蛋白质和多肽的氨基酸序列分析精选PPT.ppt

《蛋白质和多肽的氨基酸序列分析精选PPT.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质和多肽的氨基酸序列分析精选PPT.ppt（130页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、关于蛋白关于蛋白质和多和多肽的氨基酸序的氨基酸序列分析列分析第1页，讲稿共130张，创作于星期三引言引言氨基酸是一种小分子的两性化合物，分子量在75200Da之间，其化学通式为：在生物体内出现的氨基酸都是L型，仅在少数微生物来源的多肽中出现D型氨基酸。第2页，讲稿共130张，创作于星期三蛋白质和多肽是由蛋白质和多肽是由2020种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长链，然后通过链内、链间的离子键、疏水作用等接成一长链，然后通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠卷曲形成一定的构象并发挥其独特作多种作用力进行折叠卷曲形成一定的构象并发挥其独特作用。氨基

2、酸的排列顺序即用。氨基酸的排列顺序即蛋白质的一级结构决定了蛋白质蛋白质的一级结构决定了蛋白质的高级结构及功能的高级结构及功能。因此，分析蛋白质的氨基酸序列是进行蛋白质结构功能研究中不可缺少的部分。引言引言第3页，讲稿共130张，创作于星期三蛋白质测序的研究历史蛋白质测序的研究历史19471947采用部分水解的方法试图测定蛋白采用部分水解的方法试图测定蛋白质的氨基酸序列质的氨基酸序列Consden等利用色谱技术成功测定了等利用色谱技术成功测定了短杆菌肽短杆菌肽S6的氨基酸序列的氨基酸序列Sanger首次测定了牛胰岛素的一级结构首次测定了牛胰岛素的一级结构（由（由51个氨基酸残基组成）个氨基酸残基

3、组成）Spackman、Stein、Moore制造了自动制造了自动化的氨基酸分析仪，使氨基酸定量分化的氨基酸分析仪，使氨基酸定量分析进入了一个崭新的阶段析进入了一个崭新的阶段Edman 推出第一台自动测序仪推出第一台自动测序仪195819581955195519401940年前年前年前年前19671967第4页，讲稿共130张，创作于星期三引言引言牛胰岛素的一级结构牛胰岛素的一级结构第5页，讲稿共130张，创作于星期三引言引言第6页，讲稿共130张，创作于星期三一级结构测定的基本流程一级结构测定的基本流程1.拆分拆分蛋白质分子的多肽链蛋白质分子的多肽链;2.鉴定多肽链的鉴定多肽链的N-末端和末

4、端和C-末端残基末端残基;3.用两种或几种不同的断裂方法将用两种或几种不同的断裂方法将多肽链裂解多肽链裂解成较成较小的片段小的片段;4.对各肽段的氨基酸序列进行对各肽段的氨基酸序列进行测序测序;5.重建重建完整多肽链的一级结构完整多肽链的一级结构;6.确定半胱氨酸残基间形成的确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置二硫键的位置；7.酰胺基酰胺基位置的确定。位置的确定。引言引言第7页，讲稿共130张，创作于星期三测定蛋白质的一级结构前的准备工作测定蛋白质的一级结构前的准备工作1.1.样品样品纯度纯度必须必须97%97%以上；以上；聚丙烯酰胺凝胶电泳要求一条带聚丙烯酰胺凝胶电泳要求一条带2.2.测定蛋

5、白质的测定蛋白质的相对分子质量相对分子质量；SDS-PAGE SDS-PAGE，凝胶过滤法，沉降系数法，凝胶过滤法，沉降系数法3.3.测定蛋白质测定蛋白质多肽链种类和数目多肽链种类和数目；种类：种类：SDS-PAGESDS-PAGE 数目：数目：N N末端氨基酸残基摩尔数末端氨基酸残基摩尔数/蛋白质摩尔数蛋白质摩尔数4.4.测定蛋白质的测定蛋白质的氨基酸组成氨基酸组成；并根据分子量计算每；并根据分子量计算每种氨基酸的个数；种氨基酸的个数；引言引言第8页，讲稿共130张，创作于星期三第一节第一节 氨基酸组成分析氨基酸组成分析章节章节第二节第二节 蛋白质的末端测定蛋白质的末端测定第三节第三节 亚基

6、拆离、肽链降解和肽段的分离亚基拆离、肽链降解和肽段的分离第四节第四节 肽段的肽段的氨基酸顺序测定氨基酸顺序测定第五节第五节 蛋白质一级结构的重建蛋白质一级结构的重建第9页，讲稿共130张，创作于星期三第一节第一节氨基酸组成分析氨基酸组成分析第10页，讲稿共130张，创作于星期三二、特殊氨基酸的保护二、特殊氨基酸的保护三、衍生方法及原理三、衍生方法及原理第一节第一节 氨基酸组成分析氨基酸组成分析四、氨基酸定性和定量分析四、氨基酸定性和定量分析一、蛋白质或多肽的水解方法一、蛋白质或多肽的水解方法五、测定氨基酸组成的实验步骤五、测定氨基酸组成的实验步骤第11页，讲稿共130张，创作于星期三氨基酸组成

