蛋白质分子的特殊运动折叠精选PPT.ppt

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1、关于蛋白质分子的特殊运动折叠第1页，讲稿共71张，创作于星期三分子生物学中心法则分子生物学中心法则 蛋白质折叠问题又被称为第二遗传密码第2页，讲稿共71张，创作于星期三给定一序列，它将怎样折叠怎样折叠成其特定结构？9 9 蛋白质的折叠蛋白质的折叠第3页，讲稿共71张，创作于星期三蛋白质折叠研究的理论意义几乎所有的生命活动都是由蛋白质完成的而蛋白质链只有折叠成天然结构才有活性 生命从蛋白质折叠开始！第4页，讲稿共71张，创作于星期三蛋白质折叠研究的应用意义蛋白质工程的医药保健产品市场每年数十亿美元蛋白质工程的医药保健产品市场每年数十亿美元已知二十多种疾病与蛋白质的错误折叠有关已知二十多种疾病与蛋

2、白质的错误折叠有关 （老年痴呆症、疯牛病等）（老年痴呆症、疯牛病等）蛋白质折叠还是蛋白质组研究的瓶颈之一蛋白质折叠还是蛋白质组研究的瓶颈之一第5页，讲稿共71张，创作于星期三Prion疾病第6页，讲稿共71张，创作于星期三Amyloidosis淀粉样变性病淀粉样变性病Attributed to Frerichs,1862Amyloid淀粉状蛋白 1854 Rudolph Virchow第7页，讲稿共71张，创作于星期三有关蛋白质折叠的几项重要研究1930s 吴宪指出蛋白质变性是肽链的构象变化而非共价键变化1960s C.Anfinsen 发现还原态RNase A，在除去还原剂和变性剂后能够自动

3、氧化恢复活性，提出蛋白质的天然结构是其热力学最稳态1960s人工合成牛胰岛素1940s L.Pauling在蛋白质晶体结构解出之前，根据物理化学原理预测了蛋白质螺旋和折迭结构nNobel Prize,1973第8页，讲稿共71张，创作于星期三变性条件变性条件v1.温度温度v2.pHv3.盐盐v4.变性剂变性剂有机溶剂有机溶剂脲脲盐酸胍盐酸胍去垢剂去垢剂尿素：碳酸尿素：碳酸(全全)酰胺酰胺O=C(NH2)28M胍：胍：HN=C(NH2)26M第9页，讲稿共71张，创作于星期三Native Protein Denatured第10页，讲稿共71张，创作于星期三变性原理变性原理v破坏次级键破坏次级键

4、v不破坏共价键不破坏共价键温度：较高时导致蛋白质交联聚沉，凝固，不可逆温度：较高时导致蛋白质交联聚沉，凝固，不可逆pH ：破坏盐键，影响解离，改变相互作用的性质：破坏盐键，影响解离，改变相互作用的性质盐：活度，溶解度盐：活度，溶解度脲：竞争氢键脲：竞争氢键第11页，讲稿共71张，创作于星期三蛋白质的功能决定于它们的天然构象，因而过去研究工作集中在蛋白质的天然构象上，而对变性态没有给予足够重视。近来，人们已知道蛋白质的非天然构象至少在以下三方面有重要作用：1、蛋白质折叠和稳定性2、蛋白质的跨膜运输3、蛋白质的水解和更新第12页，讲稿共71张，创作于星期三小分子蛋白质去折叠转变是可逆的。在周围环境

5、的诱导下，小分子蛋白质发生去折叠，当将环境刺激因素去掉后，去折叠的蛋白质又可以在折叠。第13页，讲稿共71张，创作于星期三第14页，讲稿共71张，创作于星期三第15页，讲稿共71张，创作于星期三一、问题的提出一、问题的提出蛋白质的高级结构是由什么决定的？蛋白质的高级结构是由什么决定的？蛋白质如何由一级结构形成高级结构？蛋白质如何由一级结构形成高级结构？如何由一级结构预测三级结构？如何由一级结构预测三级结构？上述提法实际上要解决相同的问题上述提法实际上要解决相同的问题分子内、分子间的相互作用分子内、分子间的相互作用折叠过程中是否存在中间态折叠过程中是否存在中间态第16页，讲稿共71张，创作于星期

6、三 绝大多数的小蛋白质的去折叠与再折叠是可逆的绝大多数的小蛋白质的去折叠与再折叠是可逆的 “一级结构不仅为空间结构编码，而且以某一级结构不仅为空间结构编码，而且以某种方式规定指导着达到这种空间结构所经历的途种方式规定指导着达到这种空间结构所经历的途径径”蛋白质折叠的密码立体化学密码第二蛋白质折叠的密码立体化学密码第二密码。密码。折叠密码的复杂性：序列相近的蛋白取相同折叠密码的复杂性：序列相近的蛋白取相同的空间结构；序列相同的肽段可以取不同的二级的空间结构；序列相同的肽段可以取不同的二级结构。结构。第17页，讲稿共71张，创作于星期三两个主要的考虑方向v热力学条件v动力学条件化学反应观点；相变观

