荧光光谱的原理及应用精选PPT.ppt

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1、关于关于荧光光光光谱的原理及的原理及应用用第1页，讲稿共61张，创作于星期三2荧光荧光是指一种是指一种光致发光光致发光的冷发光现象。当的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线）照射，吸收光能后进入激发态，是紫外线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。为荧光

2、。第2页，讲稿共61张，创作于星期三3磷光磷光是一种缓慢发光的光致冷发光现象。当某种常温物质是一种缓慢发光的光致冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线）照射，吸收光能后经某种波长的入射光（通常是紫外线）照射，吸收光能后进入激发态（具有和基态不同的自旋多重度），然后缓慢进入激发态（具有和基态不同的自旋多重度），然后缓慢地退激发并发出比入射光的的波长长的出射光，而且与荧地退激发并发出比入射光的的波长长的出射光，而且与荧光过程不同，当入射光停止后，发光现象持续存在。发出光过程不同，当入射光停止后，发光现象持续存在。发出磷光的退激发过程是被量子力学的跃迁选择规则禁戒的，磷光的退激发

3、过程是被量子力学的跃迁选择规则禁戒的，因此这个过程很缓慢。因此这个过程很缓慢。第3页，讲稿共61张，创作于星期三4第4页，讲稿共61张，创作于星期三5第5页，讲稿共61张，创作于星期三6主要内容主要内容荧光光谱的基本原理荧光光谱的基本原理1荧光光谱仪的原理、操作及数据处理荧光光谱仪的原理、操作及数据处理2荧光光谱的应用荧光光谱的应用3参考资料参考资料4第6页，讲稿共61张，创作于星期三7荧光光谱的基本原理荧光光谱的基本原理第7页，讲稿共61张，创作于星期三8分子能级比原子能级复杂；分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；一、分子能

4、级与跃迁一、分子能级与跃迁激激发发：基基态态(S S0 0)激激发发态态(S S1 1、S S2 2激激发发态态振振动动能能级级)：吸吸收收特特定定频频率率的辐射；量子化；跃迁一次到位；的辐射；量子化；跃迁一次到位；失失活活：激激发发态态 基基态态：多多种种途途径径和和方方式式(见见能能级级图图)；速速度度最最快快、激发态寿命最短的途径占优势；激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、第一、第二、电子激发电子激发单重态单重态 S S1 1、S S2 2 ；第一、第二、第一、第二、电子激发电子激发三重态三重态 T T1 1、T T2 2 ；第8页，讲稿共61张，创作于星期三9电子激发态的多重度电子

5、激发态的多重度：M=2S+1S为电子自旋量子数的代数和为电子自旋量子数的代数和(0或或1)；电子激发态的多重度电子激发态的多重度单重态：单重态：一个分子中所有电子自旋都配对的电子状态。一个分子中所有电子自旋都配对的电子状态。三重态：三重态：有两个电子的自旋不配对而平行的状态。有两个电子的自旋不配对而平行的状态。激发三重态能量较激发单激发三重态能量较激发单重态低。重态低。第9页，讲稿共61张，创作于星期三10第10页，讲稿共61张，创作于星期三11跃迁规则跃迁规则 跃迁前后跃迁前后原子核的构型原子核的构型没有发生改变、跃迁过程中没有发生改变、跃迁过程中电子自旋电子自旋没有改变、没有改变、跃迁前后

6、跃迁前后电子的轨道电子的轨道在空间有较大的在空间有较大的重叠重叠和和轨道的对映性轨道的对映性发生了改变的发生了改变的跃迁是允许的；（跃迁是允许的；（S S0 0 S1允许跃迁）允许跃迁）跃迁过程中跃迁过程中电子自旋电子自旋发生了改变、跃迁前后发生了改变、跃迁前后电子的轨道电子的轨道在空间不在空间不重重叠叠或或轨道的对映性轨道的对映性未发生改变的跃迁是禁阻的。未发生改变的跃迁是禁阻的。（S S0 0 T T1 1禁阻跃迁）禁阻跃迁）Franck-Condon原理原理：在电子跃迁完成的瞬间，分子中在电子跃迁完成的瞬间，分子中原子核的构型原子核的构型是来不及改变的。是来不及改变的。第11页，讲稿共6

