蛋白质的分离纯化 (2)精选PPT.ppt

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1、关于蛋白质的分离纯化(2)第1页，讲稿共132张，创作于星期三 研究蛋白质的结构、性质和活性蛋白质研究蛋白质的结构、性质和活性蛋白质的功能，首先需要得到纯的、没有变性的功能，首先需要得到纯的、没有变性的蛋白质样品。的蛋白质样品。分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括：蛋白质之间各种特性的差异，包括：1.分子的大小和形状、分子的大小和形状、2.酸碱性质、酸碱性质、3.溶解度、溶解度、4.吸附性质吸附性质5.对配体分子的特异生物学亲和力。对配体分子的特异生物学亲和力。第2页，讲稿共132张，创作于星期三第一节第一节 蛋白质的酸碱性质蛋

2、白质的酸碱性质 第3页，讲稿共132张，创作于星期三 蛋白质的等电点蛋白质的等电点n蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分子中保留蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分子中保留着游离的末端着游离的末端氨基和氨基和羧基以及侧链上的各种羧基以及侧链上的各种功能团。功能团。蛋白质也是一类两性电解质蛋白质也是一类两性电解质，能和酸或碱，能和酸或碱发生作用。可解离基团主要来自侧链上的功能团发生作用。可解离基团主要来自侧链上的功能团.n对某一种蛋白质来说，在某一对某一种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正电荷，它所带的正电荷与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一pH称为称为蛋白

3、质的等电点蛋白质的等电点（与蛋白质所含氨基酸种类有关）。（与蛋白质所含氨基酸种类有关）。n蛋白质的蛋白质的等离子点等离子点是特征常数是特征常数第4页，讲稿共132张，创作于星期三 蛋白质的蛋白质的电泳电泳n在等电点时在等电点时(Isoelectric point pI)(Isoelectric point pI)，蛋白，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。质的溶解度最小，在电场中不移动。n在不同的在不同的pHpH环境下，蛋白质的电学性质不同。环境下，蛋白质的电学性质不同。在大于等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电在大于等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在小于等电点的荷，在电场

4、中向正极移动；在小于等电点的溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为负极移动。这种现象称为蛋白质电泳蛋白质电泳(ElectrophoresisElectrophoresis)。第5页，讲稿共132张，创作于星期三电泳电泳n利用蛋白质利用蛋白质的电泳现象，的电泳现象，可以将蛋白可以将蛋白质进行分离质进行分离纯化。纯化。第6页，讲稿共132张，创作于星期三第二节第二节 蛋白质分子大小的测蛋白质分子大小的测定定第7页，讲稿共132张，创作于星期三常用测定方法：常用测定方法：1、根据化学组成测定最低相对分子质量、根据化学组成测定最低相对分子质量

5、2、凝胶过滤法测定相对分子质量、凝胶过滤法测定相对分子质量3、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量质量4、渗透压法、渗透压法5、沉降分析法（离心）、沉降分析法（离心）第8页，讲稿共132张，创作于星期三一、根据化学组成测定最低相对分子质量一、根据化学组成测定最低相对分子质量 用用化化学学分分析析方方法法测测定定出出蛋蛋白白质质中中某某一一微微量量元元素素的的含含量量，并并假假设设蛋蛋白白质质分分子子中中只只有有一一个个铁铁原原子子。则则可可以以由由此此计计算算出出蛋蛋白白质的最低相对分子质量。质的最低相对分子质量。例例如如，肌肌红红蛋蛋白白含含铁铁量量为为

6、0.335，其其最最低低相对分子质量可按下式算出：相对分子质量可按下式算出：最最低低相相对对分分子子质质量量=（铁铁的的原原子子量量/铁铁的的百百分分含含量量）X 100=（55.8/0.335）X100=16700第9页，讲稿共132张，创作于星期三二、凝胶过滤法测定相对分子质量二、凝胶过滤法测定相对分子质量n凝胶过滤原理凝胶过滤原理第10页，讲稿共132张，创作于星期三第11页，讲稿共132张，创作于星期三分子筛色谱分子筛色谱（凝胶过滤）（凝胶过滤）第12页，讲稿共132张，创作于星期三利用利用Andrews的实验经验式：的实验经验式：logMr=a/bVe/bVoVe（elution v

