生物芯片技术.ppt
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1、生物芯片技术(BIOCHIP TECHNOLOGY),研究历史(Research history),1991 Affymatrix公司Stephen Fodor:光刻与光化学技术、 多肽和寡聚核苷酸微阵列。DNA Chip概念 Stanford大学Brown实验室:预先合成,机械手阵列 1995 Schena等:基因表达谱 1996 Chee et al:DNA测序 1996 Cronin et al:突变检测 1996 Sapolsley & Lipshutz:基因图克隆 1996 Shalon et al:复杂DNA样本分析 1996 Shoemaker et al:缺省突变定量表型分析,
2、第十章 生物芯片技术,生物芯片(biochip)的概念 指采用光导原位合成或微量点样等方法,将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物的表面,组成密集二维分子排列,然后与已标记的待测生物样品中的靶分子杂交,通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析,从而判断样品中靶分子的数量。,根据生物分子之间特异性相互作用的原理,如DNA-DNA、DNA-RNA、抗原-抗体、受体-配体之间可发生的复性与特异性结合,设计一方为探针,并固定在微小的载体表面,通过分子之间的特性性反应,检测另外一方有无、多少或者结构改变等,生物芯片(Biochip或Bioa
3、rray)是指包被在固相载体上的高密度DNA、抗原、抗体、细胞或组织的微点阵(microarray)。 未来十年最具发展潜力的技术。,第十章 生物芯片技术,生物芯片的主要特点: 高通量、微型化和自动化 常用的生物芯片的分类: 基因芯片、蛋白质芯片及芯片实验室,特点,高度并行性:提高实验进程、利于显示图谱的快速对照和阅读。 多样性:可进行样品的多方面分析,提高精确性,减少误差。 微型化:减少试剂用量和反应液体积,提高样品浓度和反应速率。 自动化:降低成本,保证质量。,第十章 生物芯片技术,基因芯片(Genechip) 又称DNA芯片,是根据核酸杂交的原理,将大 量探针分子固定于支持物上,然后与标
4、记的样品 进行杂交,通过检测杂交信号的强度及分布来进 行分析。,第十章 生物芯片技术,2. 蛋白质芯片(proteinchip) 利用抗体与抗原特异性结合即免疫反应 的原理,将蛋白质分子(抗原或抗体)结合到固 相支持物上,形成蛋白质微阵列,即蛋白质芯片。,第十章 生物芯片技术,芯片实验室(labs-on-chip) 高度集成化的集样品制备、基因扩增、核酸标记及检测为一体的便携式生物分析系统。 实现生化分析全过程集成在一片芯片上完成,从而使生物分析过程自动化、连续化和微缩化。 芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。,其他分类方法(根据应用),基因变异检测芯片 疾病检测(如HIV、P53基因、结
5、核杆菌) 法医鉴定(如DNA指纹图谱) 表达谱芯片 肿瘤相关基因(正常与肿瘤组织表达差异) 药物筛选(培养细胞药物刺激前后表达差异) 发育(同一组织不同发育时期基因表达差异) 组织发生(不同组织或器官的基因表达差异),根据工艺和载体,1.原位合成法:密集程度高,可合成任意序列的寡聚核苷酸,但特异性较差,寡聚核苷酸合成长度有限,且随长度增加,合成错误率增高。成本较高,设计和制造较烦琐费时。,2.DNA微矩阵法:成本低,易操作,点样密度通常能满足需要。芯片的载体需表面紧质、光滑的固体,如硅,陶,玻璃等,DNA微矩阵芯片常用玻片为载体。,根据DNA成分,寡聚核苷酸或DNA片段:约2025个核苷酸碱基
6、,常用于基因类型的分析,如突变、正常变异(多态性)。 全部或部分cDNA:约5005000个核苷酸碱基,通常用于两种或以上样本的相关基因表达分析。,基因芯片的种类,Science Chip:生物分析和诊断 Nutri Chip: 食物分析、转基因、污染检测 Leuko Chip: 血液分析、病毒分析、HLA分析 Aqua Chip: 水质分析 Secure Chip:含DNA的物质鉴定 Chromo Chip:基因分析和染色体序列 Prokaryo Chip:原核生物、兽医、环保等,第十章 生物芯片技术,第二节 蛋白质芯片,第一节 DNA芯片,第一节 DNA芯片,第一节 DNA芯片,DNA芯片
