蛋白质工程ppt精选PPT.ppt

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1、关于蛋白质工程关于蛋白质工程PPT课件课件第1页，讲稿共40张，创作于星期三本章目录本章目录l蛋白质工程的理论基础蛋白质工程的理论基础l蛋白质工程的理论基础蛋白质工程的理论基础l蛋白质结构测定与结构预测蛋白质结构测定与结构预测l蛋白质工程的关键技术蛋白质工程的关键技术l定点突变定点突变l定向进化定向进化l其他技术其他技术l蛋白质工程的应用及实例蛋白质工程的应用及实例l定点突变与蛋白质药物工程：胰岛素定点突变与蛋白质药物工程：胰岛素l定点突变、定向进化与工业用酶：枯草杆菌蛋白酶等定点突变、定向进化与工业用酶：枯草杆菌蛋白酶等l结构域的拼接与金属硫蛋白工程结构域的拼接与金属硫蛋白工程l抗体工程抗体

2、工程 第2页，讲稿共40张，创作于星期三第一节第一节 蛋白质工程的理论基础蛋白质工程的理论基础l蛋白质工程的概念蛋白质工程的概念l蛋白质的结构蛋白质的结构l蛋白质结构预测蛋白质结构预测第3页，讲稿共40张，创作于星期三一一 蛋白质工程的概念蛋白质工程的概念l基于对蛋白质结构和功能的认识，进行分子设计，通过基因工基于对蛋白质结构和功能的认识，进行分子设计，通过基因工程途径定向地改造蛋白质或创造合乎人类需要的新的突变蛋白程途径定向地改造蛋白质或创造合乎人类需要的新的突变蛋白质的理论或实践活动。质的理论或实践活动。（1 1）确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系；）确定蛋白质化学组成、空间

3、结构与生物功能之间的关系；（2 2）通过定点突变、定向进化等技术，合成具有特定氨基酸）通过定点突变、定向进化等技术，合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质。序列和空间结构的蛋白质。第4页，讲稿共40张，创作于星期三二二 蛋白质的结构蛋白质的结构l一级结构一级结构：多肽链的氨基酸残基的排列顺序：多肽链的氨基酸残基的排列顺序 l二级结构二级结构：多肽链借助于氢键或离子键沿一维方向排列成具有：多肽链借助于氢键或离子键沿一维方向排列成具有周期性结构的图象。周期性结构的图象。l三级结构：三级结构：指整个蛋白质多肽链在二级结构的基础上，侧链基指整个蛋白质多肽链在二级结构的基础上，侧链基团通过次级键或疏水

4、键的相互作用进一步盘曲折叠，形成具有团通过次级键或疏水键的相互作用进一步盘曲折叠，形成具有一定规则的空间结构一定规则的空间结构 。l四级结构四级结构：由两条以上的多肽链组成的蛋白质，多肽链之间没：由两条以上的多肽链组成的蛋白质，多肽链之间没有共价键连接而是借疏水作用等次级键缔合在一起形成的高级有共价键连接而是借疏水作用等次级键缔合在一起形成的高级空间结构空间结构 。第5页，讲稿共40张，创作于星期三第6页，讲稿共40张，创作于星期三氨基酸的聚合形成肽链氨基酸的聚合形成肽链氨基酸的聚合形成肽链氨基酸的聚合形成肽链第7页，讲稿共40张，创作于星期三肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元肽链的空间结构

5、单元肽链的空间结构单元:二硫键的折叠二硫键的折叠二硫键的折叠二硫键的折叠第8页，讲稿共40张，创作于星期三肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元 :氢键的折叠氢键的折叠氢键的折叠氢键的折叠第9页，讲稿共40张，创作于星期三肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元 :离子键的折叠离子键的折叠离子键的折叠离子键的折叠第10页，讲稿共40张，创作于星期三肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元ll每四个氨基酸残每四个氨基酸残每四个氨基酸残每四个氨基酸残基间的基间的基间的基间的ll氢键构成多肽氢键构成多肽

6、氢键构成多肽氢键构成多肽链链链链 a a a a 螺旋螺旋螺旋螺旋第11页，讲稿共40张，创作于星期三肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元ll由不同多肽链上由不同多肽链上由不同多肽链上由不同多肽链上氨基酸残基间的氨基酸残基间的氨基酸残基间的氨基酸残基间的氢键构成多肽链氢键构成多肽链氢键构成多肽链氢键构成多肽链 b b b b 折叠折叠折叠折叠第12页，讲稿共40张，创作于星期三肽链的完整空间构象肽链的完整空间构象肽链的完整空间构象肽链的完整空间构象第13页，讲稿共40张，创作于星期三第14页，讲稿共40张，创作于星期三蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的