7、olume）为为某某一一溶溶质质组组分分的的洗洗脱脱体体积积。它它是是自自加加样样品品开开始始到到该该组组分分的的洗洗脱脱峰峰（峰顶）出现时所流出的体积。（峰顶）出现时所流出的体积。V0(outer volume)为外水体积，即存在于柱床为外水体积，即存在于柱床中凝胶珠外孔隙的水相体积。测定出不能被中凝胶珠外孔隙的水相体积。测定出不能被凝胶滞留的大分子溶质如蓝色葡聚糖凝胶滞留的大分子溶质如蓝色葡聚糖2000的洗脱体积可以决定的洗脱体积可以决定V0。第13页，讲稿共132张，创作于星期三logMr第14页，讲稿共132张，创作于星期三三、三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分

8、子质量法测定相对分子质量 聚丙烯酰胺凝胶电泳，（简称聚丙烯酰胺凝胶电泳，（简称PAGE），也称），也称圆盘电泳，它以聚丙烯酰胺凝胶（单体丙烯圆盘电泳，它以聚丙烯酰胺凝胶（单体丙烯酰胺酰胺Arc和交联剂甲叉双丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺Bis共聚而共聚而成）为支持物成）为支持物。蛋白质颗粒在各种介质中电泳时，它的迁移率蛋白质颗粒在各种介质中电泳时，它的迁移率决定于它所带的决定于它所带的电荷以及分子大小和形状电荷以及分子大小和形状(电电荷效应、分子筛效应荷效应、分子筛效应)。第15页，讲稿共132张，创作于星期三 如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂

9、十二烷基硫酸钠剂十二烷基硫酸钠(SDS)(SDS)和少量巯基乙醇，单体蛋和少量巯基乙醇，单体蛋白质或亚基的多肽链处于伸展状态，此时白质或亚基的多肽链处于伸展状态，此时SDSSDS以其以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合体。烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合体。结果：结果：1 1、所有的所有的SDS-SDS-蛋白质复合体都具有相同的荷质蛋白质复合体都具有相同的荷质比。比。2 2、具有相同的构象。因此蛋白质分子的电泳迁具有相同的构象。因此蛋白质分子的电泳迁移率主要移率主要取决于它的相对分子质量，而与原来所带取决于它的相对分子质量，而与原来所带的电荷和分子形状无关。的电荷和分子形状无关。第16页，讲稿

10、共132张，创作于星期三十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠原态蛋白质变性？磺酸基磺酸基 极性亲水极性亲水烷基烷基 亲油亲油（蛋白质疏水区）（蛋白质疏水区）第17页，讲稿共132张，创作于星期三 在在聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶中中由由于于引引入入凝凝胶胶的的分分子子筛筛效效应应，电电泳泳迁迁移移率率与与多多肽肽链链分分子子量量的的对对数数有有下下列关系：列关系：log Mr=abR式式中中Mr为为相相对对分分子子质质量量，a、b都都是是常常数数，R是相对迁移率：是相对迁移率：R=样品迁移距离样品迁移距离/前沿（染料）迁移距离前沿（染料）迁移距离第18页，讲稿共132张，创作于星期三第19页，讲稿共1

11、32张，创作于星期三 实验测定时，以几种相对分子实验测定时，以几种相对分子质量标准物蛋白质的质量标准物蛋白质的Mr的对数值的对数值对其对其R值作图，根据待测样品的值作图，根据待测样品的R,从标准曲线上查出它的从标准曲线上查出它的Mr。第20页，讲稿共132张，创作于星期三最准确可靠的方法是最准确可靠的方法是超离心法超离心法（Svedberg于于1940年设计）：蛋白质颗粒在年设计）：蛋白质颗粒在2550*104 g离心力离心力作用下从溶液中沉降下来。作用下从溶液中沉降下来。沉降系数（沉降系数（s）：）：单位（单位（cm）离心场里的沉降速度。）离心场里的沉降速度。s=v2x v=沉降速度（沉降速

