行各种实脸最好的和最主要的阶段。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期的阶段。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续持续3-53-5天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。减少、最后细胞相互接触汇合成片。第28页，讲稿共46张，创作于星期二第29页，讲稿共46张，创作于星期二lc.c.停滞期停滞期:细胞数量达饱和密度后细胞数量达饱和密度后,细胞停止增殖细胞停止增殖,进入停滞期进入停滞期,此时细胞数量持平此时细胞数量持平,故称平顶期。停滞故称平顶期。停滞期细胞虽不增殖期细胞虽不增殖,但仍有代谢活动但

28、仍有代谢活动,继而培养液中营继而培养液中营养渐趋耗尽养渐趋耗尽,代谢产物积累、代谢产物积累、pHpH降低。此时需传代降低。此时需传代,否则细胞会中毒否则细胞会中毒,发生形态改变发生形态改变,重则从底物脱落死重则从底物脱落死亡亡,故传代应越早越好。传代过晚故传代应越早越好。传代过晚(已有中毒迹象已有中毒迹象)能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下,虽进虽进行了传代行了传代,因细胞已受损因细胞已受损,需要恢复需要恢复,至少还要再传至少还要再传1-21-2两代两代,通过换液淘汰掉死细胞和使受损轻微的细胞得通过换液淘汰掉死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后以恢复

29、后,才能再用。才能再用。第30页，讲稿共46张，创作于星期二第31页，讲稿共46张，创作于星期二生长曲线测定：l接种接种2121孔孔/24/24孔板细胞孔板细胞,分分7 7组组,每组每组3 3孔孔,培养一周培养一周(7(7天天),),期间逐日检测一组期间逐日检测一组,计数计数,最后把最后把7 7天中的细胞天中的细胞数值绘成图数值绘成图,即为细胞生长曲线。即为细胞生长曲线。l(1)(1)悬液制备悬液制备 l(2)(2)接种接种l(3)(3)计数检测计数检测 l(4)(4)绘图绘图:用座标图纸绘成生长曲线用座标图纸绘成生长曲线第32页，讲稿共46张，创作于星期二l细胞分裂指数细胞分裂指数(MI):

30、(MI):l待取得逐日分裂相数值后，也可绘成细胞分裂指数曲待取得逐日分裂相数值后，也可绘成细胞分裂指数曲线。注意，细抱分裂指数曲线与生长曲线趋势基本一线。注意，细抱分裂指数曲线与生长曲线趋势基本一致，但不完全相同，如当细胞增长达饱合密度并进入致，但不完全相同，如当细胞增长达饱合密度并进入停止期后，细胞数值很大，而分裂相可完全消失。停止期后，细胞数值很大，而分裂相可完全消失。第33页，讲稿共46张，创作于星期二l接种存活率和克隆形成率接种存活率和克隆形成率:l2-52-5个细胞个细胞/cm/cm2 2被接种到底物上被接种到底物上,贴壁并能存活生长形成细贴壁并能存活生长形成细胞小群的细胞百分数值称

31、接种存活率胞小群的细胞百分数值称接种存活率,用以表示细胞群的用以表示细胞群的活力。由于检测接种存活率时是借观察克隆活力。由于检测接种存活率时是借观察克隆(通常为通常为16-16-5050个细胞个细胞)形成情况形成情况,又因每个克隆都来自一个细胞又因每个克隆都来自一个细胞,因此也因此也称克隆形成率。细胞接种存活率与细胞活力成正比，称克隆形成率。细胞接种存活率与细胞活力成正比，第34页，讲稿共46张，创作于星期二六、培养细胞增殖动力学l1.1.增殖态：增殖态即细胞进行增殖的状态或过程增殖态：增殖态即细胞进行增殖的状态或过程;细胞增殖或自我复制的手段为细胞有丝分裂。细胞细胞增殖或自我复制的手段为细胞

32、有丝分裂。细胞增殖的基本条件或前提为细胞质和细胞核的复制增殖的基本条件或前提为细胞质和细胞核的复制;两两者是正常细胞增殖过程缺一不可的前提。只有在两者者是正常细胞增殖过程缺一不可的前提。只有在两者完成后，细胞才能发生分裂完成后，细胞才能发生分裂;而细胞有丝分裂所完成而细胞有丝分裂所完成的主要是细胞质和细胞核的分配。以上三个基本过的主要是细胞质和细胞核的分配。以上三个基本过程是细胞增殖态主要的活动，三个过程有阶段性，程是细胞增殖态主要的活动，三个过程有阶段性，又相互依存。又相互依存。第35页，讲稿共46张，创作于星期二la.Ga.G1 1期期:细胞分裂后期细胞分裂后期,或或DNADNA合成前期合