7、关系l蛋白质一级结构是空间结构的基础，而空间结构决定了蛋蛋白质一级结构是空间结构的基础，而空间结构决定了蛋白质的功能。白质的功能。l结构域：结构域：蛋白质多肽链上一段在三维结构上可以明显区分和相蛋白质多肽链上一段在三维结构上可以明显区分和相对独立并具有一定生物学功能的基本单位。对独立并具有一定生物学功能的基本单位。l模体（基序）：模体（基序）：组成结构域的基本二级结构单位组成结构域的基本二级结构单位 第15页，讲稿共40张，创作于星期三蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰 :磷酸化修饰磷酸化修饰磷酸化修饰磷酸化修饰第16页，讲稿共40张，创作于星期三蛋白质的加工修饰

8、蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰:羧基化修饰羧基化修饰羧基化修饰羧基化修饰几种参与凝血的蛋白几种参与凝血的蛋白因子（如因子（如 VIII VIII 和和IVIV因子）需要在其因子）需要在其谷酰谷酰胺侧链上的胺侧链上的g-g-羧基羧基化修饰化修饰后，才能拥有后，才能拥有蛋白酶的活性，这一蛋白酶的活性，这一修饰过程依赖与修饰过程依赖与维生维生素素K K 的存在的存在。第17页，讲稿共40张，创作于星期三蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰:甲基化修饰甲基化修饰甲基化修饰甲基化修饰肌肌肉肉中中的的一一些些蛋蛋白白质质以以及及细细胞胞色色素素C C中中的的L

9、 Ly ys s会会受受到到单单甲甲基基和和二二甲甲基基化化修修饰饰；钙钙调调蛋蛋白白会会受受到到三三甲甲基基化化修修饰饰；所所有有C C末末端端以以G Gl lu u结结尾尾的的蛋蛋白白质质，其其G Gl lu u会会受到甲基化修饰。受到甲基化修饰。第18页，讲稿共40张，创作于星期三蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰:N-N-糖基化糖基化糖基化糖基化O-O-糖基化糖基化糖基化糖基化糖基化修饰糖基化修饰糖基化修饰糖基化修饰第19页，讲稿共40张，创作于星期三蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰:其它类型的修饰其它类型的修饰其它类型的修

10、饰其它类型的修饰第20页，讲稿共40张，创作于星期三三三 蛋白质的结构预测蛋白质的结构预测l一级结构：测序仪与数据库一级结构：测序仪与数据库l高级结构预测：高级结构预测：X X射线晶体衍射法射线晶体衍射法 核磁共振法（核磁共振法（NMRNMR）第21页，讲稿共40张，创作于星期三蛋白质一级序列数据库蛋白质一级序列数据库lPIR PIR：由国家生物医学研究基金会（由国家生物医学研究基金会（NBRFNBRF）建立）建立lMIPSMIPS：MartinsriedMartinsried的蛋白质序列研究所收集和处理的蛋白质序的蛋白质序列研究所收集和处理的蛋白质序列数据列数据lSWISS-PROTSWIS

11、S-PROT：蛋白质序列数据库，由蛋白质序列数据库，由GenevaGeneva大学和大学和EMBLEMBL共共同合作开发同合作开发 lTrEMBLTrEMBL：翻译的翻译的EMBL EMBL lNRL-3DNRL-3D：除序列信息外，也包括对二级结构，活性位点，结合除序列信息外，也包括对二级结构，活性位点，结合位点和修饰位点等信息。位点和修饰位点等信息。第22页，讲稿共40张，创作于星期三第二节第二节 蛋白质工程关键技术蛋白质工程关键技术l定点突变定点突变 l定向进化定向进化l其他技术其他技术第23页，讲稿共40张，创作于星期三一一 定点突变定点突变l寡核苷酸引物介导的定点突变寡核苷酸引物介导

12、的定点突变 lPCRPCR介导的定点突变介导的定点突变 l盒式突变盒式突变第24页，讲稿共40张，创作于星期三遗传信息传递的中心法则DNA（基因）DNA（基因）mRNA蛋白质生物代谢物质复制转录翻译代谢基因组学转录组学蛋白组学代谢组学逆转录中心法则中心法则第25页，讲稿共40张，创作于星期三1.1.寡核苷酸引物介导的定点突变寡核苷酸引物介导的定点突变l用含有用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动，在聚合酶的作用下启动DNADNA分子进行复制的过程分子进行复制的过程 l寡核苷酸引物介导的定点突变的寡核苷酸引物介导的定点突变的KunkelKunkel改

13、进改进 ：载体：载体：RFRFM13DNAM13DNA载体载体 菌株：菌株：dUTPdUTP酶和酶和N N尿嘧啶脱核苷酶双缺陷的菌株。尿嘧啶脱核苷酶双缺陷的菌株。原理：原理：dUTPdUTP酶缺陷导致胞内酶缺陷导致胞内dUTPdUTP上升，部分取代上升，部分取代dTTPdTTP进入新生进入新生DNADNA链中，使得链中，使得M13M13单链单链DNADNA大约大约1 1的的T T被被U U取代。另一链合成后，将取代。另一链合成后，将双链双链DNADNA导入正常大肠杆菌，导入正常大肠杆菌，N N尿嘧啶糖基化酶除去尿嘧啶糖基化酶除去DNADNA链上的尿嘧链上的尿嘧啶碱基，原啶碱基，原M13M13模