7、点第18页，讲稿共71张，创作于星期三Milestone第19页，讲稿共71张，创作于星期三 Anfinsen Anfinsen 对对 Ribonuclease Ribonuclease 的研究的研究提出了蛋白质一级结构决定高级结构提出了蛋白质一级结构决定高级结构的假说。的假说。Anfinsens work,1957-63:formation of native disulfide bonds in ribonuclease A and other proteins.Key discovery:the information needed for folding is contained in

8、 the amino acid sequence.第20页，讲稿共71张，创作于星期三二、二、蛋白质折叠的热力学考虑蛋白质折叠的热力学考虑Anfinsen的经典热力学假说：Anfinsen认为天然蛋白质多肽链所采取的构象是在一定环境条件下（如溶液组分、pH、温度、离子强度等），整个系统的总Gibbs自由能取最低，所以处于变性状态的多肽链能够在这样的环境下自发折叠成天然构象。第21页，讲稿共71张，创作于星期三Anfinsen实验变性蛋白的复性实验v从二硫键入手,提出假设,实验验证其正确性:v材料:牛胰核糖核酸酶v含4对二硫键v26-8440-95v58-11065-72-S-S-交联方式:7x

9、5x3x1=105种,天然只占其中一种第22页，讲稿共71张，创作于星期三牛胰核糖核酸酶第23页，讲稿共71张，创作于星期三Anfinsen实验模型1：空间障碍，只允许一种构象（二硫键配对）模型2：生物合成的结果模型3：先形成了热力学稳定构象，然后形成二硫键加固实验否定了前两种假设，肯定了第三种第24页，讲稿共71张，创作于星期三Anfinsen实验实验一：1.脲变性。RNAase+8M脲+巯基乙醇脲使得肽链展开，酶失活2.透析除脲和巯基乙醇，3.pH8弱碱性条件，溶液暴露于空气中，重新氧化复性，酶活力重新获得第25页，讲稿共71张，创作于星期三巯基乙醇巯基乙醇第26页，讲稿共71张，创作于星

10、期三脲变性过量巯基乙醇导致还原第27页，讲稿共71张，创作于星期三Anfinsen实验实验二1.脲变性。RNAase+8M脲+巯基乙醇脲使得肽链展开，酶失活2.透析除巯基乙醇，然后通O2，再透析除脲结果：酶活性恢复到0.01第28页，讲稿共71张，创作于星期三错配的二硫键只需要加一点点巯基乙醇就可复性第29页，讲稿共71张，创作于星期三Anfinsen实验1.由实验一可知，模型（生物合成的结果）不成立，因为离体条件下复性的蛋白具有全部酶活性（后来又有实验证明体外解折叠是完全的，全人工合成）2.由实验二可知，模型（空间障碍，只允许一种构象（二硫键配对）不成立，否则，复性的蛋白应该具有几乎全部酶活

11、性3.模型（先形成了热力学稳定构象，然后形成二硫键加固）能够解释 both 结果。结论：蛋白质一级结构决定三级结构形成三级结构所需要的所有信息包含在一级结构中。第30页，讲稿共71张，创作于星期三Anfinsen实验Anfinsen实验的启示实验的启示：1.成功需要一点点运气（简单的单结构域蛋白）2.抓住主要矛盾，善于洞察问题的本质3.严谨的推理不是得到正确结论的必要条件正确的前提正确的推导正确的结论正确的前提错误的推导正确或错误的结论错误的前提正确的推导错误的结论（大概率）错误的前提错误的推导正确或错误的结论Model 1 and 2 都有实验支持第31页，讲稿共71张，创作于星期三同时代取

12、得的其它一些结果同时代取得的其它一些结果折叠是以结构域为单位进行的。折叠是以结构域为单位进行的。ribonuclease A 去除 5 C-末端残基后,蛋白质就丧失了正确形成二硫键的能力。(H.Taniuchi,J.Biol.Chem.245,5459-5468;1970)含有两个或多个结构域的蛋白质，相邻结构域的解折叠是近似相互独立的。第32页，讲稿共71张，创作于星期三Levinthal Paradoxv对一个100个氨基酸残基的小蛋白质链 假设：只有主链二面角和可以转动 每个二面角只有3个可能值 则：总构象数为 3200v如果：每转动一次时间为10-15秒 则：历遍所有构象约需1072年