12、度（dx/dt）=离心机转子角速度（弧度离心机转子角速度（弧度/s）x=蛋白质界面中点与转子中心的距蛋白质界面中点与转子中心的距离（离（cm）沉降系数的单位常用沉降系数的单位常用S，1S=110-13（s）第21页，讲稿共132张，创作于星期三蛋白质分子量（蛋白质分子量（M）与沉降系数（）与沉降系数（s）的关系）的关系M=RTsD（1V）R气体常数（气体常数（8.314107ergsmol-1 度度-1）T绝对温度绝对温度D扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机转速很快，则忽略不计）转速很快，则忽略不计）V蛋白质的微分比容（蛋白质的微分比容（m3g-1）溶剂密度（

13、溶剂密度（20，gml-1）s沉降系数沉降系数第22页，讲稿共132张，创作于星期三第三节第三节 蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀与蛋白质的沉淀第23页，讲稿共132张，创作于星期三一、蛋白质的胶体性质一、蛋白质的胶体性质 蛋白质溶液是一种分散系统。蛋白质分子颗粒蛋白质溶液是一种分散系统。蛋白质分子颗粒是分散相，水是分散介质。就其分散程度而言是分散相，水是分散介质。就其分散程度而言蛋白质溶液蛋白质溶液属于胶体系统。属于胶体系统。分散相质点在分散相质点在胶体系统中保持稳定应具备三个胶体系统中保持稳定应具备三个条件：条件：第24页，讲稿共132张，创作于星期三A A、分散相的质点大小

14、在分散相的质点大小在1-100nm1-100nm范围内。范围内。动力学上稳定，能作不断的布朗运动。动力学上稳定，能作不断的布朗运动。真溶液（真溶液（1nm1nm）胶体溶液胶体溶液 悬浮液悬浮液(100nm(100nm）B B、分散相的质点带有同种电荷，互相排斥，分散相的质点带有同种电荷，互相排斥，不易聚集成大颗粒而沉淀。不易聚集成大颗粒而沉淀。C C、分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层（如水化层）（如水化层）第25页，讲稿共132张，创作于星期三蛋白质蛋白质溶液性质：溶液性质：1 1、蛋白质分子颗粒在、蛋白质分子颗粒在1-100nm1-100nm范围内范围内。2、

15、形形成成水水化化层层：分分子子表表面面上上亲亲水水基基团团在在水水溶液中能与水分子起水化作用溶液中能与水分子起水化作用3、构构成成稳稳定定的的双双电电层层：分分子子表表面面上上的的可可解解离离基基团团，在在适适当当的的pH条条件件下下，都都带带有有相相同同的的净净电电荷荷，与与其其周周围围的的反反离离子子构构成成稳稳定的双电层。定的双电层。第26页，讲稿共132张，创作于星期三+-+第27页，讲稿共132张，创作于星期三4、蛋白质溶液也和一般的胶体系统一样、蛋白质溶液也和一般的胶体系统一样具有具有丁达尔效应、布朗运动以及不能丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜通过半透膜等性质等性质 由于胶体

16、溶液中的蛋白质不能通过半透由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用膜，因此可以应用透析法透析法将非蛋白的小分子将非蛋白的小分子杂质除去。杂质除去。第28页，讲稿共132张，创作于星期三二、蛋白质的沉淀二、蛋白质的沉淀 蛋白质在溶液中的稳定性蛋白质在溶液中的稳定性与它的分子与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关，量大小、所带的电荷和水化作用有关，是有条件的、相对的。如果条件发生改是有条件的、相对的。如果条件发生改变，破坏了蛋白质溶液的稳定性，蛋白变，破坏了蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。质就会从溶液中沉淀出来。第29页，讲稿共132张，创作于星期三n在温和条件下，通

17、过改变溶液的在温和条件下，通过改变溶液的pHpH或电荷或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。n在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。n可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。法等。可逆沉淀可逆沉淀第30页，讲稿共132张，创作于星期三n在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白

18、质胶在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。重新溶解于水。n由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。变化，所以又称为变性沉淀。n如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱试剂沉淀等都属于不可逆沉淀和生物碱试剂沉淀等都属于不可逆沉淀。淀。不可逆沉淀不可逆沉淀第31页，讲稿共132张，创作于星期三沉淀蛋白质的方法有以下几种：沉淀蛋白质的方法有以下几种