7、1张，创作于星期三12v 单重态能级间的跃迁符合光谱选律，跃迁概率大。分子通过吸收单重态能级间的跃迁符合光谱选律，跃迁概率大。分子通过吸收辐射而直接被激发到三重态的跃迁是辐射而直接被激发到三重态的跃迁是禁阻禁阻的，概率很小。的，概率很小。第12页，讲稿共61张，创作于星期三13雅布隆斯基分子能级图雅布隆斯基分子能级图S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜越内转换振动弛豫能量 2 1 3 外转换 2T2内转换振动弛豫S 2第13页，讲稿共61张，创作于星期三14 电电子子处处于于激激发发态态是是不不稳稳定定状状态态，容容易易返返回回基基态态，在在这这个个过过程程中中通通过过辐

8、辐射射跃跃迁迁(发发光光)和和无辐射跃迁无辐射跃迁等方式失去能量，这个过程就称为等方式失去能量，这个过程就称为失活失活。失活途径失活途径辐射跃迁荧光磷光内转换外转换系间窜越振动弛豫无辐射跃迁 激发态激发态停留时间短、返回速度快停留时间短、返回速度快的途径，发生的的途径，发生的几率大几率大。失活的途径失活的途径第14页，讲稿共61张，创作于星期三15 振动弛豫振动弛豫：同一：同一电子能级内以热量交换形式由高振动能级至低电子能级内以热量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间一般为相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间一般为10-12s。激激发态分子常常首先发生振动驰豫。

9、发态分子常常首先发生振动驰豫。无辐射跃迁失活的途径无辐射跃迁失活的途径通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。发单重态的最低振动能级。内转换内转换：多重度相同的电子能级中等能级间的无辐射能级跃迁。：多重度相同的电子能级中等能级间的无辐射能级跃迁。第15页，讲稿共61张，创作于星期三16无辐射跃迁失活的途径无辐射跃迁失活的途径系间窜越系间窜越：不同多重态，有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。：不同多重态，有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行轨道耦

10、合进行。含有重原子的含有重原子的分子中（如分子中（如I、Br等），系间窜跃最常见。等），系间窜跃最常见。外转换外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。第16页，讲稿共61张，创作于星期三17荧光发射荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态（基态（多为多为 S S1 1 S S0 0跃迁）跃迁），发射波长为，发射波长为 2 2的荧光；的荧光；1010-7-71010-9-9 s s。辐射跃迁失活

11、的途径辐射跃迁失活的途径磷光发射磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态（基态（多为多为 T T1 1 S S0 0跃迁）跃迁）；发射波长为；发射波长为 3 3 的磷光；的磷光；1010-4-4100 s 100 s。电子由电子由 S S0 0 进入进入 T T1 1 的可能过程：（的可能过程：（S S0 0 T T1 1禁阻跃迁）禁阻跃迁）S S0 0 激发激发振动弛豫振动弛豫内转换内转换系间窜越系间窜越振动弛豫振动弛豫T T1 1 发光速度很慢，光照停止后，可持续一段时间发光速度很慢，光照停止后，可持续一段时间。磷光仅在磷光仅在很低的温度或黏性介

12、质中才能观测到，因此磷光很少应用于分析很低的温度或黏性介质中才能观测到，因此磷光很少应用于分析 由图可见，由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；2 2 2 2 1 1；第17页，讲稿共61张，创作于星期三18 荧光产生的过程：荧光产生的过程：（1 1）处于基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照）处于基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到第一电子激发态的各个振动能级；射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到第一电子激发态的各个振动能级；（2 2）被激发到第一电子激发态的各

13、个振动能级的分子通过）被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子通过无辐射跃迁降落到第一电子激发态的最低振动能级；无辐射跃迁降落到第一电子激发态的最低振动能级；（3 3）降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降）降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降落到基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，这就是荧光：落到基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，这就是荧光：（4 4）到达基态的各个不同振动能级的分子再通过无辐射跃迁最后回到基态的最低振动能级）到达基态的各个不同振动能级的分子再通过无辐射跃迁最后回到基态的最低振动能级第18页，讲稿共61张，创作于星期三19荧光光谱

14、荧光光谱 固定激发光波长物质发射的荧光强度与发射固定激发光波长物质发射的荧光强度与发射光波长关系曲线，如右图中曲线光波长关系曲线，如右图中曲线II。荧光本身则是由电子在两能级间不发生自旋反荧光本身则是由电子在两能级间不发生自旋反转的辐射跃迁过程中所产生的光。转的辐射跃迁过程中所产生的光。磷光光谱磷光光谱 固定激发光波长物质发射的磷光强度与发射光固定激发光波长物质发射的磷光强度与发射光波长关系曲线，如右图中曲线波长关系曲线，如右图中曲线III。磷光本身则是由电子在两能级间发生自旋反磷光本身则是由电子在两能级间发生自旋反转的辐射跃迁过程中所产生的光。转的辐射跃迁过程中所产生的光。荧光光谱与磷光光谱