13、 而：宇宙年龄为1.51010第33页，讲稿共71张，创作于星期三三、三、折叠的动力学考虑折叠的动力学考虑v有无中间体？v最低自由能构象能否达到？v折叠过程是怎样的？第34页，讲稿共71张，创作于星期三单一结构域的蛋白质，不存在单一结构域的蛋白质，不存在平衡平衡中间态。中间态。两态折叠第35页，讲稿共71张，创作于星期三折叠中间态的发现首先在折叠、去折叠的早期动力学时首先在折叠、去折叠的早期动力学时(快速反应快速反应)中发现。中发现。(Cytochrome c:A.Ikai and C.Tanford,Nature 230,100-102;1971;ribonuclease A:T.Y.Tso

14、ng,R.L.Baldwin and E.L.Elson,PNAS 68,2712-2715;1971)第36页，讲稿共71张，创作于星期三折叠中间态折叠中间态?无辅基肌红蛋白(Apo-Mb)变性图（圆二色谱CD结果）第37页，讲稿共71张，创作于星期三快速检测蛋白质折叠的方法快速检测蛋白质折叠的方法第38页，讲稿共71张，创作于星期三通过二硫键捕捉中间体捕获二硫键碘乙酸抑制二硫键的生成，在不同的时间加入碘乙酸，得到二硫键数目不同，构象不同的蛋白质，然后利用柱层析分离第39页，讲稿共71张，创作于星期三牛胰蛋白酶抑制剂的二硫键折叠途径中间体限速第40页，讲稿共71张，创作于星期三蛋白质折叠过程

15、的时间尺度第41页，讲稿共71张，创作于星期三多肽链能够采取的构象个数是个天文数字，平均每个Aa可以有10种构象，100Aa的多肽链有10100种可能的构象。从一个构象转变为另一个构象所需最短时间1013s，则该蛋白尝试所有的构象的时间是1085s=1077y，而人们观察到蛋白质体内、体外折叠的时间是10-110-3s.结论：蛋白质的折叠不是随机尝试所有可能的构象直到遇到某个自由能最低的构象，而是沿着某些确定的途径进行的。蛋白质的天然构象未必是最低自由能的构象，而是动力学途径中所能得到的稳定的构象。Levinthal Paradox第42页，讲稿共71张，创作于星期三能量偏移限制了折叠过程中对

16、不合理构象的尝试第43页，讲稿共71张，创作于星期三对蛋白折叠过程的共识对蛋白折叠过程的共识两种过程两种过程v成核：小蛋白v多步：大蛋白，以结构域为单位第44页，讲稿共71张，创作于星期三蛋白质折叠的启动蛋白质折叠的启动疏水塌缩疏水塌缩经熔球中间态经熔球中间态 （molten globule state）二级结构生成二级结构生成框架结构模型框架结构模型特殊作用的启动特殊作用的启动Disulfide bonds去折叠态中的残留有序结构去折叠态中的残留有序结构第45页，讲稿共71张，创作于星期三第46页，讲稿共71张，创作于星期三1、局部肽段形成一些构象单、局部肽段形成一些构象单元（元（螺旋、螺旋

17、、折叠折叠和和 转角转角等）等）Motifs三级结三级结构；构；2、肽链内部的疏水作用引、肽链内部的疏水作用引起一个塌陷过程，然后经调起一个塌陷过程，然后经调整，形成不同层次的结构。整，形成不同层次的结构。3、“熔球态熔球态”的中间状态。的中间状态。在熔球态中，蛋白质的二级在熔球态中，蛋白质的二级结构已基本形成，蛋白质的结构已基本形成，蛋白质的整体空间结构也初具规模。整体空间结构也初具规模。在熔球态时，分子立体的结在熔球态时，分子立体的结构再作一些局部调整，最后构再作一些局部调整，最后形成正确的立体结构形成正确的立体结构第47页，讲稿共71张，创作于星期三蛋白质折叠的现代研究v从头算(ab i

18、nitio)预测1D-3Dv目标：疏水表面埋藏最大，loop熵减最小v设计新的蛋白质结构v构象病的研究v蛋白质错误折叠产生淀粉样纤维，导致构象病，eg:Alzheimers and Parkinsons diseases(J.W.Kelly,Nature Struct.Biol.9,323-325;2002).第48页，讲稿共71张，创作于星期三第49页，讲稿共71张，创作于星期三折叠过程的动力学模拟动力学模拟能够成功的再现折叠过程的细节，例如过渡态的结构(D.Baker,Nature 405,39-42;2000)和折叠中间体(C.Clementi,P.A.Jennings and J.N.