7、分析的目的氨基酸组成分析的目的 现代分离提纯技术的发展使蛋白质操作现代分离提纯技术的发展使蛋白质操作微量化，但也给微量化，但也给定量定量带来了困难，一般很难带来了困难，一般很难通过常规的称量或测蛋白溶液在通过常规的称量或测蛋白溶液在280nm的光的光吸收值来准确定量蛋白质，所以如果在蛋白质吸收值来准确定量蛋白质，所以如果在蛋白质酶解或测序前，取蛋白质样品的一部分进行氨酶解或测序前，取蛋白质样品的一部分进行氨基酸组成分析，根据结果便可以推算出蛋白量基酸组成分析，根据结果便可以推算出蛋白量的可靠值。的可靠值。第12页，讲稿共130张，创作于星期三 另外，在蛋白质测序中有时遇到测不出结果的情另外，在

8、蛋白质测序中有时遇到测不出结果的情况，一种可能是蛋白质的况，一种可能是蛋白质的N端封闭端封闭，另一种可能则是，另一种可能则是样品本身不是蛋白质或绝大部分样品本身不是蛋白质或绝大部分是非蛋白质物质是非蛋白质物质，解，解决这个问题的很好途径便是做一个氨基酸组成分析以决这个问题的很好途径便是做一个氨基酸组成分析以确定样品的成分。确定样品的成分。除了蛋白质研究和重组蛋白需要测定氨基酸除了蛋白质研究和重组蛋白需要测定氨基酸组成外，医学上也需要测定血液或各种体液中的组成外，医学上也需要测定血液或各种体液中的游离氨基酸。游离氨基酸。第13页，讲稿共130张，创作于星期三1水解水解在一定温度、酸度在一定温度、

9、酸度等条件下，蛋白质等条件下，蛋白质或多肽的肽键断裂，或多肽的肽键断裂，水解成游离氨基酸。水解成游离氨基酸。3色谱色谱利用高效液相色利用高效液相色谱对这些氨基酸谱对这些氨基酸进行定性和定量进行定性和定量色谱分析。色谱分析。2衍生衍生在游离氨基酸残基在游离氨基酸残基上衍生一个生色基上衍生一个生色基团团目前蛋白质或多肽的氨基酸组成分析主要包括目前蛋白质或多肽的氨基酸组成分析主要包括3个步骤，即：个步骤，即：最终获得蛋白质或多肽中各氨基酸所占摩尔百分数或摩最终获得蛋白质或多肽中各氨基酸所占摩尔百分数或摩尔比。尔比。氨基酸组成氨基酸组成分析的步骤分析的步骤第14页，讲稿共130张，创作于星期三一、蛋白

10、质或多肽的水解方法一、蛋白质或多肽的水解方法水解水解是蛋白质氨基酸组成分是蛋白质氨基酸组成分析的第一步，作用是破坏蛋析的第一步，作用是破坏蛋白质的肽键，得到白质的肽键，得到游离的氨基游离的氨基酸酸，用于之后的定性定量分析。，用于之后的定性定量分析。这是极其重要的一步，因为这是极其重要的一步，因为水解质量的好坏将直接影响水解质量的好坏将直接影响到最终分析结果的正确与否到最终分析结果的正确与否。第15页，讲稿共130张，创作于星期三 虽然多肽的氨基酸组成分析已向更灵敏、虽然多肽的氨基酸组成分析已向更灵敏、更精确、更快速以及自动化方向发展和改进，更精确、更快速以及自动化方向发展和改进，但还但还没有一

11、种单独适用于所有残基没有一种单独适用于所有残基的，并且能的，并且能在水解液中定量回收的水解方法出现，很多在水解液中定量回收的水解方法出现，很多因素如温度、时间、水解试剂、添加剂、水因素如温度、时间、水解试剂、添加剂、水解方法等对水解的完全程度均有影响。解方法等对水解的完全程度均有影响。下面主要对一些常用的水解方法作简要介绍。下面主要对一些常用的水解方法作简要介绍。第16页，讲稿共130张，创作于星期三1 1、酸性水解、酸性水解酸性水解是采用较多的一种水解方法，其中酸性水解是采用较多的一种水解方法，其中HCl是最通用是最通用的水解剂。的水解剂。条件条件：6 mol/L HCI、真空、真空、110

12、，水解时间为，水解时间为2024h。即。即可用于液相水解模式也可用于气相水解模式。可用于液相水解模式也可用于气相水解模式。损失损失：在该条件下，得到的氨基酸不消旋，但天冬酰胺和谷：在该条件下，得到的氨基酸不消旋，但天冬酰胺和谷氨酰胺分别被完全水解为天冬氨酸和谷氨酸，氨酰胺分别被完全水解为天冬氨酸和谷氨酸，色氨酸则被完色氨酸则被完全破坏全破坏，半胱氨酸不能从样品中直接测定，酪氨酸部分被水解，半胱氨酸不能从样品中直接测定，酪氨酸部分被水解液中痕量杂质所破坏，丝氨酸和苏氨酸被部分水解，损失分别液中痕量杂质所破坏，丝氨酸和苏氨酸被部分水解，损失分别为为10%和和5%。第17页，讲稿共130张，创作于星