15、荧光光谱与磷光光谱第19页，讲稿共61张，创作于星期三20光谱图光谱图第20页，讲稿共61张，创作于星期三21激发光谱激发光谱 固定发射波长固定发射波长(一般将其固定于发射波段中感兴趣的峰位一般将其固定于发射波段中感兴趣的峰位)，扫描出的化合物，扫描出的化合物的的发射光强度发射光强度(荧光荧光/磷光磷光)与与入射光波长入射光波长的关系曲线。的关系曲线。二、主要光谱参量二、主要光谱参量发射光谱发射光谱 固定激发波长固定激发波长(一般将其固定于激发波段中感兴趣的峰位一般将其固定于激发波段中感兴趣的峰位)，扫描出的化，扫描出的化合物的合物的发射光强度发射光强度(荧光荧光/磷光磷光)与与入射光波长入射

16、光波长的关系曲线。的关系曲线。吸收光谱吸收光谱 化合物的化合物的吸收光强度吸收光强度与与入射光波长入射光波长的关系曲线的关系曲线。第21页，讲稿共61张，创作于星期三22主要光谱参量主要光谱参量 吸收光谱吸收光谱反映出的是物质的基态能级与激发态能级之间所有的允许跃迁。反映出的是物质的基态能级与激发态能级之间所有的允许跃迁。通常状态下的物质的通常状态下的物质的表观颜色表观颜色大部分时候取决于其大部分时候取决于其吸收特性吸收特性。激发光谱激发光谱则反映的是基态与所有与该荧光发射有关的能级之间的跃迁。其所呈则反映的是基态与所有与该荧光发射有关的能级之间的跃迁。其所呈现的关系比吸收光谱要有选择性，但有

17、时候又不如吸收光谱来的直接。现的关系比吸收光谱要有选择性，但有时候又不如吸收光谱来的直接。第22页，讲稿共61张，创作于星期三23激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系 a.Stokesa.Stokes位移位移 激激发发光光谱谱与与发发射射光光谱谱之之间间的的波波长长差差值值。荧荧光光的的波波长长总总是是大大于于激激发发光光的的波波长长。这这是是由由于于发发射射荧荧光光之之前前的的振振动动驰驰豫豫和和内内转转换换过过程程损损失失了一定的能量。了一定的能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电电子子跃跃迁迁到到不不同同激激发发态态能能级级，吸吸收收不不同同波

18、波长长的的能能量量(如如能能级级图图 2,1)，产产生生不不同同吸吸收收带带，但但均均回回到到第第一一激激发发单单重重态态的的最最低低振振动动能能级级再再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如如 2)。c.镜像规则镜像规则通通常常荧荧光光发发射射光光谱谱与与它它的的吸吸收收光光谱谱（与与激激发发光光谱谱形形状状一一样样）成成镜像对称关系。镜像对称关系。第23页，讲稿共61张，创作于星期三24产生斯托克位移的主要原因：产生斯托克位移的主要原因：1.1.跃迁到激发态高振动能级的激发态分子，首先以更快的速率发生跃迁到激发态高振动能级的激发态分子，首先以更快的速率发生振动

19、弛豫（其速率在振动弛豫（其速率在10101313/s/s数量级），散失部分能量，达到零振动数量级），散失部分能量，达到零振动能级，一般从零振动能级发射荧光；能级，一般从零振动能级发射荧光；2.2.激发态形成后，其分子的构型将很快进一步调整，以达到激发态的稳定构激发态形成后，其分子的构型将很快进一步调整，以达到激发态的稳定构型，这又损失了部分能量；型，这又损失了部分能量；3.3.发射荧光的激发态多为（发射荧光的激发态多为（，*）态，这种激发态较基态时有更大的）态，这种激发态较基态时有更大的极性，因此将在更大程度上为极性溶剂所稳定，使激发态的能量进一步降极性，因此将在更大程度上为极性溶剂所稳定，使

