常用分子生物学技术原理以及应用.ppt

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1、目录关于常用分子生物学技术的原理及应用第一张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization and Blotting Technique第二张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)在在DNA复复性性过过程程中中，如如果果把把不不同同DNA单单链链分分子子放放在在同同一一溶溶液液中中，或或把把DNA与与RNA放放在在一一起起，只只要要在在DNA或或RNA的的单单链链分分子子之之间间有有一一定定的的碱碱基基配配对对关关系系，就就可可以

2、以在在不不同同的的分分子子之之间间形形成成杂杂化化双双链链(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理第三张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录复性复性RNADNA第四张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录（一）印迹技术（一）印迹技术利用各种利用各种物理物理方法使电泳胶中的生物方法使电泳胶中的生物大分子大分子转移转移到到NC等各种等各种膜膜上，使之成为上，使之成为固相化分子固相化分子。这一技术类。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。，译为印迹技术。

3、第五张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录用放射性核素、生物素或荧光染料用放射性核素、生物素或荧光染料标记标记其末其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针探针”，探针可以与固定在，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。断是否有同源的核酸分子存在。（二）探针技术（二）探针技术第六张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹印迹(Southern blotting)（二）（二）RNA印迹印迹(Northern blottin

4、g)（三）蛋白质的印迹（三）蛋白质的印迹(Western blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。、重组质粒和噬菌体的分析。用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。第七张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录其他：其他：斑点印迹斑点印迹(dot blotting)原位杂交原位杂交(in situ hybridization)DNA点阵点阵(DNA array)DNA芯片技术芯片技术(DNA chip)第八张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较

5、第九张，PPT共五十九页，创作于2022年6月分子杂交实验分子杂交实验第十张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录放放射射自自显显影影照照片片第十一张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录DNA芯片芯片技术技术第十二张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录PCR技术的原理与应用技术的原理与应用The Principle and Application of PCR Technology第十三张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA一、一、PCR技术的工作原

6、理技术的工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 第十四张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。第十五张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录PCR技术原理示意图技术原理示意图 第十六张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录 PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C第十七张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录模板模板DNA特异性引物特异性引物耐热耐热D

7、NA聚合酶聚合酶dNTPsMg2+PCR体系基本组成成分体系基本组成成分第十八张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录利利用用特特异异性性引引物物以以cDNA或或基基因因组组DNA为为模模板板获获得得已已知知目目的的基基因因片片段段,或或与与逆逆转转录录反反应应相相结结合合，直直接接以以组组织织和细胞的和细胞的mRNA为模板获得目的片段；为模板获得目的片段；利利用用简简并并引引物物从从cDNA文文库库或或基基因因组组文文库库中中获获得得序序列列相相似的基因片段；似的基因片段；利用随机引物从利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。文库或基因组文库中克隆基因。二、二、PCR技术技术

8、的主要用途的主要用途（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆第十九张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录利利用用PCR技技术术可可以以随随意意设设计计引引物物在在体体外外对对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。PCR技技术术高高度度敏敏感感，对对模模板板DNA的的量量要要求很低，是求很低，是DNA和和RNA微量分析的最好方法。微量分析的最好方法。（三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（二）基因突变（二）基因突变第二十张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录将将PCR技技术术引引入入DNA序序列列测测定定，使使测测序序工工作

9、作大为简化，也提高了测序的速度；大为简化，也提高了测序的速度；待待测测DNA片片段段既既可可克克隆隆到到特特定定的的载载体体后后进进行行序列测定，也可直接测定。序列测定，也可直接测定。PCR与与其其他他技技术术的的结结合合可可以以大大大大提提高高基基因因突突变检测的敏感性变检测的敏感性。（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析第二十一张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录逆转录逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将是将RNA的逆转录反应和的逆转录反应和PCR反应联合应用的一反应联合应用的一种技术。种技术。RT-

10、PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有进行定性及半定量分析的最有效方法。效方法。（一）逆转录（一）逆转录PCR技术技术三、几种重要的三、几种重要的PCR衍生技术衍生技术第二十二张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录原原位位PCR(in situ PCR)是是在在组组织织切切片片或或细细胞胞涂涂片片上上的的单单个个细细胞胞内内进进行行的的PCR反反应应，然然后后用用特特异异性性探探针针进进行行原原位位杂杂交交，即即可可检检出出待待测测DNA或或RNA是是否否在在该该组织或细胞中存在。组织或细胞