13、期三相关措施相关措施：对某些对某些氨基酸的破坏率氨基酸的破坏率，需要用不同水解时间测定，需要用不同水解时间测定这些氨基酸的含量，然后外推到水解时间为这些氨基酸的含量，然后外推到水解时间为0时，时，算得的氨基酸含量，即代表了真正数值。算得的氨基酸含量，即代表了真正数值。有些有些脂肪族氨基酸残基间的肽键脂肪族氨基酸残基间的肽键，如，如Ile-Ile、Val-Val、Ile-Val等之间的肽键难于裂解，可以通过延等之间的肽键难于裂解，可以通过延长水解时间如水解长水解时间如水解92h甚至甚至120h来解决。但是长时来解决。但是长时间的水解，会使较敏感的氨基酸残基的损失更大。间的水解，会使较敏感的氨基酸

14、残基的损失更大。半胱氨酸和甲硫氨酸半胱氨酸和甲硫氨酸往往先将蛋白质用过甲酸氧化往往先将蛋白质用过甲酸氧化后再水解，相应得到磺基丙氨酸和甲硫氨酸。后再水解，相应得到磺基丙氨酸和甲硫氨酸。第18页，讲稿共130张，创作于星期三2、碱性水解、碱性水解碱性水解一般选用碱性水解一般选用NaOH和和KOH作为水解剂。作为水解剂。例如将水解样品加入例如将水解样品加入5mol/L NaOH中，充氮气中，充氮气后填充管，后填充管，110 水解水解22h。该水解方法是该水解方法是HCl水解的互补法。因为碱水解水解的互补法。因为碱水解时，多数氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、精氨酸时，多数氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、精氨酸以及半

15、胱氨酸遭到破坏，其它的氨基酸外消以及半胱氨酸遭到破坏，其它的氨基酸外消旋化，旋化，仅色氨酸是稳定的仅色氨酸是稳定的。所以此法仅限于测定。所以此法仅限于测定色氨酸的含量。色氨酸的含量。第19页，讲稿共130张，创作于星期三3 3、酶水解、酶水解用用一组蛋白酶一组蛋白酶水解肽链，特别适用于对化学水解敏水解肽链，特别适用于对化学水解敏感的氨基酸如天冬酰胺和谷氨酰胺的测定。感的氨基酸如天冬酰胺和谷氨酰胺的测定。优点优点是水解过程中氨基酸不发生消旋化，几乎可是水解过程中氨基酸不发生消旋化，几乎可以保持所有的组成氨基酸不被破坏。因为酶水解条以保持所有的组成氨基酸不被破坏。因为酶水解条件温和，对天冬酰胺、谷

16、氨酰胺等皆无破坏作用。件温和，对天冬酰胺、谷氨酰胺等皆无破坏作用。缺点缺点是反应需要较长的时间，水解的产物为较小是反应需要较长的时间，水解的产物为较小的肽段，水解不完全。另外，因为酶本身也是蛋白的肽段，水解不完全。另外，因为酶本身也是蛋白质，对样品的测定结果可能会有干扰。质，对样品的测定结果可能会有干扰。第20页，讲稿共130张，创作于星期三常见蛋白水解酶及其作用位点常见蛋白水解酶及其作用位点第21页，讲稿共130张，创作于星期三4、微波辐射能水解、微波辐射能水解 微波是一种高频电磁波，其能量传递是通过微波是一种高频电磁波，其能量传递是通过分子的极化，而水分子的极化作用是非常高的，分子的极化，

17、而水分子的极化作用是非常高的，微波能量的快速吸收能导致完全微波能量的快速吸收能导致完全水解的时间大大水解的时间大大缩短缩短。在微波辅助酸水解和微波辅助酶水解中，。在微波辅助酸水解和微波辅助酶水解中，水解时间可从过去的几十小时缩短到几十分水解时间可从过去的几十小时缩短到几十分钟。钟。因此，微波辅助蛋白质水解技术的出现大大因此，微波辅助蛋白质水解技术的出现大大提高了氨基酸组成分析的效率。提高了氨基酸组成分析的效率。第22页，讲稿共130张，创作于星期三5、膜上蛋白质印迹样品的水解（原位分析）、膜上蛋白质印迹样品的水解（原位分析）如果蛋白质样品采用电泳法如果蛋白质样品采用电泳法(如如SDS-PAGE

18、)分离，很难从分离，很难从凝胶中洗脱下来，可采用电印迹法把样品转移到凝胶中洗脱下来，可采用电印迹法把样品转移到PVDF(聚聚偏氟乙烯偏氟乙烯)膜上，然后在膜上，然后在PVDF膜上直接进行盐酸水解和氨基膜上直接进行盐酸水解和氨基酸分析，称之为酸分析，称之为原位原位(in situ)分析。分析。可将水解指管放入水解反应器中，在反应器底部加可将水解指管放入水解反应器中，在反应器底部加入入200ul含含7巯基乙酸的巯基乙酸的6mol/L盐酸，盐酸，110 真空水解真空水解24 h，水解结束后用，水解结束后用200 ul 含含30甲醇的甲醇的0.1 mol/L盐酸反复三盐酸反复三次将氨基酸从次将氨基酸从