20、激发态的能量进一步降低。低。斯托克位移斯托克位移第24页，讲稿共61张，创作于星期三25v关于激发光的波长关于激发光的波长1 1：决定荧光物质是否能够产生吸收并发射出荧光；决定荧光物质是否能够产生吸收并发射出荧光；能够使荧光物质产生吸收并发射出荧光的激发光的波长并不具有唯一性；能够使荧光物质产生吸收并发射出荧光的激发光的波长并不具有唯一性；在保证激发的前提下，不同激发波长处的荧光发射光谱相同，但荧光强在保证激发的前提下，不同激发波长处的荧光发射光谱相同，但荧光强度不同。度不同。在进行荧光测定时，须选择激发光波长以保证荧光强度最大。在进行荧光测定时，须选择激发光波长以保证荧光强度最大。第25页，

21、讲稿共61张，创作于星期三26荧荧光光发发射射是是光光吸吸收收的的逆逆过过程程。荧荧光光发发射射光光谱谱与与吸吸收收光光谱谱有有类类似似镜镜影影的的关关系系。但但当当激激发发态态的的构构型型与与基基态态的的构构型型相相差差很很大大时时，荧荧光光发发射射光光谱谱将将明明显显不不同同于于该该化化合合物物的的吸吸收收光光谱。谱。镜像规则镜像规则第26页，讲稿共61张，创作于星期三27镜像规则的解释镜像规则的解释 基基态态上上的的各各振振动动能能级级分分布布与与第第一激发态上的各振动能级分布类似；一激发态上的各振动能级分布类似；基基态态上上的的零零振振动动能能级级与与第第一一激激发发态态的的零零振振动

22、动能能级级之之间间的的跃跃迁迁几几率率最最大大，相相反反跃跃迁也然。迁也然。第27页，讲稿共61张，创作于星期三28三、三、荧光的产生与分子结构的关系荧光的产生与分子结构的关系1.1.分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。）具有一定的荧光量子产率。第28页，讲稿共61张，创作于星期三291.1.化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光（1）跃跃迁迁类类型型：*的的荧荧光光效效率率高高，系系间间跨跨越越过过程程的的速速率率常常数数小，有利于荧光的产生；小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率

23、并产生红移）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚刚性性平平面面结结构构：可可降降低低分分子子振振动动，减减少少与与溶溶剂剂的的相相互互作作用用，故具有很强的荧光。故具有很强的荧光。（4）取代基效应：芳环）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。上有供电基，使荧光增强。第29页，讲稿共61张，创作于星期三30化合物化合物 相对荧光强度相对荧光强度 荧光波长荧光波长/nm/nmC6H6（苯）（苯）10 10 270310C6H5COOHC6H5NO230310390C6H5CH3C6H5OHC6H5OCH3C6H5NH2C6H5CN17182020202703202853652

24、85345310405280360C6H5ClC6H5BrC6H5I750275345290380第30页，讲稿共61张，创作于星期三31v物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（）表示：）表示：v与失活过程的速率常数与失活过程的速率常数k k有关：有关：凡凡是是使使荧荧光光速速率率常常数数k kf f增增大大而而使使其其他他失失活活过过程程（系系间间窜窜越越、外外转转换换、内内转转换换）的速率常数减小的因素（环境因素和结构因素）都可使荧光增强。的速率常数减小的因素（环境因素和结构因素）都可使荧光增强。2 2 荧光量子产率荧光量子产率第31页，讲稿共61张，

25、创作于星期三32四、影响荧光强度的外部因素1.溶剂的影响溶剂的影响溶剂极性增加，有时会使荧光强度增加，荧光波长红移。溶剂极性增加，有时会使荧光强度增加，荧光波长红移。若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧光物质电离状态改变，会使荧光强度、荧光波长改若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧光物质电离状态改变，会使荧光强度、荧光波长改变。变。含重原子的溶剂（碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱，磷光增强。含重原子的溶剂（碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱，磷光增强。溶剂溶剂粘度粘度减小时，可以增加分子间碰撞机会，使无辐射跃迁增加而荧光减弱。减小时，可以增加分子间碰撞机会，使无辐射跃迁增加而荧光减弱。故故荧光强度随溶剂粘度的减小而