33、成前期,G,G1 1期是细胞质复期是细胞质复制的主要阶段制的主要阶段,细胞进入细胞进入G G1 1期标志细胞已进入增殖态。上期标志细胞已进入增殖态。上一次细胞分裂后所形成的子细胞是否能进入一次细胞分裂后所形成的子细胞是否能进入G G1 1期期,取决于取决于外源生长因子和其它增殖相关因子的调控。在外源生长因子和其它增殖相关因子的调控。在G G1 1期中期中,接接受外界因子影响的特定阶段受外界因子影响的特定阶段,称调节点。培养细胞属称调节点。培养细胞属旺盛增殖细胞群体旺盛增殖细胞群体,一般具有较短的一般具有较短的G G1 1期期,衰退细胞持衰退细胞持续时间长。续时间长。G G1 1期主要为细胞内的

34、蛋白质合成、期主要为细胞内的蛋白质合成、RNARNA合成、合成、多聚核蛋白体合成增多等多聚核蛋白体合成增多等;G;G1 1期胞体逐渐增大期胞体逐渐增大,是镜下唯是镜下唯一可感知的变化。一可感知的变化。第36页，讲稿共46张，创作于星期二lb.Sb.S期：即期：即DNADNA合成期合成期,主要机能活动为进行主要机能活动为进行DNADNA合成。各种细胞合成。各种细胞DNADNA合成持续时间差别不大合成持续时间差别不大,比比较恒定较恒定,平均平均6-8h,6-8h,除用抑制除用抑制DNADNA合成药物如合成药物如5-5-氟尿氟尿嘧啶等外嘧啶等外,细胞一旦进入细胞一旦进入S S期期,DNA,DNA合成

35、过程一经开合成过程一经开始始,大多能持续进行大多能持续进行,独立性较大独立性较大,对环境不利因对环境不利因素有一定耐受能力。但素有一定耐受能力。但DNADNA在进行合成时在进行合成时,多核多核苷酸双链发生分离苷酸双链发生分离,在此阶段在此阶段,易受致突变或致易受致突变或致癌因素作用癌因素作用,DNA,DNA合成期是遗传物质易受致突变物合成期是遗传物质易受致突变物损伤的时期。损伤的时期。第37页，讲稿共46张，创作于星期二lc.Gc.G2 2期期:发生在发生在DNADNA合成后和本次细胞分裂期之前，故合成后和本次细胞分裂期之前，故也称也称DNADNA合成后期或细胞分裂前期。细胞进入合成后期或细胞

36、分裂前期。细胞进入G G2 2期期后，后，DNADNA含量已加倍，具有含量已加倍，具有4 4倍量的倍量的DNADNA。在。在G G2 2期主期主要的变化是与细胞分裂相关的要的变化是与细胞分裂相关的RNARNA的合成和染色质的的合成和染色质的螺旋化。本期持续时间较短，平均螺旋化。本期持续时间较短，平均2-52-5小时。小时。G G2 2期期对外界环境敏感，易受温度、对外界环境敏感，易受温度、pHpH及各种其它因素及各种其它因素的影响而受阻不能进入的影响而受阻不能进入M M期，但不利作用消除后却能期，但不利作用消除后却能很快恢复。很快恢复。第38页，讲稿共46张，创作于星期二ld.Md.M期期:即

37、细胞有丝分裂期，培养细胞分裂仍以有即细胞有丝分裂期，培养细胞分裂仍以有丝分裂方式进行增殖。丝分裂方式进行增殖。M M期结束形成两个子细胞，期结束形成两个子细胞，是细胞增殖周期的终结期。处于分裂中的细胞叫分是细胞增殖周期的终结期。处于分裂中的细胞叫分裂相，在生活状态下可以直接观察到，培养细胞是裂相，在生活状态下可以直接观察到，培养细胞是研究细胞有丝分裂过程理想的对象，细胞分裂过程研究细胞有丝分裂过程理想的对象，细胞分裂过程分前中后末四期，活细胞分裂过程表现如下分前中后末四期，活细胞分裂过程表现如下:第39页，讲稿共46张，创作于星期二l 前期前期:细胞核发生转动可能是前期的开始。当染色细胞核发生

38、转动可能是前期的开始。当染色体在核中出现并愈来愈清楚时体在核中出现并愈来愈清楚时,证明细胞已进入分裂前证明细胞已进入分裂前期。稍后期。稍后,核膜和核仁突然解体消失核膜和核仁突然解体消失,染色体混于细染色体混于细胞质中并呈现活跃的运动。同时从细胞膜表面向外胞质中并呈现活跃的运动。同时从细胞膜表面向外伸出很多长短不等的突起伸出很多长短不等的突起,它们此起彼伏犹如液面它们此起彼伏犹如液面沸腾。此时细胞质逐渐回缩沸腾。此时细胞质逐渐回缩,细胞体趋于变圆细胞体趋于变圆,遂与遂与底物附着面减少底物附着面减少,易脱落入培养液中易脱落入培养液中,染色体由分散状染色体由分散状态渐向细胞中央部移动态渐向细胞中央部