19、PVDF膜中抽提出来，以便进行下一步的分膜中抽提出来，以便进行下一步的分析。析。第23页，讲稿共130张，创作于星期三 总之，蛋白质水解阶段所采用的方法不同，总之，蛋白质水解阶段所采用的方法不同，会对氨基酸组成分析产生重要影响。对于不同会对氨基酸组成分析产生重要影响。对于不同的蛋白质、不同的研究目的、以及样品量的多的蛋白质、不同的研究目的、以及样品量的多少，应采取不同的水解方法。少，应采取不同的水解方法。第24页，讲稿共130张，创作于星期三二、特殊氨基酸的保护二、特殊氨基酸的保护 不同水解条件下，各种氨基酸的回收有所不同水解条件下，各种氨基酸的回收有所不同。一些敏感氨基酸如不同。一些敏感氨基

20、酸如色氨酸和半胱氨酸色氨酸和半胱氨酸可可能遭水解破坏，导致无法正确测定其含量。能遭水解破坏，导致无法正确测定其含量。因此水解过程中，需要考虑对特殊氨基因此水解过程中，需要考虑对特殊氨基酸的保护。酸的保护。第25页，讲稿共130张，创作于星期三色氨酸的保护色氨酸的保护水解酸中加添加剂水解酸中加添加剂：例如加入巯基乙酸和-巯基乙醇，可使色氨酸的回收可达80。有机酸有机酸：3molL疏基乙磺酸或4mol/L甲磺酸在水解时对色氨酸有一定的保护作用。酶酶：利用蛋白酶作为水解剂，条件温和，对天冬酰胺和谷氨酰胺及色氨酸均无破坏作用。碱碱：用氢氧化钠和氢氧化钡代替酸水解，可保护色氨酸不被破坏。第26页，讲稿共

21、130张，创作于星期三光谱法：光谱法：分光光度法分光光度法：应用较早，在蛋白质分子中，如不含：应用较早，在蛋白质分子中，如不含胱氨酸和其他有干扰的发色基团的氨基酸，根据其胱氨酸和其他有干扰的发色基团的氨基酸，根据其在在6mol/L盐酸胍的中性溶液中的紫外吸收，测定色盐酸胍的中性溶液中的紫外吸收，测定色氨酸和酪氨酸的含量，此经验公式只适用于色氨酸氨酸和酪氨酸的含量，此经验公式只适用于色氨酸对酪氨酸的比值为对酪氨酸的比值为0.21时的情况。时的情况。二阶微分光谱法二阶微分光谱法：常被用来确定蛋白质中芳香族氨：常被用来确定蛋白质中芳香族氨基酸的含量，计算公式复杂，基酸的含量，计算公式复杂，Hewle

22、tt Packard公公司推出的司推出的DAD检测器配合其化学工作站软件，能检测器配合其化学工作站软件，能较方便地在线检测并定量肽段中的色氨酸。较方便地在线检测并定量肽段中的色氨酸。第27页，讲稿共130张，创作于星期三半胱氨酸的保护半胱氨酸的保护：还原烷化法：还原烷化法：产生能抗水解的半胱氨酸衍生物。烷化产生能抗水解的半胱氨酸衍生物。烷化试剂包括试剂包括4-乙烯吡啶和碘代乙酸。乙烯吡啶和碘代乙酸。缺点：为了确保试剂接近巯基，还原和氧化通常在变性剂存缺点：为了确保试剂接近巯基，还原和氧化通常在变性剂存在下进行，多余试剂和变性剂要用在下进行，多余试剂和变性剂要用HPLC、沉淀法或透析去除，、沉淀

23、法或透析去除，每一步都可能造成样品的损失。每一步都可能造成样品的损失。第28页，讲稿共130张，创作于星期三氧化反应氧化反应：过甲酸氧化反应被用来转化半胱氨酸和胱氨酸成：过甲酸氧化反应被用来转化半胱氨酸和胱氨酸成为半胱磺酸再进行测定。为半胱磺酸再进行测定。缺点：会影响其他氨基酸特别是甲硫氨酸会转变成甲硫缺点：会影响其他氨基酸特别是甲硫氨酸会转变成甲硫氨酸砜，酪氨酸会降解。必须准备能分析两次的样品量氨酸砜，酪氨酸会降解。必须准备能分析两次的样品量一次提供半胱氨酸数据，另一次则提供其他氨基酸的一次提供半胱氨酸数据，另一次则提供其他氨基酸的组成数据。组成数据。第29页，讲稿共130张，创作于星期三三

24、、衍生方法及原理三、衍生方法及原理衍生是将氨基酸衍生为有利于测定或分离的化衍生是将氨基酸衍生为有利于测定或分离的化合物。合物。大多数氨基酸不含有芳香环等生色团，无法直大多数氨基酸不含有芳香环等生色团，无法直接用紫外法检测，需要先将氨基酸接用紫外法检测，需要先将氨基酸衍生为具有衍生为具有较强紫外或荧光吸收的衍生物。较强紫外或荧光吸收的衍生物。从衍生角度看，氨基酸分析可以分为柱后反应法和从衍生角度看，氨基酸分析可以分为柱后反应法和柱前衍生法两大类。柱前衍生法两大类。第30页，讲稿共130张，创作于星期三柱后反应法柱后反应法将游离氨基酸经过色谱柱分离后，各种氨基酸再与将游离氨基酸经过色谱柱分离后，各