26、减弱荧光强度随溶剂粘度的减小而减弱。由于温度对溶剂的粘度有影响，一般是温。由于温度对溶剂的粘度有影响，一般是温度上升，溶剂粘度变小，因此度上升，溶剂粘度变小，因此温度上升，荧光强度下降。温度上升，荧光强度下降。第32页，讲稿共61张，创作于星期三332.温度的影响温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，分子运动速度加快，分子间碰荧光强度对温度变化敏感，温度增加，分子运动速度加快，分子间碰撞的几率增加，外转换去活的几率增加，荧光效率降低。例如荧光素钠的撞的几率增加，外转换去活的几率增加，荧光效率降低。例如荧光素钠的乙醇溶液，在乙醇溶液，在0以下，温度每降低以下，温度每降低10，f增加增加3

27、，在，在 80时，时，f为为1。第33页，讲稿共61张，创作于星期三343 pH值的影响 含有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pH有关。pH的变化影响了荧光基团的电荷状态，从而使其荧光发生变化。化合物化合物 相对荧光强度相对荧光强度 C6H5OH18C6H5O0C6H5NH220C6H5NH3+0第34页，讲稿共61张，创作于星期三354.内滤光作用和自吸现象 自吸现象自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或

28、荧光物质发：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发 射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；第35页，讲稿共61张，创作于星期三365.荧光熄灭剂荧荧光光熄熄灭灭是是指指荧荧光光物物质质分分子子与与溶溶剂剂分分子子或或溶溶质质分分子子相相互互作作用用引引起起荧荧光光强强度度降降低低的的现现象象。引引起起荧荧光光熄熄灭灭的的物物质质称称为为荧荧光光熄熄灭灭剂剂(quenchingmedium)。如如卤卤素素离离子子、重重金金属属离离子子、氧氧分分子子以以及及硝硝基基化合物化合物、重氮化合物重氮化合物、羰基羰基和和羧基化合物羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。均为常见的荧光熄灭剂。

29、第36页，讲稿共61张，创作于星期三376、散射光、散射光 小部分光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向小部分光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射。不同角度散射。瑞利光：瑞利光：光子和物质发生弹性碰撞，不发生能量交换，只是光子光子和物质发生弹性碰撞，不发生能量交换，只是光子运动方向发生改变。其波长与入射光波长相同。运动方向发生改变。其波长与入射光波长相同。拉曼光：拉曼光：光子和物质发生弹性碰撞，发生能量交换，光子把部分能量转光子和物质发生弹性碰撞，发生能量交换，光子把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量。从而发射出比入射光稍长或移给物质分子或从物

30、质分子获得部分能量。从而发射出比入射光稍长或稍短的光。稍短的光。散射光对荧光测定有干扰，散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长的尤其是波长比入射光波长更长的拉曼光拉曼光，与荧光波长接近，对测定的干扰大，必须采取措施消除。，与荧光波长接近，对测定的干扰大，必须采取措施消除。拉曼拉曼光的干扰主要来自溶剂，当溶剂的拉曼光与被测物质的荧光光光的干扰主要来自溶剂，当溶剂的拉曼光与被测物质的荧光光谱相重叠时，应更换溶剂或改变激发光波长谱相重叠时，应更换溶剂或改变激发光波长第37页，讲稿共61张，创作于星期三38a:320nm或350nm为激发光，荧光峰总是在448nm。b:将空白溶剂分别在32

31、0nm及350nm激发光照射下测定荧光，激发光波长为320nm时，拉曼光波长是360nm，360nm的拉曼光对荧光无影响；当激发光波长为350nm时，拉曼光波长是400nm，400nm的拉曼光对荧光有干扰，因而影响测定结果。硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱第38页，讲稿共61张，创作于星期三39荧光光谱仪的原理、操作及数据处理荧光光谱仪的原理、操作及数据处理第39页，讲稿共61张，创作于星期三40荧光光谱仪的基本原理荧光光谱仪的基本原理特殊点：有两个单色器，光特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。源与检测器通常成直角。第40页，讲稿共61

32、张，创作于星期三41 光源：光源：高压氙灯发出的光线强度大，而且是连续光谱，通用性较好，但氙弧灯热高压氙灯发出的光线强度大，而且是连续光谱，通用性较好，但氙弧灯热效应大，稳定性较差，对电压稳定性要求较高。效应大，稳定性较差，对电压稳定性要求较高。高功率连续可调激光光源是一种新型荧光激发光源。激光的单色性好、强度大。高功率连续可调激光光源是一种新型荧光激发光源。激光的单色性好、强度大。激光光源近年来应用日益普遍。激光光源近年来应用日益普遍。第41页，讲稿共61张，创作于星期三42v单色器：单色器：第一单色器第一单色器选择激发光波长选择激发光波长1（250nm的紫外光），称为激的紫外光），称为激发