11、中存在。原原位位PCR方方法法弥弥补补了了PCR技技术术和和原原位位杂杂交交技技术术的的不不足足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。（二）原位（二）原位PCR技术技术第二十三张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录（三）实时（三）实时PCR技术技术实实时时PCR(real-time PCR)技技术术通通过过动动态态监监测测反反应应过过程程中中的的产产物物量量，消消除除了了产产物物堆堆积积对对定定量量分分析析的干扰，亦被称为定量的干扰，亦被称为定量PCR。第二十四张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录实时实时PCR技术原理技

12、术原理QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物荧光标记引物荧光标记引物RQ 3355第二十五张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录实时实时PCRPCR分类：分类：实时实时PRC非探针类非探针类探针类探针类1.TaqMan1.TaqMan探针法探针法 2.2.分子信标探针法分子信标探针法 3.FRET3.FRET探针法探针法 第二十六张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录图图20-3 TaqMan探针法实时探针法实时PCR原理示意图原理示意图第二十七张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录基因文库基因文库Gene Library第二十八张，PPT共五十九页，创作于202

13、2年6月目录基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)cDNA文库文库(cDNA library)基因文库基因文库(gene library)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列的序列的克隆群体。克隆群体。第二十九张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录一、基因组一、基因组DNA文库文库基因组基因组DNADNA文库是指生物的文库是指生物的基因组基因组DNA的信的信息（包括所有的编码区和非编码区）以息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形片段形式贮存的克隆群体。式贮存的克隆群体。用于构建基因组文库的载体有用于构建基因组文库

14、的载体有 噬菌体、粘粒噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。和酵母人工染色体等。第三十张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录基因组文库和基因组文库和cDNA文库的构建和筛选文库的构建和筛选第三十一张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录第一轮筛选第一轮筛选第二轮筛选第二轮筛选第三轮筛选第三轮筛选基因组文库筛选结果举例基因组文库筛选结果举例第三十二张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部下所表达的全部mRNAmRNA经逆转录而合成的经逆转录而合成的cDNA序列序列的克隆群体，它以的克隆群体，它以c

15、DNA片段的形式贮存着该片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。组织细胞的基因表达信息。二、二、cDNA文库文库第三十三张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录生物芯片技术生物芯片技术Biological Chip Technique第三十四张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录是指将许多特定的是指将许多特定的DNADNA片段有规律地紧密排列固片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点

16、的荧光信号做出检测、比较通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作称作DNA微阵列微阵列(DNA microarray)。一、基因芯片一、基因芯片基因芯片基因芯片(gene chip)第三十五张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录基因芯片工作流程示意图基因芯片工作流程示意图第三十六张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录是是将将高高度度密密集集排排列列的的蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定在在固固相相支支持持物物上上，当当与与待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时

17、，可可捕捕获获样样品品中中的的靶靶蛋蛋白白，再再经经检检测测系系统统对对靶靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片蛋白质分子间的亲和反应蛋白质分子间的亲和反应蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)蛋白质芯片蛋白质芯片作用原理作用原理第三十七张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录生物大分子相互作用研究技术生物大分子相互作用研究技术 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study第三十八张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录一、蛋白质相

18、互作用研究技术一、蛋白质相互作用研究技术酵母双杂交酵母双杂交各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选噬菌体显示系统筛选常用蛋白质相互作用的研究技术常用蛋白质相互作用的研究技术第三十九张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子标签融合蛋白结合实验主

19、要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。第四十张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录标签融合蛋标签融合蛋白沉淀实验白沉淀实验流程示意图流程示意图第四十一张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录（二）酵母双杂交技术的基本原理（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途和用途第四十二张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录酵母双杂交系统的应用酵母双杂交系统的应用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物证明两种已知基因

20、序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。信息学推测。分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。将拟研究的蛋白质的编码基因与将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为基因融合成为“诱饵诱饵”表达质粒，可以筛选表达质粒，可以筛选AD基因融合的基因融合的“猎猎物物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。第四十三张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录（三）免疫共沉淀技术的基本原理（三）免疫共沉淀技术的基本原理和用途和用途免疫沉淀（免疫沉

21、淀（immunoprecipitation IP）免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。利用抗体可免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来。与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来。免疫共沉淀（免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CO-IP）免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用相互作用的经典方法。是