25、种氨基酸再与显色剂显色剂(茚三酮、荧光胺、邻苯二甲醛茚三酮、荧光胺、邻苯二甲醛)作用。作用。优点优点：比较稳定，对样品预处理要求低，容易定：比较稳定，对样品预处理要求低，容易定量和自动化操作。量和自动化操作。缺点缺点：检测灵敏度不高，分析时间长：检测灵敏度不高，分析时间长(蛋白质水解蛋白质水解液需液需1 h1 h而某些生理样品则需而某些生理样品则需4 h4 h以上以上)。第31页，讲稿共130张，创作于星期三柱前衍生法柱前衍生法将氨基酸和化学偶联试剂先反应生成氨基酸的衍生将氨基酸和化学偶联试剂先反应生成氨基酸的衍生物，然后再用色谱柱将各种衍生物分离，直接检测物，然后再用色谱柱将各种衍生物分离，

26、直接检测衍生物的光吸收或荧光发射。衍生物的光吸收或荧光发射。优点优点：此法可检测：此法可检测OPA-（邻苯二甲醛），（邻苯二甲醛），PTC-，PTH-，DABS-，Dansyl-和和DABTH-氨基酸，分析氨基酸，分析灵敏度高，可利用灵敏度高，可利用HPLC进行氨基酸分析。进行氨基酸分析。缺点缺点：有的衍生物不稳定，衍生试剂可能干扰氨基：有的衍生物不稳定，衍生试剂可能干扰氨基酸检测。酸检测。第32页，讲稿共130张，创作于星期三柱后反应法柱后反应法 VS 柱前衍生法柱前衍生法第33页，讲稿共130张，创作于星期三几种常见的氨基酸分析方法几种常见的氨基酸分析方法：1、茚三酮反应、茚三酮反应2、荧

27、光胺法、荧光胺法3、邻苯二甲醛、邻苯二甲醛(OPA)法法4、PTC-AA分析法分析法5、Dansyl-Cl（DNS-Cl）法）法6、磺酰氯二甲胺偶氮苯磺酰氯二甲胺偶氮苯（Dabsyl-Cl）法）法第34页，讲稿共130张，创作于星期三1 1、茚三酮反应、茚三酮反应-氨基酸与水合茚三酮一起在水溶液中加热，除脯氨酸和羟氨基酸与水合茚三酮一起在水溶液中加热，除脯氨酸和羟脯氨酸产生黄色物质，其它氨基酸都产生脯氨酸产生黄色物质，其它氨基酸都产生蓝紫色物质。蓝紫色物质。此反应十分灵敏，根据反应所生成的蓝紫色的深浅，在此反应十分灵敏，根据反应所生成的蓝紫色的深浅，在570nm波长下进行比色就可测定样品中氨基

28、酸的含量波长下进行比色就可测定样品中氨基酸的含量。第35页，讲稿共130张，创作于星期三2、柱后荧光胺法、柱后荧光胺法 荧光胺能在室温下迅速和一级胺发生反应，其荧光胺能在室温下迅速和一级胺发生反应，其荧光产物荧光产物的激发波长的激发波长390 nm，发射波长，发射波长475 nm。荧光胺与氨反应的灵敏度比茚三酮与氨反应的荧光胺与氨反应的灵敏度比茚三酮与氨反应的灵敏度大约提高了灵敏度大约提高了3个数量级。个数量级。第36页，讲稿共130张，创作于星期三3 3、邻苯二甲醛、邻苯二甲醛(OPA)(OPA)法法OPA最早是被作为柱后衍生试剂而引进的，后来也逐渐应用于柱前反应中。OPA能在还原剂巯基乙醇

29、存在下和一级胺产生具有很强荧光强荧光的异吲哚衍生物，该反应在室温下1 min即可完成。第37页，讲稿共130张，创作于星期三4、PTC-AA分析法分析法属柱前衍生法，源于Edman降解法测定蛋白质一级结构。异硫氰酸苯酯(PITC)能在碱性条件下和氨基酸反应，生成苯氨基硫甲酰（PTC）-AA，能在254nm检出。此法分析灵敏度和荧光胺、OPA的荧光法相同。第38页，讲稿共130张，创作于星期三5、Dansyl-Cl（DNS-Cl）法）法荧光试剂二甲氨基萘磺酰氯（荧光试剂二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）能与所有氨）能与所有氨基酸柱前反应形成高稳定性的带有基酸柱前反应形成高稳定性的带有荧光荧光的的D

30、NS-氨氨基酸。但反应耗时。基酸。但反应耗时。第39页，讲稿共130张，创作于星期三6、磺酰氯二甲胺偶氮苯磺酰氯二甲胺偶氮苯（Dabsyl-Cl）法）法 灵敏度是灵敏度是Dansyl-Cl法的法的1/5，反应产生有色，反应产生有色衍生物，能方便地在衍生物，能方便地在254 nm和和425 nm处用紫外处用紫外检测。检测。有报道用有报道用DABITC代替代替Dabsyl-Cl，反应产，反应产生生DABTH-AA，在酸性环境中显红色，易在，在酸性环境中显红色，易在254 nm，269 nm，436 nm 检测检测。第40页，讲稿共130张，创作于星期三第41页，讲稿共130张，创作于星期三四、氨基