33、单色器。发单色器。第二单色器第二单色器选择选择(测量测量)发射光（荧光）波长发射光（荧光）波长2，与激发光入射与激发光入射方向垂直，称为荧光单色器。方向垂直，称为荧光单色器。v样品池：样品池：采用低荧光材料，通常为四面透光的石英池。v检测器：检测器：光电倍增管。光电倍增管。第42页，讲稿共61张，创作于星期三43液体液体样品准备样品准备1.1.溶液样品尽量使用溶液样品尽量使用透明的玻璃化溶液透明的玻璃化溶液，避免在这种汇聚式光路中由于比，避免在这种汇聚式光路中由于比色皿中溶液的前后吸收不均导致的光谱失真问题。色皿中溶液的前后吸收不均导致的光谱失真问题。2.2.为安全起见，对于使用挥为安全起见，

34、对于使用挥发性剧毒溶剂发性剧毒溶剂的测试，一定要有合适的的测试，一定要有合适的防护防护。3.3.易挥发、易变质易挥发、易变质的溶液最好的溶液最好现配现测现配现测。4.4.液体样品一般放在液体样品一般放在带盖石英比色皿带盖石英比色皿（与紫外测试所用比色皿不同，为侧面（与紫外测试所用比色皿不同，为侧面全透明型）全透明型）中进行测试。中进行测试。第43页，讲稿共61张，创作于星期三44测试准备测试准备 由于物质的发射特性和吸收特性是紧密相关的，所以提前做好吸收谱可以由于物质的发射特性和吸收特性是紧密相关的，所以提前做好吸收谱可以有效缩短荧光测试的摸索时间。有效缩短荧光测试的摸索时间。对于不知道相关特

35、性的样品，吸收谱的测试比荧光光谱的测试要容易对于不知道相关特性的样品，吸收谱的测试比荧光光谱的测试要容易很多。很多。所以，建议大家所以，建议大家先测一下样品的吸收谱，并从中找出感兴趣的吸收先测一下样品的吸收谱，并从中找出感兴趣的吸收峰和特性峰和特性，在荧光测试时以便参考。，在荧光测试时以便参考。第44页，讲稿共61张，创作于星期三45光谱测试光谱测试1.1.开机开机 2.2.电源电源灯源灯源2.2.荧光光谱荧光光谱 固定激发光的波长，固定激发光的波长，选择合适的荧光光谱波长范围、滤光片、光路狭缝、扫选择合适的荧光光谱波长范围、滤光片、光路狭缝、扫描速度等描速度等测量不同荧光波长处荧光的强度，得

36、到荧光光谱，即测量不同荧光波长处荧光的强度，得到荧光光谱，即荧光强度荧光强度荧光波长图荧光波长图。3.3.激发光谱激发光谱 在荧光最强的波长处固定荧光波长，在荧光最强的波长处固定荧光波长，选择合适的激发光谱波长范围、滤光片、选择合适的激发光谱波长范围、滤光片、光路狭缝、扫描速度等光路狭缝、扫描速度等测量随激发光波长的改变而变化的荧光强度，得到荧测量随激发光波长的改变而变化的荧光强度，得到荧光激发光谱。即光激发光谱。即荧光强度荧光强度-激发光波长图。激发光波长图。第45页，讲稿共61张，创作于星期三464.4.荧光光谱荧光光谱 在荧光最强的波长处固定激发波长，在荧光最强的波长处固定激发波长，选择

37、合适的荧光光谱波长范围、滤光片、选择合适的荧光光谱波长范围、滤光片、光路狭缝、扫描速度等进行发射谱的扫描。光路狭缝、扫描速度等进行发射谱的扫描。5.5.重复重复3 3、4 4步循环扫描得到理想的光谱图。步循环扫描得到理想的光谱图。7.7.关机关机 光源光源电源电源6.6.保存数据保存数据光谱测试光谱测试激发波长一定要小于发射波长激发波长一定要小于发射波长。第46页，讲稿共61张，创作于星期三47光路狭缝和扫描速度的选择光路狭缝和扫描速度的选择如果光路狭缝太大，荧光信号太强，容易超出仪器检测范围，损伤仪器；如果如果光路狭缝太大，荧光信号太强，容易超出仪器检测范围，损伤仪器；如果狭缝开的太小，荧光