19、：(1)盐析法盐析法：向蛋白质溶液中加人大量的向蛋白质溶液中加人大量的中性盐中性盐(硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等)，使蛋，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐析沉淀一白质脱去水化层而聚集沉淀。盐析沉淀一般不引起蛋白质变性。当除去盐后，又可般不引起蛋白质变性。当除去盐后，又可溶解。溶解。第32页，讲稿共132张，创作于星期三 (2)有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 极极性性有有机机溶溶剂剂(甲甲醇醇、乙乙醇醇或或丙丙酮酮等等)，因因引引起起蛋蛋白白质质脱脱去去水水化化层层以以及及降降低低介介电电常常数数而而增增加加带带电电质质点点间间的的相相互互作作用用，致致使使蛋蛋白白质质颗粒容易

20、凝集而沉淀。颗粒容易凝集而沉淀。第33页，讲稿共132张，创作于星期三(3)重金属盐沉淀法重金属盐沉淀法(4)生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂和某些酸类沉淀法 (5)加热变性沉淀法加热变性沉淀法 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。原几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。原因可能是由于热变性是蛋白质天然结构解体，因可能是由于热变性是蛋白质天然结构解体，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由于疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破坏了带电状态（当处蛋白质处于等电点也破坏了带电状态（当处于等电点时）。于等电点时）。第34页，讲稿共132张，创作于星期三 少量盐类促进蛋白质的加热

21、凝固。少量盐类促进蛋白质的加热凝固。（豆腐）我国很早就创造了将大豆蛋（豆腐）我国很早就创造了将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入少量盐卤白质的浓溶液加热并点入少量盐卤(含含MgCl2)的制豆腐的方法，这是成功的的制豆腐的方法，这是成功的应用加热变性沉淀蛋白质的一个例子。应用加热变性沉淀蛋白质的一个例子。第35页，讲稿共132张，创作于星期三n点卤时，由于盐卤是电解质，它们在水里会分成许多带电的点卤时，由于盐卤是电解质，它们在水里会分成许多带电的小颗粒小颗粒正离子与负离子，由于这些离子的水化作用而正离子与负离子，由于这些离子的水化作用而夺取了蛋白质的水膜，以致没有足够的水来溶解蛋白质。夺取了蛋白质的水

22、膜，以致没有足够的水来溶解蛋白质。另外，盐的正负离子抑制了由于蛋白质表面所带电荷而引另外，盐的正负离子抑制了由于蛋白质表面所带电荷而引起的斥力，这样使蛋白质的溶解度降低，而颗粒相互凝聚起的斥力，这样使蛋白质的溶解度降低，而颗粒相互凝聚成沉淀。这时，豆浆里就出现了许多白花花的东西了。成沉淀。这时，豆浆里就出现了许多白花花的东西了。盐卤里有许多电解质，主要是钙、镁等金属离子，它们会盐卤里有许多电解质，主要是钙、镁等金属离子，它们会使人体内的蛋白质凝固，所以人如果多喝了盐卤，就会有使人体内的蛋白质凝固，所以人如果多喝了盐卤，就会有生命危险。生命危险。第36页，讲稿共132张，创作于星期三第四节第四节

23、 蛋白质分离纯化的蛋白质分离纯化的一般原则一般原则第37页，讲稿共132张，创作于星期三 分离纯化某一特定蛋白质的一分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为：般程序可以分为：1、前处理、前处理 2、粗分级、粗分级分离分离 3、细分级、细分级分离分离 第38页，讲稿共132张，创作于星期三1、前处理前处理(pretreatment)n分分离离纯纯化化某某一一蛋蛋白白质质，首首先先要要求求把把蛋蛋白白质质从从原原来来的的组组织织或或细细胞胞中中以以溶溶解解的的状状态态释释放放出出来来，并并保保持持原原来来的天然状态，不丢失生物活性。的天然状态，不丢失生物活性。n动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织，

24、动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织，n种种子子材材料料应应先先去去壳壳甚甚至至去去种种皮皮以以免免受受杂杂质质的的污污染染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。n然然后后根根据据不不同同的的情情况况，选选择择适适当当的的方方法法，将将组组织织和细胞破碎。和细胞破碎。第39页，讲稿共132张，创作于星期三n动动物物组组织织和和细细胞胞可可用用电电动动捣捣碎碎机机或或匀匀浆浆器器破破碎碎或或用用超声波超声波处理破碎。处理破碎。n植植物物组组织织和和细细胞胞，由由于于具具有有由由纤纤维维素素、半半纤纤维维素素和和果果胶胶等等物物质质组组成成的的