39、移动,然后突然然后突然“冻结冻结”于赤道平于赤道平面面,到此前期结束到此前期结束,中期开始中期开始,前期持续时间前期持续时间20-3020-30分分钟。钟。第40页，讲稿共46张，创作于星期二l中期中期:胞质进一步回缩胞质进一步回缩,胞体呈圆球形胞体呈圆球形,与支持物与支持物附着面缩小达极限。如于此时摇动培养瓶壁附着面缩小达极限。如于此时摇动培养瓶壁,在培养在培养液的冲击下液的冲击下,细胞极易从瓶壁脱落细胞极易从瓶壁脱落,依此可作为收依此可作为收集中期分裂相的简易方法。染色体集中于赤道平集中期分裂相的简易方法。染色体集中于赤道平面后面后,失去明显的运动失去明显的运动,中期染色体集聚在赤道平面中

40、期染色体集聚在赤道平面上称中期板。细胞分裂中期持续上称中期板。细胞分裂中期持续20-3020-30分钟分钟min,min,本本期细胞对外界因素敏感期细胞对外界因素敏感,易受外界因素如秋水仙素易受外界因素如秋水仙素作用发生阻滞、延缓或停止向后期过渡。作用发生阻滞、延缓或停止向后期过渡。第41页，讲稿共46张，创作于星期二l 后期后期:一且中期板染色体开始一分为二，即标一且中期板染色体开始一分为二，即标志后期开始。接着染色体分成两组分别向两极移志后期开始。接着染色体分成两组分别向两极移动，与此同时整个细胞由圆球形逐渐变成椭圆球动，与此同时整个细胞由圆球形逐渐变成椭圆球形形;在赤道部并出现绞窄，胞体

41、呈哑铃形。后期时在赤道部并出现绞窄，胞体呈哑铃形。后期时两组染色体相互分离，是细胞分裂过程中最快的，两组染色体相互分离，是细胞分裂过程中最快的，仅持续仅持续5-75-7分钟，在显微镜下可直接观察到。分钟，在显微镜下可直接观察到。第42页，讲稿共46张，创作于星期二l 末期末期:此时两组染色体已达于两极，胞体中部进此时两组染色体已达于两极，胞体中部进一步变细。继之一切变化与前期相反一步变细。继之一切变化与前期相反;染色体变成染染色体变成染色质、核仁核膜再现、胞体逐渐分离、形成两个子色质、核仁核膜再现、胞体逐渐分离、形成两个子细胞，但两者间仍有细丝相连，经过较长时间后才细胞，但两者间仍有细丝相连，

42、经过较长时间后才彻底分开。两个子细胞独立后，细胞质又复延展附彻底分开。两个子细胞独立后，细胞质又复延展附于底物变扁，整个细胞又恢复成原有状态于底物变扁，整个细胞又恢复成原有状态;末期持续末期持续时间时间20-3020-30分钟。分钟。第43页，讲稿共46张，创作于星期二l2.2.功能态：功能态为细胞进行特定功能活动如分泌、功能态：功能态为细胞进行特定功能活动如分泌、传导、吞噬，收缩等的时期，是细胞的第二种生存状传导、吞噬，收缩等的时期，是细胞的第二种生存状态。细胞完成特定功能是在细胞发生分化基础上完成态。细胞完成特定功能是在细胞发生分化基础上完成的。因此，细胞功能态也是细胞的分化态，功能态存的

43、。因此，细胞功能态也是细胞的分化态，功能态存在于细胞分裂之后，在于细胞分裂之后，G G1 1期前，也即在两次增殖态之间。期前，也即在两次增殖态之间。若从细胞增殖态周期角度看，功能态是两次增殖周若从细胞增殖态周期角度看，功能态是两次增殖周期之间的间期或期之间的间期或G0G0期。细胞的增殖态和功能态是相期。细胞的增殖态和功能态是相对的状态，能发生交替和有相互依存的关系，根据对的状态，能发生交替和有相互依存的关系，根据这两种状态属性的不同，可把细胞分作如下三类这两种状态属性的不同，可把细胞分作如下三类:第44页，讲稿共46张，创作于星期二la.a.活跃增殖细胞活跃增殖细胞:这类细胞是以增殖为主的细胞，它这类细胞是以增殖为主的细胞，它们增殖频繁，具有较短的们增殖频繁，具有较短的G G0 0期，无分化现象。从而它期，无分化现象。从而它们的们的G G0 0期最为符合间期概念，故可称之为期最为符合间期概念，故可称之为G G0i0i 。体内。体内各种干细胞、肿瘤细胞和体外培养细胞均属之，本型各种干细胞、肿瘤细胞和体外培养细胞均属之，本型细胞在体外易于培养，成活率高。细胞在体外易于培养，成活率高。第45页，讲稿共46张，创作于星期二16.09.2022感感谢谢大大家家观观看看第46页，讲稿共46张，创作于星期二