38、信号又太弱，检测比较困难，所以要选择大小合适的狭缝。狭缝开的太小，荧光信号又太弱，检测比较困难，所以要选择大小合适的狭缝。如果扫描太快，容易跳峰，忽略特征性的峰信号；扫描太慢则浪费时间。所以如果扫描太快，容易跳峰，忽略特征性的峰信号；扫描太慢则浪费时间。所以只要能扫描得到平滑的光谱曲线就可以了。只要能扫描得到平滑的光谱曲线就可以了。第47页，讲稿共61张，创作于星期三48荧光光谱的应用荧光光谱的应用第48页，讲稿共61张，创作于星期三491.1.定量依据与方法定量依据与方法(1)定量依据定量依据 荧光强度荧光强度If正比于吸收的光量正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率和荧光量子效率：If=Ia由

39、朗伯由朗伯-比耳定律：比耳定律：Ia=I0(1-10-l c)If=I0(1-10-l c)=I0(1-e-2.3 l c)浓度很低时，将括号项近似处理后：浓度很低时，将括号项近似处理后：If=2.3 I0 l c=Kc第49页，讲稿共61张，创作于星期三50（2 2）定量方法）定量方法标准曲线法：标准曲线法：配配制制一一系系列列标标准准浓浓度度试试样样测测定定荧荧光光强强度度，绘绘制制标标准准曲曲线线，再再在在相相同同条条件件下下测测量量未未知知试试样样的的荧荧光光强强度度，在标准曲线上求出浓度；在标准曲线上求出浓度；比较法：比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；在线性范围内

40、，测定标样和试样的荧光强度，比较；第50页，讲稿共61张，创作于星期三512、荧光光谱的应用、荧光光谱的应用荧光探针荧光探针金属金属-有机配合物（有机配合物（MOF）发光材料发光材料分子传感器分子传感器物质的检测物质的检测稀土掺杂发光材料稀土掺杂发光材料发光器件发光器件光谱光谱第51页，讲稿共61张，创作于星期三52(1)(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采

41、用固体荧光法测定(2)(2)生物与有机化合物的分析生物与有机化合物的分析 见表 第52页，讲稿共61张，创作于星期三53第53页，讲稿共61张，创作于星期三54第54页，讲稿共61张，创作于星期三55与蛋白质或其他大分子结构与蛋白质或其他大分子结构非共价相互作用非共价相互作用而使一种或几种而使一种或几种荧荧光性质发生改变光性质发生改变的小分子物质。可用于研究大分子物质的性的小分子物质。可用于研究大分子物质的性质和行为。质和行为。荧光探针荧光探针目前常用的荧光探针有荧光素类探针、无机离子荧光探针、荧光量子点、分子信标目前常用的荧光探针有荧光素类探针、无机离子荧光探针、荧光量子点、分子信标等。等。

42、荧光探针除应用于核酸和蛋白质的定量分析外，在核酸染色、荧光探针除应用于核酸和蛋白质的定量分析外，在核酸染色、DNADNA电泳、核酸分子杂交、电泳、核酸分子杂交、定量定量PCRPCR技术以及技术以及DNADNA测序上都有着广泛的应用。测序上都有着广泛的应用。荧光探针：荧光探针：第55页，讲稿共61张，创作于星期三56荧光探针荧光探针过渡金属配合物过渡金属配合物很多能实现较强的红外波段宽带发射，可以有效很多能实现较强的红外波段宽带发射，可以有效避开组织体的吸收，可以穿透组织体实现红外成像，克服同位素避开组织体的吸收，可以穿透组织体实现红外成像，克服同位素原子示踪对人体的伤害；寿命处于原子示踪对人体

43、的伤害；寿命处于s s 量级，可以用于较大分量级，可以用于较大分子的形变和转动扩散研究，当然，结合其特有的发射波段也子的形变和转动扩散研究，当然，结合其特有的发射波段也能对活体环境中的许多扩散和转变过程进行研究。能对活体环境中的许多扩散和转变过程进行研究。第56页，讲稿共61张，创作于星期三57稀土离子稀土离子是一类核酸探针的检测试剂。是一类核酸探针的检测试剂。在水溶液中仅有在水溶液中仅有Tb()和和Eu()发出荧光，与发出荧光，与DNA配合后仍保留荧光性能，配合后仍保留荧光性能，可特异识别核苷酸。可特异识别核苷酸。Tb()和和Eu()与一些小分子配体配合，由于配体本身性质、中心离子与一些小分