25、细细胞胞壁壁，一一般般需需要要用用与与石石英英砂砂或或玻玻璃璃粉粉和和适适当当的的提提取取液液一一起起研研磨磨的的方方法法破破碎碎，液液氮氮破碎或用破碎或用纤维素酶纤维素酶处理也能达到目的。处理也能达到目的。n细菌细菌细胞的破碎的常用方法有细胞的破碎的常用方法有超声波超声波震荡，与砂震荡，与砂研研磨磨、高压挤压高压挤压或或溶菌酶溶菌酶处理处理(以分解肽聚糖以分解肽聚糖)等。等。n组织和细胞破碎以后，选择适当的组织和细胞破碎以后，选择适当的缓冲液缓冲液把所要的把所要的蛋白质提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过蛋白质提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤等方法除去。滤等方法除去。第40页，讲稿共1

26、32张，创作于星期三n如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等，则可胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等，则可利用差速离心方法将它们分开利用差速离心方法将它们分开如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的，如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当的介质提取。当的介质提取。第41页，讲稿共132张，创作于星期三2、粗分级分离粗分级分离(rough fractionation)n当当蛋蛋白白质质提提取取液液

27、(有有时时还还杂杂有有核核酸酸、多多糖糖之之类类)获获得得后后，选选用用一一套套适适当当的的方方法法，将将所所要要的的蛋蛋白白质质与与其其他他杂杂蛋白分离开来。蛋白分离开来。n一一般般这这一一步步的的分分级级分分离离用用盐盐析析、等等电电点点沉沉淀淀和和有有机机溶溶剂剂分分级级分分离离等等方方法法。这这些些方方法法的的特特点点是是简简便便、处处理理量量大大，既既能能除除去去大大量量杂杂质质(包包括括脱脱盐盐)，又又能能浓浓缩缩蛋白质溶液。蛋白质溶液。n有有些些蛋蛋白白质质提提取取液液体体积积较较大大，又又不不适适于于用用沉沉淀淀或或盐盐析析法法浓浓缩缩，则则可可采采用用超超过过滤滤、冷冷冻冻真

28、真空空干干燥燥或或其其他方法他方法(如如聚乙二醇聚乙二醇浓缩法浓缩法)进行浓缩。进行浓缩。第42页，讲稿共132张，创作于星期三3、细分级分离细分级分离(fine fractionation)进一步纯化，一般使用进一步纯化，一般使用层析法层析法包括凝胶包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择和层析等。必要时还可选择电泳法电泳法，包，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。模较小，但分辨率很高。第43页，讲稿共132张

29、，创作于星期三4、结晶结晶 n结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，蛋白质纯度结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。尽管结晶并不能保证愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。尽管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但只有某种蛋白质在溶液中数蛋白质一定是均一的，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。量上占优势时才能形成结晶。n由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标力指标。n结晶也是进行结晶也是进行X射

30、线晶体学分析所要求的，结晶的最射线晶体学分析所要求的，结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态，此时较易得到结佳条件是使溶液略处于过饱和状态，此时较易得到结晶。接入晶种常能加速结晶过程。晶。接入晶种常能加速结晶过程。第44页，讲稿共132张，创作于星期三 第五节第五节 蛋白质的分离纯化方法蛋白质的分离纯化方法 第45页，讲稿共132张，创作于星期三几种常用的蛋白质纯化方法：几种常用的蛋白质纯化方法：根据蛋白质在溶液中的性质分离纯化蛋白根据蛋白质在溶液中的性质分离纯化蛋白质的方法：质的方法：分子大小；分子大小；溶解度；溶解度；电荷；电荷；吸附性质；吸附性质；对配体分子的生物学亲和力等。对配体分子的

31、生物学亲和力等。第46页，讲稿共132张，创作于星期三一、根据分子大小不同的纯化方法一、根据分子大小不同的纯化方法 n1透析和超过滤透析和超过滤 透析透析(dialysis)是利是利用蛋白质分子不能用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、分子物质如无机盐、单糖等分开。常用单糖等分开。常用的半透膜是玻璃纸的半透膜是玻璃纸和其他改型的纤维和其他改型的纤维素材料。素材料。第47页，讲稿共132张，创作于星期三 超滤超滤是利用压是利用压力或离心力，强行力或离心力，强行使水和其他小分子使水和其他小分子溶质通过半透膜，溶质通过半透膜，而蛋白质被

