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1、 中国农业科学院 博士后学位论文 苏云金芽孢杆菌 cry8Ca2 基因的活性分析及在转基因烟草中的表达苏云金芽孢杆菌 cry8Ca2 基因的活性分析及在转基因烟草中的表达 姓名：郎志宏 申请学位级别：博士后 专业：作物遗传育种学 指导教师：黄大昉 20050301 目 录 目 录 摘要 英文摘要 前言 6 1、苏云金芽孢杆菌-内毒素基因 6 1.1 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因的分类 6 1.2 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的结构 6 1.3 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的作用机理 7 2、地下害虫蛴螬的危害与防治 9 3、苏云金芽孢杆菌 cry8 类基因的研究 10 4、Bt 转基因植物的研究

2、进展 12 4.1 Bt 转基因植物概述 12 4.2 Bt 基因的改造 12 4.3 昆虫对 Bt 产生抗性的问题 13 5、本研究的目的意义 14 第一部分苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因 cry8Ca2 的活性研究 15 第一章 cry8Ca2 基因的随机突变分析 15 1.1 材料和方法 15 1.2 结果与分析 17 1.3 讨论 20 第二章 Cry8Ca2 蛋白活性区的研究 22 2.1 材料和方法 22 2.2 结果与分析：24 2.3 讨论 25 第二部分改造的 cry8Ca2 基因在转基因烟草中的表达 27 第三章 Bt cry8Ca2 基因的改造 27 3.1 材料与方法：

3、27 3.2 结果与分析 27 3.3 讨论 31 第四章烟草根特异性启动子的克隆和活性分析 32 4.1 材料和方法 32 4.2 结果与分析 35 4.3 讨论 38 第五章 mcry8Ca2 基因在转基因烟草中的活性分析 39 5.1 材料与方法 39 5.2 结果与分析 41 5.3 讨论 50 结论 51 参考文献 52 博士后期间发表的文章和申请专利 57 致谢 58 博士后出站工作报告苏云金芽抱杆菌c ry 8 基因的活性分析及在转基因烟草中的表达摘要 苏云金芽 抱杆菌c ry 8 类基因 对叶甲 科、金龟 科等 鞘翅目 害虫具有毒杀 作用。从菌株H B F-1 中克隆的c ry

4、 8 C基因与。ry 8 C a 1 基因 有一个氨基酸的差异，被国际B#杀虫晶 体 蛋白 基因 命 名 委员 会 命 名为c ry 8 C a 2 基因。本 研究 对c ry 8 C a 2 基因的活性做了进一步分析。利用随机突变方法，得到 3 5个不同的独立克隆，分别在 B t 无晶体突变株H D-7 3 一 中 表达，通过对铜绿丽金龟幼虫(蟒槽)的生物活性检测，得到两个杀虫活性明 显提高的 突 变体;序列 测定结果 表明 两 个突变体分别在第4 3 9 位的Q(G l n)突变为P(P r o)和第6 4 2 位E(G l u)突变为。(G l y)o 以c ry 8 C a 2 基因为

5、模板，通过P C R扩增得到九个不同 末端缺失的基因片段，构建到p E T 2 1 b 载体中，转化大肠杆菌B L 2 1(D E 3)，诱导表达，得到9 个末端缺失的蛋白:通过生 物活性 检测，确定C r y 8 C a 2 蛋白 对蟒蜡的 活性区 位于7 0-6 5 9个氨基酸之间。在上述研究的基础上，对编码C r y 8 C a 2 蛋白 的1-6 8 0 氨基酸的核普酸序列进行了 改 造和密 码子 优 化，使 其 在植 物中 高 效 表 达。优化的m c r y 8 C a 2(m o d i fi e dc ry 8 C a 2)与。y 8 C a 2 基因的核昔酸序列同 源性只有8