31、酸定性和定量分析四、氨基酸定性和定量分析 氨基酸的定性和定量分析一般采用纸层析、氨基酸的定性和定量分析一般采用纸层析、薄层层析、离子交换柱层析等方法。采用薄层层析、离子交换柱层析等方法。采用HPLC仪和氨基酸自动分析仪更好。随着仪器的仪和氨基酸自动分析仪更好。随着仪器的不断改进，一个样品的测定仅需不断改进，一个样品的测定仅需20min即可完成。即可完成。第42页，讲稿共130张，创作于星期三单单向向纸纸层层析析第43页，讲稿共130张，创作于星期三双向纸层析双向纸层析第44页，讲稿共130张，创作于星期三薄层层析薄层层析第45页，讲稿共130张，创作于星期三离子交换层析离子交换层析第46页，讲

32、稿共130张，创作于星期三高效液相色谱高效液相色谱（high performance liquid high performance liquid chromatographychromatography，HPLCHPLC）第47页，讲稿共130张，创作于星期三 蛋白质中氨基酸的组成一般用每摩每摩尔蛋白质中氨基酸残基的摩尔数尔蛋白质中氨基酸残基的摩尔数表示，或每每100g100g蛋白质中含氨基酸的克数蛋白质中含氨基酸的克数表示。所以只有知道蛋白质的相对分子质量，才能推出它的氨基酸组成。第48页，讲稿共130张，创作于星期三例：血小板衍生生长因子的氨基酸组成第49页，讲稿共130张，创作于星期三

33、五、测定氨基酸组成的实验步骤五、测定氨基酸组成的实验步骤 目前各大公司如目前各大公司如Beckman，Hewlett Packard，Perkin E1mer，Waters等都有等都有各自的自动进样、氨基酸分析和定量报告各自的自动进样、氨基酸分析和定量报告联为一体的商品化氨基酸自动分析仪出售，联为一体的商品化氨基酸自动分析仪出售，下面介绍几种常规实验室测定氨基酸组成下面介绍几种常规实验室测定氨基酸组成的方法。的方法。第50页，讲稿共130张，创作于星期三1、邻苯二甲醛、邻苯二甲醛(OPA)法法实验操作实验操作：称取称取5mg OPA5mg OPA溶于溶于0.1m10.1m1甲醇中，加入甲醇中，

34、加入50 50 ul ul巯基乙醇，用巯基乙醇，用0.2 mol0.2 molL pH9.5L pH9.5的硼酸缓冲液稀释至的硼酸缓冲液稀释至1 ml1 ml。通氮气并避光保存，每隔两天加入。通氮气并避光保存，每隔两天加入5ul5ul巯基乙巯基乙醇以维持其强度，此醇以维持其强度，此OPAOPA反应试剂能用反应试剂能用2323周。取周。取10 10 u1u1标准氨基酸混合液标准氨基酸混合液(50100 pmol)(50100 pmol)或样品水解液，加或样品水解液，加10 10 ul pH9.5ul pH9.5的硼酸缓冲液的硼酸缓冲液(内含内含2 2SDSSDS和和100 pmol-100 pm

35、ol-氨基氨基丁酸丁酸)，然后加入，然后加入10 u1 OPA10 u1 OPA试剂，混合均匀，反应试剂，混合均匀，反应1 1 minmin后再加入后再加入20 ul 0.1 mol/L20 ul 0.1 mol/L的的KH 2PO4KH 2PO4中止反应，并中止反应，并立即取立即取20 ul20 ul注入注入RP-HPLCRP-HPLC柱进行分析。柱进行分析。第51页，讲稿共130张，创作于星期三仪器仪器为Beckman 344HPLC仪，反相柱RP-18(250mm 4.6mm)，荧光检测器。流动相：流动相：A 50mmol/L 乙酸缓冲液pH6.8:甲醇:THF=80:19:1 B 50

36、mmol/L 乙酸缓冲液pH6.8:甲醇80:20梯度条件梯度条件是：5min，10B;10min，15B,20min，10B；25min，15B；35min，50B；50min，90B;55min，100B。第52页，讲稿共130张，创作于星期三第53页，讲稿共130张，创作于星期三 用乙醇代替剧毒的乙腈或甲醇作为有机相用乙醇代替剧毒的乙腈或甲醇作为有机相来定量分析氨基酸，灵敏度可达来定量分析氨基酸，灵敏度可达10 pmol。第54页，讲稿共130张，创作于星期三2 2、PTC-AAPTC-AA实验操作实验操作：氨基酸或样品在Eppendorf管中真空干燥后溶解在50 ul偶联试剂(乙醇:三

37、乙胺:水7:1:1)中。此溶液在旋转真空干燥后再次溶解于50ul偶联试剂中，然后加入2ul PITC(异硫氰酸苯酯)，反应混合物在250C下保温15 min，再次旋转真空干燥，真空度(1.313 Pa)。如此生成的PTC-AA溶解在适量流动相A中，取一部分上柱定量分析。第55页，讲稿共130张，创作于星期三仪器仪器为Beckman Gold System HPLC仪，反相柱RP-18(250mm4.6mm)或PTH-柱，254 nm 检测。流动相流动相：A 50mmol/L 乙酸钠，pH6.8 B 50mmo1L乙酸钠，pH6.8:乙腈50:50 HPLC柱采用水浴夹套40恒温，并用5流动相B