32、截留在而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。和脱盐的目的。第48页，讲稿共132张，创作于星期三2密度梯度密度梯度(区带区带)离心离心 n蛋白质颗粒在具有密度梯度蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成独立质在离心管中被分离成独立的区带，的区带，第49页，讲稿共132张，创作于星期三

33、密度梯度密度梯度n常用的密度梯度有蔗糖梯常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度。度，聚蔗糖梯度。n蔗糖便宜，纯度高，浓溶液蔗糖便宜，纯度高，浓溶液(60，WW)密度可达密度可达1.28 gcm3。n聚蔗糖的商品名是聚蔗糖的商品名是Ficoll，它是由蔗糖和，它是由蔗糖和1氯氯2，3环氧丙烷合成的高聚环氧丙烷合成的高聚物，物，Mr约约400 000。n密度梯度在离心管内的分布密度梯度在离心管内的分布是管底的密度最大，向上逐是管底的密度最大，向上逐渐减小渐减小 第50页，讲稿共132张，创作于星期三3凝胶过滤层析凝胶过滤层析 (分子排阻分子排阻)n（1）凝胶过滤的介质）凝胶过滤的介质 n凝胶过滤所用

34、的介质是凝胶颗粒，其内部是多孔的网状结构，第51页，讲稿共132张，创作于星期三第52页，讲稿共132张，创作于星期三经常使用的凝胶种类经常使用的凝胶种类：n（1）葡聚糖凝胶，）葡聚糖凝胶，是由线形的是由线形的1，6葡聚糖与葡聚糖与1氯氯2，3葡聚糖葡聚糖环氧环氧丙烷反应而成的化合物，它的商品名称丙烷反应而成的化合物，它的商品名称为为Sephadex。不同型号的。不同型号的Sephadex 用用G来表示。来表示。G后面的数字后面的数字-10、200表示吸表示吸水量为水量为1、20克克/克干胶。如克干胶。如Sephadex G-100第53页，讲稿共132张，创作于星期三交联葡聚糖凝胶的种类有交

35、联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和，和G-200。因此，。因此，“G”反映凝反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。交联度越高，凝胶孔径越小。交联度越高，凝胶孔径越小。第54页，讲稿共132张，创作于星期三G10G10、1515、2525 分离范围分离范围5000 5000 适用于脱适用于脱盐、肽与其它小分子的分离，胶柱长要盐、肽与其它小分子的分离，胶柱长要求求15-2515-25厘米。厘米。G-50 G-50 分离范围分离范围 1500-30000 1500-30000 G-75 G-75 分离范

36、围分离范围 3000-80000 3000-80000 G-100 G-100 分离范围分离范围 4000-1500004000-150000G-200 G-200 分离范围分离范围 5000-6000005000-600000适用于各类生物分子的分离，胶柱长要求适用于各类生物分子的分离，胶柱长要求8080厘米以上。厘米以上。第55页，讲稿共132张，创作于星期三n（2）聚丙烯酰胺凝胶）聚丙烯酰胺凝胶(商品名称商品名称为为Bio-gel P)是一种人工合成的凝胶，它是一种人工合成的凝胶，它是由单体丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双和交联剂甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺(Bis)共聚而成的

37、。不同型号的共聚而成的。不同型号的Bio-gel 用用P来表示。来表示。P后面的数字再乘后面的数字再乘以以1000为该型号的排阻极限，表示当某为该型号的排阻极限，表示当某一物质的分子量大于或等于某一值时，一物质的分子量大于或等于某一值时，完全不进入凝胶。完全不进入凝胶。如如Bio-gel P-60 第56页，讲稿共132张，创作于星期三（3）琼脂糖凝胶）琼脂糖凝胶 商品名称为商品名称为Sepharose或或Bio-Gel A，琼脂糖是从，琼脂糖是从琼脂中分离制得的，这种凝胶的优点是琼脂中分离制得的，这种凝胶的优点是孔径大，排阻极限高。不同型号的孔径大，排阻极限高。不同型号的Sepharose