6、 6.8 8%,G 十 C含量也由 原来c ry 8 C a 2 基因的3 7%提高到4 6%.根据已 知基因序列设计引物，以 烟草基因组D N A为模板，利用P C R方法克隆了根部特异表达的启动子 T o b R B 7，与发表序列有 2个碱基的差异，T o b R B 7启动子与报告基因G U S 连接转化烟草，实验证明T o b R B 7 启动子可以驱动G U S基因在烟草根部特异表达。构建了 四 个植 物 表 达 载 体p B T m C N(根 特 异 性启 动子T o b R B 7:m c ry 8 C a基因)、p B S m C N(组成型 表达的 启 动子C a M V

7、 3 5 S:m c ry 8 C a 基因)、p B I 1 2 1 载体(C a M V 3 5 启动子:G U S 基因)和p B T G N(根特异性启动子T o b R B 7:G U S基因)，其中p B I 1 2 1 和p B T G N载 体作为阴 性对照，将四 个植物表达 载体转化 烟草，得到了转化植株。对转化植株进行 P C R检测，证明外源基因已 转入烟草基因 组中;W e s te rn b l o t 证明C ry 8 C a 2 蛋白 在 转 基因 烟草 植 株中 正 确 表 达。将转基因植株接入黄褐丽金龟幼虫和铜绿丽金龟幼虫进行生物活性检测，阴性对照植株被挤蜡明

8、显危害，转m c ry 8 C a 2 基因植株根部生长完好，发育正常，结果表明c r y 8 C a 2 基因可以 在转基因植株中表达并且对蟒蜡有毒杀作用，证明 利用转基因植物防治地下害虫蟒蜡是一个可行的途径。关键词:苏云金芽抱杆菌:c ry 8 C a 2 基因;随机突变;转基因烟草;蟒槽防治博士后出站工作报告苏云金芽 袍杆菌c r y 8 基因的活性分析及在转基因 烟草中的表达ABS T RACT T h e c r y 8-t y p e g e n e s fr o m B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s s t r a i n s w

9、 e r e t o x i c t o a n u m b e ro f C o l e o p t e r a n p e s t s s u c h a s l e a f b e e t l e s,s c a r a b s a n d s o o n.T h e c ry 8 C g e n e fr o m B ts t r a i n H B F-1 w a s c l o n e d a n d s e q u e n c e d.T h e r e w a s o n e a m i n o a c i d d i f f e r e n c e w i thc r y 8

10、 C a 1 g e n e fr o m B t s t r a i n B u i b u i a n d i t w as d e s i g n e d a s c r y 8 C a 2 g e n e(A Y 5 1 8 2 0 1)b y I n t e rn a t i o n a l B t I n s e c t i c i d a l P r o t e i n G e n e N o m e n c l a t u r a l C o m m i t t e e.T h e c r y 8 C a 2g e n e s i n s e c t i c i d a l a

11、 c t i v i t y w a s f u r th e r r e s e a r c h e d i n t h i s r e p o r t.Wi t h r a n d o m m u t a t i o n u s i n g P C R a m p l i fi c a t i o n m o r e t h a n 3 5 i n d iv i d u a l c l o n e sw e r e g o t t e n a n d t r a n s f e r r e d i n t o B t s t r a i n H D-7 3-.T h e e x p r e

12、 s s e d p r o t e i n s w e r ed e t e c t e d t h e i r i n s e c t i c id a l a c t i v i t y a g a i n s t A n o m a l a c o r p u l e n t a l a r v a e.T h e r e s u l ts h o w e d t h a t t h e t w o m u t a n t s h a d in c r e a s e d t h e ir t o x i c i t y t o A.c o rp u l e n t a l a r v

13、 a ec o m p a r e d w i t h w i l d t y p e.T h e s e q u e n c e a n a l y s i s i n d i c a t e d t h e m u t a t i o n s i t e s w e r eQ 4 3 9 t o P 4 3 9 a n d E 6 4 2 t o G 6 4 2 N i n e t r u n c a t e d C r y 8 C a 2 p r o t e i n s w e r e i n d u c e d i n E.c o l i B L 2 1(D E 3)c o n t a