38、平衡。梯度条件梯度条件是：0 min,5%B,5 min,5-15B,10 min,15B；30 min,1560B,40 min,60 5B流速流速是1mlmin。第56页，讲稿共130张，创作于星期三第57页，讲稿共130张，创作于星期三3 3、茚三酮法、茚三酮法实验操作实验操作：水解后氨基酸样品溶解于Na-S样品稀释液中100 u1上样分析，实际进样量50 ul(100 pmol5nmol，均呈线性)。第58页，讲稿共130张，创作于星期三仪器仪器：Beckman 6300氨基酸分析仪。流动相流动相：Na-E 0.0 min 温度温度：0.0 min 48 Na-D 27.80 min

39、11.8min 65 Na-F 39 min 32.5min 77 Na-R 76.00 min 50min 48 Na-E 77.00-90 min流速流速：缓冲液14 ml/h 茚三酮7 ml/h第59页，讲稿共130张，创作于星期三第60页，讲稿共130张，创作于星期三第二节第二节蛋白质的末端测定蛋白质的末端测定第61页，讲稿共130张，创作于星期三蛋白质的末端分析的目的:确定其氨基末端残基及羧基末端残基氨基末端残基及羧基末端残基了解蛋白质分子中肽链的组成情况肽链的组成情况。例如，牛胰岛素单体有2个N-末端和2个C-末端，是由2条肽链通过二硫键相连而成；血红蛋白分子有4个N-末端和4个C

40、-末端，为4个亚基通过次级键组成的分子。第62页，讲稿共130张，创作于星期三 末端分析通常采用专一性化学试剂与末端氨基末端分析通常采用专一性化学试剂与末端氨基或羧基反应，然后分解出被作用的末端氨基酸加以或羧基反应，然后分解出被作用的末端氨基酸加以测定。由于与羧基反应的活化能相当高，所以用于测定。由于与羧基反应的活化能相当高，所以用于与羧基反应的专一性试剂比较少，而与羧基反应的专一性试剂比较少，而N端测定的方端测定的方法较多。氨肽酶及羧肽酶等外切酶也常有应用。法较多。氨肽酶及羧肽酶等外切酶也常有应用。下面介绍常用的下面介绍常用的N-末端和末端和C-末端测定的方法，末端测定的方法，以及封闭以及封

41、闭N-末端的测定。末端的测定。第63页，讲稿共130张，创作于星期三二、二、C-C-末端的测定末端的测定三、三、封闭封闭N-N-末端的测定末端的测定第二节第二节 蛋白质的末端测定蛋白质的末端测定一、一、N-N-末端的测定末端的测定第64页，讲稿共130张，创作于星期三一、一、N-N-末端的测定末端的测定 N末端测定方法比末端测定方法比C末端更加成熟、可靠和准末端更加成熟、可靠和准确，主要的方法有：确，主要的方法有：1、二硝基氟苯法（、二硝基氟苯法（DNFB法、法、Sanger法）法）2、二甲氨基萘磺酰氯法（、二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）法）3、异硫氰酸苯酯法（、异硫氰酸苯酯法（PITC

42、法）法）4、DABITC法法5、氨肽酶法、氨肽酶法第65页，讲稿共130张，创作于星期三1 1、二硝基氟苯法（、二硝基氟苯法（DNFBDNFB法、法、SangerSanger法）法）二硝基氟苯在弱碱性条件下，与肽链的N端氨基作用，形成二硝基苯基肽链（DNP-肽），经酸水解后，N端残基成为二硝基苯基（二硝基苯基（DNP）-氨基酸氨基酸，可用有机溶剂（如乙醚）抽提，再进行纸层析或薄层层析后，根据层析斑点的位置作定性鉴定。第66页，讲稿共130张，创作于星期三 FDNB不仅与N-末端的-氨基起反应，也与侧侧链链上的-氨基、巯基、酚羟基和咪唑基反应，但水解产物极性较强，不被乙醚抽提，而不干扰末端的测定

43、。当N-端残基为脯氨酸脯氨酸或羟脯氨酸羟脯氨酸时，因DNP-脯氨酸或DNP-羟脯氨酸在盐酸水解条件下极不稳定，如DNP-脯氨酸易分解成脯氨酸以及-氯-DNP-氨基戊酸和-氯-DNP氨基戊酸，所以回收率甚低，不能进行测定。第67页，讲稿共130张，创作于星期三2、二甲氨基萘磺酰氯法（、二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）法）荧光剂DNS-Cl可与肽链N端氨基反应生成DNS-肽，经酸水解，N-末端残基形成DNS-氨基酸氨基酸，用乙酸乙酯抽提，然后用层析法鉴定。DNS-氨基酸于360nm或280nm处产生强烈荧光，根据荧光点位置确定N端氨基酸。第68页，讲稿共130张，创作于星期三 DNS-脯氨酸脯

44、氨酸经6 M HCl于110水解过夜有70%被破坏。色氨酸色氨酸及其DNS衍生物在盐酸水解时完全被破坏，可改用巯基乙烷磺酸在真空下水解，并用乙酸乙酯抽提非极性得DNS-氨基酸加以鉴定。第69页，讲稿共130张，创作于星期三赖氨酸的赖氨酸的-氨基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪氨基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基以及酪氨酸的羟基也能与唑基以及酪氨酸的羟基也能与DNS-Cl进行反应。进行反应。但半胱氨酸和组氨酸侧链衍生物在酸水解时并不稳但半胱氨酸和组氨酸侧链衍生物在酸水解时并不稳定。定。当当N-末端为末端为组氨酸组氨酸、精氨酸精氨酸或或半胱氨酸半胱氨酸（S-羧甲基羧甲基半胱氨酸形式或磺酸形式）时，对其