19、Onuchic,PNAS 97,5871-5876;2000)第50页，讲稿共71张，创作于星期三Baker D.等认为，如果多肽链所采取的构象中只有一个低自由能状态，即天然构象，则所有非天然构象多肽链将遵循经典热力学假说，由高能态向低能态转变，最终形成天然构象。但有些蛋白，天然构象也许并非是多肽链自由能最低的构象或唯一的低能构象，多肽链采取非天然的构象也很稳定，而这两种构象之间转变需要克服很高势垒而难以实现，那么蛋白质在折叠过程中就会有两种途径的竞争，一种是正确折叠形成天然构象，一种是错误折叠形成非天然构象。蛋白质之所以能够形成正确的构象，是由于一些因素在蛋白质折叠的动力学过程中起驱动作用。

20、第51页，讲稿共71张，创作于星期三“辅助性组装学说”v相对于“自组装”学说，认为蛋白质多肽链的正确折叠和组装需要其他蛋白质分子的帮助，分子伴侣与折叠酶一起，构成了两种重要的辅助折叠分子。第52页，讲稿共71张，创作于星期三折叠酶v折叠酶催化蛋白质折叠过程中共价键的异构化，主要有有PDI和PPI。vPPI，脯胺酰顺反异构酶vPDI，二硫键异构酶第53页，讲稿共71张，创作于星期三四、分子伴侣（四、分子伴侣（chaperone）许多蛋白质的多肽单体在离体条件下能折叠、组装成具有生物学功能的聚合体，但在体内绝大多数新生肽三维结构的形成，需要一类称为分子伴侣的辅助蛋白的存在。分子伴侣是能够结合和稳定

21、另外一种蛋白质的不稳定构象，并能通过有控制的结合和释放，促进新生多肽的折叠、多聚体的装配或降解及细胞器蛋白的跨膜运输等的一类蛋白。在动物、植物、细菌内广泛分布和存在，其功能是介导其它蛋白质的折叠和装配，而本身却不是最终功能蛋白质分子的组成部分。第54页，讲稿共71张，创作于星期三定义定义v一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能时的组份.第55页，讲稿共71张，创作于星期三分子伴侣的特征 从参与促进一个反应而本身不在最终产物中出现这一点来看，分子伴侣具有酶的特征。但从以下三方面来看，分子伴

22、侣和酶很不同。1、分子伴侣对靶蛋白没有高度专一性，同一分子伴侣可以促进多种氨基酸序列完全不同的多肽链折叠成为空间结构、性质和功能都不相关的蛋白质。2、它的催化效率很低。行使功能需要水解ATP，以改变其构象，释放底物，进行再循环。3、它和肽链折叠的关系，是阻止错误折叠，而不是促进正确折叠。4.多能性（胁迫保护防止交联聚沉，转运，调节转录和复制，组装细胞骨架）5.进化保守性第56页，讲稿共71张，创作于星期三分子伴侣的分类v伴侣素家族(Charperonin,Cpn)GroE(Hsp6 0)家族和 Tric家族v热休克蛋白 70家族(Hsp70)v热休克蛋白 90家族(Hsp90)v其它种类的分子

23、伴侣应应激激蛋蛋白白第57页，讲稿共71张，创作于星期三第58页，讲稿共71张，创作于星期三第59页，讲稿共71张，创作于星期三五、蛋白质折叠五、蛋白质折叠/去折叠的实验研究方法去折叠的实验研究方法vFast/Ultra fast mixingStopped-flow,quench flow,continuous flow,.vT-jumpelectrical-discharge-induced T-jumpLaser-induced T-jumpvOthersLaser flash photolysisMechanic unfolding第60页，讲稿共71张，创作于星期三Stopped-f

24、low第61页，讲稿共71张，创作于星期三典型停流实验结果典型停流实验结果第62页，讲稿共71张，创作于星期三Continuous-Flow第63页，讲稿共71张，创作于星期三时间分辨时间分辨CD第64页，讲稿共71张，创作于星期三Quench-flow H/D exchange第65页，讲稿共71张，创作于星期三第66页，讲稿共71张，创作于星期三T-jumpvMixingvElectrical-discharge-induced T-jumpvLaser-induced T-jump第67页，讲稿共71张，创作于星期三Rise 1-20C in 500 ns-10 s第68页，讲稿共71张，创作于星期三Laser-induced T-jumpInitiation of protein folding may be extended down to about 20 ps for a 10 kDa protein第69页，讲稿共71张，创作于星期三Laser flash photolysisPhotodissociation takes less than 100 femtoseconds!第70页，讲稿共71张，创作于星期三感感谢谢大大家家观观看看第71页，讲稿共71张，创作于星期三