38、用用B来表示。来表示。B前面的数前面的数字表示凝胶中含干胶的量，如字表示凝胶中含干胶的量，如 Sepharose 6B第57页，讲稿共132张，创作于星期三二、利用溶解度差别的纯化方法二、利用溶解度差别的纯化方法 影响蛋白质溶解度有：影响蛋白质溶解度有：n自身因素：自身因素：在同一的外部条件下，不同蛋白质具有在同一的外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度，这是因为溶解度归根结底不同的溶解度，这是因为溶解度归根结底取决于它取决于它们本身的分子结构们本身的分子结构，例如分子所带电荷的性质和数，例如分子所带电荷的性质和数量、亲水基团与疏水基团的比例，它们在蛋白质分量、亲水基团与疏水基团的比例，它们在

39、蛋白质分子表面的排列以及由此而产生的偶极矩等。子表面的排列以及由此而产生的偶极矩等。n外部因素：外部因素：很多，其中主要有：很多，其中主要有：溶液的溶液的pH，离离子强度，子强度，介电常数，介电常数，温度温度。第58页，讲稿共132张，创作于星期三1.pH控制蛋白质的沉淀控制蛋白质的沉淀n蛋白质处于等电点时，其静电荷为零，蛋白质处于等电点时，其静电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。而趋于聚集沉淀。n不同的蛋白质具有不同的等电点，利用不同的蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，可以

40、把蛋白质混合物分开。可以把蛋白质混合物分开。第59页，讲稿共132张，创作于星期三2.蛋白质的盐溶和盐析蛋白质的盐溶和盐析 盐溶：盐溶：低浓度时，中性盐可以增加蛋白低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶质的溶解度，这种现象称为盐溶。第60页，讲稿共132张，创作于星期三由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度增水分子间的相互作用却加强，因而溶解度增高高盐溶盐溶第61页，讲稿共132张，创作于星期三 盐析：盐析：当溶液的离子强度增加

41、到一定数值当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质溶解度开始下降。当离子强度时，蛋白质溶解度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和的程增加到足够高时，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析（这种现象称为盐析（salting out）。）。第62页，讲稿共132张，创作于星期三大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。导致蛋白质表甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。导致蛋白质表面的疏水基团的暴露面的疏水基团的暴露

42、盐析盐析（NH4）2SO4 、Na2SO4）第63页，讲稿共132张，创作于星期三3有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法 与水互溶的有机溶剂与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇和丙如甲醇、乙醇和丙酮等酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下，这些有机溶剂不仅能引低。在室温下，这些有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。第64页，讲稿共132张，创作于星期三有机溶剂分级分离的有机溶剂分级分离的机理机理n有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质改变了介质的介电常数的介电常数。水是高介

43、电常数物质。水是高介电常数物质(20时，时，80)，有机溶，有机溶剂是低介电常数物质剂是低介电常数物质(20时，甲醇时，甲醇33，乙醇，乙醇24，丙酮，丙酮21.4)，因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。这样，蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，这样，蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。n有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与与盐析相似，盐析相似，与蛋白质直接争夺水化水，致使蛋白质聚集而沉淀。与蛋

44、白质直接争夺水化水，致使蛋白质聚集而沉淀。第65页，讲稿共132张，创作于星期三4温度对蛋白质溶解度的影响温度对蛋白质溶解度的影响 n在一定温度范围内，约在一定温度范围内，约040之间，大之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，增加，n在在4050以上，大部分蛋白质变得不以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，一般在中性稳定并开始变性，一般在中性pH介质中介质中即失去溶解能力。即失去溶解能力。n大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在蛋白质的分级分离操作一般都在0或更或更低的温度下进行。低的温度下

45、进行。第66页，讲稿共132张，创作于星期三三、根据电荷不同的纯化方法三、根据电荷不同的纯化方法 n根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法有混合物的方法有电泳电泳和和离子交换层析离子交换层析两类两类 n一一.电泳电泳(electrophoresis)n在外电场的作用下，带电颗粒，向着与其电性相反的电在外电场的作用下，带电颗粒，向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。极移动，这种现象称为电泳。n蛋白质蛋白质电泳电泳分离原理分离原理：分子大小不同的蛋白质所带电分子大小不同的蛋白质所带电种类不同，净电荷密度不同，迁移率不同，因此，在