44、子配体配合，由于配体本身性质、中心离子-配体成键及溶剂等因素影响，使配合物的激发态寿命达到配体成键及溶剂等因素影响，使配合物的激发态寿命达到ms级，并发出窄而强的级，并发出窄而强的荧光。荧光。Tb()和和Eu()与小分子的配合物探针通过共价键与靶与小分子的配合物探针通过共价键与靶DNA共价结合后共价结合后多用于实时定量荧光多用于实时定量荧光PCR反应产物的分析及杂交测试。反应产物的分析及杂交测试。该类探针要求稀土配合物易于合成并且足够稳定，同时荧光发射强度大。该类探针要求稀土配合物易于合成并且足够稳定，同时荧光发射强度大。Nurmi等用等用Tb()和和Eu()标记的探针进行实时同步扩增及前列腺

45、特异抗标记的探针进行实时同步扩增及前列腺特异抗原的测定，信噪比要高于传统的原的测定，信噪比要高于传统的TaqMan探针，而循环阈值则降低。探针，而循环阈值则降低。荧光探针荧光探针第57页，讲稿共61张，创作于星期三58量子点荧光探针量子点荧光探针是由是由-族和族和-族元素组成的半导体纳米颗族元素组成的半导体纳米颗粒，将核酸连接到量子点的表面，做成探针，通过体外杂交常粒，将核酸连接到量子点的表面，做成探针，通过体外杂交常规荧光规荧光(FISH)(FISH)分析，发现染色体的异常及变异，可取代一些有机分析，发现染色体的异常及变异，可取代一些有机荧光染料进行生物分子检测。研究较多的有荧光染料进行生物

46、分子检测。研究较多的有CdSeCdSe、CdTeCdTe、ZnS ZnS 等。等。荧光探针荧光探针第58页，讲稿共61张，创作于星期三59量子点探针量子点探针较传统的有机荧光染料具有一定的优越性：较传统的有机荧光染料具有一定的优越性：首先，荧光光谱范围宽，通过改变纳米晶体材料和尺寸，获得的激光诱导首先，荧光光谱范围宽，通过改变纳米晶体材料和尺寸，获得的激光诱导荧光光谱范围在荧光光谱范围在400nm400nm2m2m；其次，荧光光谱范围可调，稳定性好，荧光寿命长，且可用单一波长的激发光其次，荧光光谱范围可调，稳定性好，荧光寿命长，且可用单一波长的激发光源同时激发不同大小尺寸的量子点，得到不同荧光

47、发射波长的检测信号，相对源同时激发不同大小尺寸的量子点，得到不同荧光发射波长的检测信号，相对于有机荧光染料的单一光源激发得到单一荧光发射信号，降低了实验成本并简于有机荧光染料的单一光源激发得到单一荧光发射信号，降低了实验成本并简化了分析步骤。化了分析步骤。荧光探针荧光探针总之，量子点荧光探针用于生物荧光标记，是一个具有广阔应用前景的领域。总之，量子点荧光探针用于生物荧光标记，是一个具有广阔应用前景的领域。第59页，讲稿共61张，创作于星期三60利用荧光探针来研究高分子的链结构及高分子材料物化参数利用荧光探针来研究高分子的链结构及高分子材料物化参数通过荧光探针来研究高分子光化学与光物理问题通过荧

48、光探针来研究高分子光化学与光物理问题通过荧光探针研究高分子体系的聚合反应过程通过荧光探针研究高分子体系的聚合反应过程利用荧光探针研究特殊环境的物理化学性质利用荧光探针研究特殊环境的物理化学性质荧光探针法测定胶束，囊胞等特殊环境的微极性和微黏度荧光探针法测定胶束，囊胞等特殊环境的微极性和微黏度荧光探针法测定胶束的聚集数荧光探针法测定胶束的聚集数荧光探针研究高分子溶液的荧光探针研究高分子溶液的Sol-GelSol-Gel过程和凝胶化点的测定过程和凝胶化点的测定参考书目：高分子光化学导论参考书目：高分子光化学导论基础和应用基础和应用 吴世康著吴世康著 科学出版社科学出版社 2003-102003-10出版出版荧光探针技术在高分子科学中的应用荧光探针技术在高分子科学中的应用第60页，讲稿共61张，创作于星期三感感谢谢大大家家观观看看第61页，讲稿共61张，创作于星期三