14、板链被降解，突变链因不含模板链被降解，突变链因不含U U被保留下来。被保留下来。第26页，讲稿共40张，创作于星期三第27页，讲稿共40张，创作于星期三 2.PCRPCR介导的定点突变介导的定点突变 第28页，讲稿共40张，创作于星期三第29页，讲稿共40张，创作于星期三3.3.盒式突变盒式突变l利用一段利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取，取代野生型基因中的相应序列。突变的寡核苷酸链成对存在，不会代野生型基因中的相应序列。突变的寡核苷酸链成对存在，不会出现异源双链的情况。全部转化质粒都是突变体。出现异源双链的情况。全部转化质粒都是突变体。第

15、30页，讲稿共40张，创作于星期三二、二、定向进化定向进化l先随机突变，再定向选择。先随机突变，再定向选择。如在待进化酶基因的如在待进化酶基因的PCRPCR扩增反应扩增反应中，利用中，利用TaqTaq酶不具有酶不具有3 35 5端纠错的功能，配合适当条件，以很端纠错的功能，配合适当条件，以很低的比率向目的基因引入突变，构建突变序列库，再凭借定向低的比率向目的基因引入突变，构建突变序列库，再凭借定向的选择方法，定向选出所需性质的突变酶。的选择方法，定向选出所需性质的突变酶。第31页，讲稿共40张，创作于星期三1.1.易错易错PCRPCRl在在PCRPCR反应中，降低反应中，降低一种一种dNTPd

16、NTP的含量的含量，使，使PCRPCR容易出错，达到容易出错，达到随机突变的目的。随机突变的目的。第32页，讲稿共40张，创作于星期三2.DNA2.DNA改组改组l用用DNAaseIDNAaseI 先将一个先将一个DNADNA片段消化成许多小片段，然后片段消化成许多小片段，然后不加引不加引物进行物进行PCRPCR，使得消化后，使得消化后DNADNA小段之间重新按多种组合方式连小段之间重新按多种组合方式连接重组，然后利用原来整片段接重组，然后利用原来整片段DNADNA两端的引物进行两端的引物进行加引物的加引物的PCRPCR扩增扩增，以便得到一系列改组后的突变，以便得到一系列改组后的突变DNADN

17、A序列。序列。第33页，讲稿共40张，创作于星期三3.3.体外随机引发重组体外随机引发重组l以以单链单链DNADNA为模板为模板，随机引物扩增，随机引物扩增，将产生大量与模板不同位将产生大量与模板不同位点互补的短的点互补的短的DNADNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短些短DNADNA片段中会存在一些点突变。片段中会存在一些点突变。第34页，讲稿共40张，创作于星期三第三节第三节 蛋白质工程的应用实例蛋白质工程的应用实例l胰岛素胰岛素l枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶 l金属硫蛋白金属硫蛋白 l抗体抗体第35页，讲稿共40张，创作于星期三1.1.1.1.胰岛

18、素的结构及其生物合成胰岛素的结构及其生物合成胰岛素的结构及其生物合成胰岛素的结构及其生物合成SSSSSSSSCCNNSSSSBB肽（肽（肽（肽（3030）CC肽（肽（肽（肽（3131）AA肽（肽（肽（肽（2121）RRRRRRKKSSSSSSSSCCNNSSSSNNCC高尔基体内的特异性肽酶高尔基体内的特异性肽酶高尔基体内的特异性肽酶高尔基体内的特异性肽酶NNllCCBB肽肽肽肽CC肽肽肽肽AA肽肽肽肽信号肽酶信号肽酶信号肽酶信号肽酶信号肽信号肽第36页，讲稿共40张，创作于星期三胰岛素的改建工程胰岛素的改建工程l速效胰岛素：速效胰岛素：Ser B9 Asp/Thr B27 GluSer B9

19、 Asp/Thr B27 Glu，有利于降低胰岛素的，有利于降低胰岛素的缔合作用，进入血液的吸收率比天然胰岛素提高了缔合作用，进入血液的吸收率比天然胰岛素提高了3 3倍。倍。l长效胰岛素：长效胰岛素：Asn A21 Gly/Thr B27 Arg/Thr B30 ThrAsn A21 Gly/Thr B27 Arg/Thr B30 Thr酰胺，酰胺，半衰期最长，达到半衰期最长，达到35.535.5小时。小时。l高效胰岛素高效胰岛素：His B10 Asp,His B10 Asp,活力是天然胰岛素的活力是天然胰岛素的11.711.7倍。倍。第37页，讲稿共40张，创作于星期三抗体抗体l抗体是一类

20、免疫球蛋白抗体是一类免疫球蛋白第38页，讲稿共40张，创作于星期三IgG基本结构重链重链（heavy chainheavy chain，H H）轻链轻链（light chainlight chain，L L）可变区（可变区（variable region,Vvariable region,V区）区）恒定区恒定区（constant region,Cconstant region,C区）区）骨架区骨架区（framework region,framework region,FRFR）铰链区铰链区（hinge regionhinge region）第39页，讲稿共40张，创作于星期三感感谢谢大大家家观观看看第40页，讲稿共40张，创作于星期三