46、种类不同，净电荷密度不同，迁移率不同，因此，在电泳时可以分开。电泳时可以分开。第67页，讲稿共132张，创作于星期三1、电泳的类型、电泳的类型 目前电泳的目前电泳的类型很多，类型很多，最常见的是最常见的是区带电泳区带电泳，由于在支持由于在支持物上电泳时物上电泳时蛋白质混合蛋白质混合物被分离成物被分离成若干区带而若干区带而得名。得名。第68页，讲稿共132张，创作于星期三n区带电泳按其支持物的物理性状不同可区带电泳按其支持物的物理性状不同可以分成以分成4类：类：n 滤纸电泳和薄膜电泳滤纸电泳和薄膜电泳(如醋酸纤维薄膜如醋酸纤维薄膜电泳和聚酰胺薄膜电泳电泳和聚酰胺薄膜电泳)；n 粉末电泳，粉末电泳

47、，支持介质是淀粉、纤维素支持介质是淀粉、纤维素粉或硅胶粉等，粉末与适当的溶剂调和，粉或硅胶粉等，粉末与适当的溶剂调和，铺设成平板；铺设成平板；第69页，讲稿共132张，创作于星期三n 细丝电泳，细丝电泳，如尼龙丝和其他人造丝电如尼龙丝和其他人造丝电泳，这是一类微量电泳；泳，这是一类微量电泳；n 凝胶电泳，凝胶电泳，最常用的支持介质有最常用的支持介质有聚丙聚丙烯酰胺烯酰胺和和琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶，前者适于分离蛋，前者适于分离蛋白质和多核苷酸，后者适于分离核酸，白质和多核苷酸，后者适于分离核酸，这两种凝胶电泳的分辨率都很高，这两种凝胶电泳的分辨率都很高，-+第70页，讲稿共132张，创作于星期三第

48、71页，讲稿共132张，创作于星期三2、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylaminde gel electrophoresis，简称，简称PAGE)n也称圆盘电泳，它是在区带电泳的基础上发展起也称圆盘电泳，它是在区带电泳的基础上发展起来的。它以聚丙烯酰胺凝胶为支持物来的。它以聚丙烯酰胺凝胶为支持物,一般一般制作成制作成凝凝胶柱或凝胶板，胶柱或凝胶板，第72页，讲稿共132张，创作于星期三第73页，讲稿共132张，创作于星期三垂直板电泳的优越性：垂直板电泳的优越性：表面积大而薄，便于通冷却水以降低热效应，表面积大而薄，便于通冷却水以降低热效应，条带更清晰；条带更清晰；在同一

49、块胶板上，可同时进行在同一块胶板上，可同时进行10个以上样品的个以上样品的 电泳，便于在同一条件下比较分析鉴定，还可电泳，便于在同一条件下比较分析鉴定，还可 用于印迹转移电泳及放射自显影；用于印迹转移电泳及放射自显影；胶板制作方便，易剥离，样品用量少，分辨率胶板制作方便，易剥离，样品用量少，分辨率 高，不仅可用于分析，可用于制备；高，不仅可用于分析，可用于制备；胶板薄而透明，电泳染色后可制成干板，便于胶板薄而透明，电泳染色后可制成干板，便于 长期保存与扫描；长期保存与扫描；可进行双向电泳。可进行双向电泳。第74页，讲稿共132张，创作于星期三按其凝胶的组成系统可分成四种：按其凝胶的组成系统可分

50、成四种：(1)连连续续凝凝胶胶电电泳泳：只只用用一一层层凝凝胶胶，采采用用相相同同的的pH值值和相同的缓冲液。和相同的缓冲液。(2)不不连连续续凝凝胶胶电电泳泳：采采用用二二层层或或三三层层性性质质不不同同的的凝凝胶胶(即即：样样品品胶胶、浓浓缩缩胶胶和和分分离离胶胶)重重叠叠起起来来，使使用用两两种种不不同同的的pH值值（6.7和和8.3）和和不不同同的的缓缓冲冲液液（Tris-HCl和和Tris-Gly）(3)孔孔梯梯度度凝凝胶胶电电泳泳：采采用用梯梯度度混混合合装装置置，使使制制得得的的凝凝胶胶由由上上至至下下孔孔径径逐逐渐渐减减小小(即即凝凝胶胶浓浓度度由由上上至至下下逐逐渐渐增增高高