45、测定也受到一定半胱氨酸形式或磺酸形式）时，对其测定也受到一定限制。限制。当当N-末端氨基酸为末端氨基酸为谷氨酸谷氨酸或或谷氨酰胺谷氨酰胺、天冬氨酸天冬氨酸或天冬酰胺或天冬酰胺时，因有高温水解过程，对它们不能区时，因有高温水解过程，对它们不能区别。别。第70页，讲稿共130张，创作于星期三3、异硫氰酸苯酯法、异硫氰酸苯酯法在弱碱中，异硫氰酸苯酯（PITC）与N端氨基偶联生成苯基硫甲酰衍生物（PTC-肽）。在酸性溶液中，PTC-肽经环化裂解生成PTC-氨基酸和N端少个氨基酸的剩余多肽。由于PTC-氨基酸不稳定，很快转化成苯基乙内酰硫脲氨基酸（PTH-氨基酸氨基酸）。生成PTH-氨基酸非常稳定，在2

46、68nm处有强吸收峰。第71页，讲稿共130张，创作于星期三 噻咪啉酮衍生物经氯乙烯抽提后，留下的肽噻咪啉酮衍生物经氯乙烯抽提后，留下的肽链再可作下一次的循环，分析次一个氨基酸残基。链再可作下一次的循环，分析次一个氨基酸残基。因而此法也称为因而此法也称为Edman顺序降解，可用于蛋白质顺序降解，可用于蛋白质或多肽的或多肽的N端顺序测定，一般可测定末端端顺序测定，一般可测定末端30个左右个左右的残基，是制造氨基酸顺序分析仪的理论基础。的残基，是制造氨基酸顺序分析仪的理论基础。第72页，讲稿共130张，创作于星期三4 4、DABITCDABITC法法 DABITC（4-N,N-对甲氨基偶氮苯-4-

47、异硫氰酸酯）能与N端氨基反应生成DABTH-氨基酸氨基酸，经层析分离后，用盐酸气熏即可出现红色斑点，很容易鉴定。第73页，讲稿共130张，创作于星期三5、氨肽酶法、氨肽酶法氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的 N-末端残基顺序。但由于酶的特异性和对各种 氨基酸水解速度不用，结果 往往不易判断，在实际应用 中容易导致错误结论。第74页，讲稿共130张，创作于星期三二、二、C末端的测定末端的测定 C末端测定方法较少，而且较N末端分析误差大。可采用的方法有：1、羧

48、肽酶法、羧肽酶法2、硼氢化锂法（、硼氢化锂法（LiBH4法，还原法）法，还原法）3、肼解法、肼解法第75页，讲稿共130张，创作于星期三1、羧肽酶法、羧肽酶法 羧肽酶是一种肽链外切酶，能从多肽链的C端逐个的水解氨基酸。根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C末端残基顺序。实际应用时，由于羧肽酶对不同的C末端氨基酸作用的速度不同，而且反应是连续的，不能停在某一步上，因此给正确判断氨基酸的顺序造成了一定的困难。第76页，讲稿共130张，创作于星期三4种常用羧肽酶：羧肽酶来源专一性CpA胰脏能释放除pro、Arg和Lys以外的所有C端氨基酸CpB胰脏主要水解C端为Ar

49、g或Lys的肽键CpC植物或微生物相当广泛，几乎能释放C端的所有氨基酸CpY面包酵母可释放C端所有氨基酸第77页，讲稿共130张，创作于星期三 2、硼氢化锂法（、硼氢化锂法（LiBH4法，还原法）法，还原法）硼氢化锂可与硼氢化锂可与C末端末端氨基反应生成相应的氨基反应生成相应的-氨基醇，水解后抽提氨基氨基醇，水解后抽提氨基醇，可用层析法分离、鉴醇，可用层析法分离、鉴定。定。第78页，讲稿共130张，创作于星期三3、肼解法、肼解法当蛋白质和无水肼在100反应510 h，肼可断裂所有的肽键，使所有氨基酸残基形成肼的衍生物氨基酸酰肼，可与苯甲醛作用形成不溶的二亚苄基衍生物而除去，唯有C末端氨基酸以游

50、离的形式存在于上清液中。第79页，讲稿共130张，创作于星期三 肼解法不适宜于C端为胱氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺的测定。肽链中的丙氨酸、丝氨酸以及甘氨酸残基形成的酰肼化合物不稳定，在水溶液中容易转化为原来的氨基酸而干扰结果。第80页，讲稿共130张，创作于星期三三、封闭三、封闭N-末端的测定末端的测定 有些蛋白质的肽链没有游离的氨基端没有游离的氨基端，较多的情况是氨基端因受到乙酰化或谷氨酸残基自身环化为焦谷氨酸残基而被封闭。此时我们可采用相应方法对封闭N-末端进行测定。第81页，讲稿共130张，创作于星期三 1乙酰化乙酰化N-末端末端 肼解条件下，N端的乙酰基形成乙酰肼。然后，使其与D