7、技术包括四个主要步骤 芯片的设计与制备 样品制备 杂交反应和信号检测 结果分析,生物芯片技术主要环节,芯片制备:微点阵 样本制备:DNA提纯、扩增、标记 杂交:样本与互补模板形成双链 检测:共聚焦扫描,双色激光 数据处理:定量软件,数据库检索,RNA印迹等。 结果,第一节 DNA芯片,第一节 DNA芯片,二、样品的制备,三、杂交与结果分析,四、基因芯片技术在医学中的应用,一、芯片制备,一、芯片制备,基因芯片制备主要包括两个方面 探针的设计:根据应用目的不同,设计不同的固定于芯片上的探针。 探针在芯片上的布局:选择合适的方式将探针排布在芯片上。,一、芯片制备,(二)DNA芯片的制备,(一)探针的
8、设计,(一)探针的设计,表达型芯片探针的设计 不需要知道待测样品中靶基因的精确细节 序列的特异性应放在首要位置 单核苷酸多态性检测芯片探针的设计 等长移位设计法 特定突变位点探针的设计 叠瓦式策略,一、芯片制备,一、芯片制备,图102,(二)DNA芯片的制备,1载体选择与预处理 载体:用于连接、吸附或包埋各种生物分子并使其以固相化状态进行反应的固相材料。 载体材料:玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和聚丙烯膜等。 载体的化学处理:活化剂多聚赖氨酸 氨基硅烷偶联剂,一、芯片制备,2基因芯片制备 (1)原位合成(in situ synthesis) 光导原位合成法 原位喷印合成 分子印章多次压印合成
9、 (2)点样法,芯片制备,原位合成法(in situ synthesis):又可分为原位光控合成法和原位标准试剂合成法。适用于寡核苷酸,使用光引导化学原位合成技术。是目前制造高密度寡核苷酸最为成功的方法。,一、芯片制备,图103,合成后交联(post-synthetic attachment):利用手工或自动点样装置将预先制备好的寡核苷酸或cDNA样品点在经特殊处理过的玻片或其他材料上。主要用于诊断、检测病原体及其他特殊要求的中、低密度芯片的制备。,两种制备方法比较,原位合成:测序、查明点突变 高密度、根据已知的DNA编制程序 制作复杂、价格昂贵、不能测定未知DNA序列 合成后交联:比较分析
10、制备方式直接和简单,点样的样品可事先纯化, 交联方式多样,可设计和制备符合自己需要的芯 片。中、低密度,样品浪费较多且制备前需储存 大量样品。,二、样品的制备,样品的制备过程包括 核酸分子的纯化、扩增和标记,样本制备,制备高质量样本是困难的但又是极其重要的。制备细胞、组织或整个器官样本应特别小心。温度、激素和营养环境、遗传背景、组织成分等轻微改变都会使基因表达的结果发生明显变化。 用于基因类型分析的样本是DNA,用于表达研究的样本是cDNA。 样本制备后应进行标记,通常为酶标记、荧光标记和核素标记。,三、杂交与结果分析,(一)杂交反应:与传统的杂交方法类似 (二)杂交信号的检测:最常用荧光法
11、(三)数据分析:芯片杂交图谱的处理与存储由专 门设计的软件来完成。,杂交,是芯片技术中除方阵构建外最重要的一步 液相中探针与DNA片段按碱基配对规则形成双链反应。 选择杂交条件时,必须满足检测时的灵敏度和特异性。使能检测到低丰度基因,且能保证每条探针都能与互补模板杂交。 合适长度的DNA有利于与探针杂交。 温度、非特异性本底等均会影响杂交结果。 最好在封闭循环条件下杂交,杂交炉。,结果分析,芯片与标记的靶DNA或RNA杂交后,或与标记的靶抗原或抗体结合后,可采用下列方法分析处理数据: 共聚焦扫描仪:应用最广,重复性好但灵敏度较低。 质谱法:快速、精确,可准确判断是否存在基因突变和精确判断突变基
12、因的序列位置。探针合成较复杂。 化学发光、光导纤维、二极管方阵检测、直接电荷变化检测等。,芯片扫读装置,根据采用的光电偶合器件,分为光电倍增管型和CCD型。 根据激光光源,可分为激光型和非激光。 应用最为广泛的是激光光源的共聚焦扫描装置,分辨率、灵敏度极高,有良好的定位功能,可定量,应用广泛。,图象分析,复杂的杂交图谱一般需由图象分析软件来完成。 分析软件的功能:鉴定每个点阵、最大限度消除本底荧光的干扰、解析多种颜色图象、可标记或排除假阳性、识别和分析对照实验是否成功、可将信号标准化等。 图象处理软件必须具备提取基因库和数据库的能力。,四、基因芯片技术在医学中的应用,基因表达分析 基因型、基因
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