22、确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。的有效方法。CO-IP与质谱分析与质谱分析 以细胞内源性靶蛋白为诱饵以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共沉用抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共沉淀纯化靶蛋白免疫复合物淀纯化靶蛋白免疫复合物，凝胶电泳分离后凝胶电泳分离后，质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白第四十四张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录免疫沉淀原理图解免疫沉淀原理图解第四十五张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录免疫共沉淀原理图解免疫共沉淀原理图解第四十六张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录免疫共沉淀原理图解免疫共

23、沉淀原理图解蛋白蛋白A，蛋白蛋白B 抗抗A抗体抗体C进行洗脱进行洗脱抗抗B抗体抗体D进行验证进行验证IP C ACO-IP C A+B D第四十七张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录CO-IPCO-IP与质谱分析流程与质谱分析流程第四十八张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录电电泳泳迁迁移移率率变变动动测测定定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或或称称凝凝胶胶迁迁移移变变动动实实验验(gel shift assay)最最初初用用于于研研究究DNA结结合合蛋蛋白白与与相相应应DNA序序列列间间的的相相互互作作用用，可可用用于于

24、定定性性和和定定量量分分析析，已已经经成成为为转转录录因因子子研研究究的的经经典典方方法法。目目前前这这一一技技术术也也被被用用于于研研究究RNA结结合合蛋蛋白白和和特特定定RNA序列间的相互作用。序列间的相互作用。二、二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定（一）电泳迁移率变动测定第四十九张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录放放射射自自显显影影未结合探针未结合探针结合有蛋白的探针结合有蛋白的探针标记探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物核蛋白提取物1X10X10X未标记探针未标记探针10X凝胶迁移实验结果示意图凝胶迁移实验结果示意图

25、第五十张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录染染 色色 质质 免免 疫疫 沉沉 淀淀 技技 术术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)是是目目前前可可以以研研究究体内体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。与蛋白质相互作用的主要方法。（二）染色质免疫沉淀法（二）染色质免疫沉淀法第五十一张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图第五十二张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录二、二、RNA-蛋白质相互作用分子分析技术蛋白质相互作用分子分析技术RNARNA结结 合合 蛋

26、蛋 白白 免免 疫疫 沉沉 淀淀（RNA RNA Binding Binding Protein Protein ImmunoprecipitationImmunoprecipitation，RIPRIP），是是研研究究细细胞胞内内RNARNA与与蛋蛋白白结结合合情情况的技术。况的技术。应用范围：应用范围：研究蛋白与研究蛋白与DNADNA动态作用动态作用研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达之间的关系研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达之间的关系研究蛋白与研究蛋白与RNARNA的相互作用的相互作用第五十三张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录激光共聚集显微镜应用技激光共聚集显微镜应用技术术L

27、aser Scanning Confocal Microscopy(LSCM)第五十四张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录激光经放大、分激光经放大、分光后由物镜聚焦光后由物镜聚焦于焦平面上，同于焦平面上，同时，焦平面上被时，焦平面上被激光扫描的点激光扫描的点F F所所发出的一定波长发出的一定波长的荧光通过检测的荧光通过检测针孔光栏达到检针孔光栏达到检测器，并成像于测器，并成像于显示器上，得到显示器上，得到相应的荧光图象。相应的荧光图象。激光共聚焦显微镜工作原理示意图激光共聚焦显微镜工作原理示意图第五十五张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录人眼及各类显微镜分辩率人眼及各类显微

28、镜分辩率人眼分辩率人眼分辩率 0.20mm光学显微镜分辩率光学显微镜分辩率 0.25um共焦显微镜分辩率共焦显微镜分辩率 0.18um电子显微镜分辩率电子显微镜分辩率 0.20nm激光共聚焦显微镜有四个荧光通道，一个透射光通激光共聚焦显微镜有四个荧光通道，一个透射光通道道第五十六张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录激光共聚焦显微镜的应用激光共聚焦显微镜的应用定位、定量定位、定量三维重组三维重组动态测量动态测量 活细胞或组织内游离活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化分布和浓度的变化 测量测量(Mg2+、Zn+、Na+、K+)自由基的检测自由基的检测 药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 蛋白质的转位蛋白质的转位活细胞内活细胞内H+浓度（浓度（pH值）的测量值）的测量线粒体膜电位的测量线粒体膜电位的测量荧光漂白恢复（荧光漂白恢复（FRAP）的测量）的测量笼锁解笼锁的测量笼锁解笼锁的测量荧光能量共振转移（荧光能量共振转移（FRET）的测量）的测量其他应用其他应用第五十七张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录第五十八张，PPT共五十九页，创作于2022年6月目录感谢大家观看第五十九张，PPT共五十九页，创作于2022年6月