14、 i n i n gn i n e d e l e t e d f r a g m e n t s fr o m c r y 8 C a 2 g e n e b y P C R m e t h o d.T h e r e s u l t s fr o m t h ea c t i v i t i e s o f n i n e t r u n c a t e d p r o t e i n s a g a i n s t A.c o r p u l e n t a l a r v a e s h o w e d t h e a c t i v i t yfr a g m e n t o f c

15、 r y 8 C a 2 g e n e t o x i c t o A.c o rp u l e n t a l a r v a e w as b e t w e e n 7 0-6 5 9 a min oa c i d s.T o i m p r o v e t h e C r y 8 C a 2 i n s e c t i c i d a l p r o t e i n e x p r e s s i o n i n t r a n s g e n i c p l a n t s,t h ec r y 8 C a 2 g e n e w a s m o d i f i e d w i t

16、 h p l a n t p r e f e r e n c e c o d o n u s a g e a n d m u t a t e d a t t w os i t e s,Q 4 3 9 t o P 4 3 9 a n d E 6 4 2 t o G 6 4 2.T h e m o d i f i e d c r y 8 C a 2 g e n e(m c r y 8 C a)h a s8 6.8 8%s im i l a r i t y w i t h c r y 8 C a 2 g e n e i n n u c l e i o d e a c i d s e q u e n

17、c e a n d t h e c o n t e n t o fG+C i n c r e a s e d fr o m 3 7%t o 4 6%.T h e r o o t-s p e c i fi c p r o mo t e rN C 8 9 u s i n g P C R a m p l i f i c a t i o n.T o b R B7 w a s c l o n e d fr o m Ni c o t i a n a t a b a c u m L.T h e n e w p r o mo t e r T o b R B 7 h a d 2 n t d i ff e r e

18、 n c e w i t ht h e s e q u e n c e w h i c h w as r e p o rt e df u s i o n a s s a y s h o w e d t h a t t h es p e c i fi c-e x p r e s s i o n i n r o o t t i s s u e.b y Y a m a m o t o e t a l.T h e p r o m o t e r-r e p o r te r g e n eT o b RB7p r o m o t e r d r o v e t h e G U S g e n e博士后

19、出站工作报告苏云金芽 抱杆菌c ry 8 基因的活性分析及在转基因 烟草中的 表达 T h e f o u r p l a n t e x p r e s s i o n c o n s t r u c t s,p B T m C N(T o b R B 7 p r o m o t e r:m c r y 8 C a 2g e n e)、p B S m C N(C a M V 3 5 S p r o m o t e r:m c ry 8 C a 2 g e n e),p B 1 1 2 1(C a M V 3 5p r o m o t e r:G U S g e n e)a n d p B T

20、 G N(T o b R B 7 p r o m o t e r:G U S g e n e),w e r e t r a n s f o r m e di n t o N i c o t i a n a t a b a c u m b y A g r o b a c t e r i u m t u m ef a c i e n s.P C R r e s u l t s v e r i f i e d t h ei n t e g r a t i o n o f t h e m c ry 8 C a 2 g e n e i n t o t h e h o s t g e n o m e o

21、f t o b a c c o t r a n s g e n i c p l a n t s.We s t e rn b l o t i n d i c a t e d t h a t t h e f o r e i g n C ry 8 C a 2 p r o t e i n w a s c o r r e c t l y e x p r e s s e d i nt h e s e t r a n s g e n i c t o b a c c o p l a n t s.B i o a s s a y r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e s

22、e t r a n s g e n i c t o b a c c o p l a n t s a r e h ig h l y t o x i c t o Ac o rp u l e n t a a n d A.e x o l e ta l a r v a e a n d l e s s e n t h e d a m a g e c a u s e d b y t h e i r f e e d i n g.T h e s er e s u l t s d e m o n s t r a t e th e f e as i b i l i t y o f u s i n g t r a n

23、 s g e n ic p l a n t t e c h n o l o g y t o c o n t r o l c r o pu n d e r g r o u n d p e s t s s u c h a s s c a r a b a e o i d a e l a r v a e.o r d s:t h u r i n g i e n s i s;g e n e;r a n d o m m u t a t i o n;t r a n s g e n i ct o b a c c o;s a r a b a e l a r v a e r e s i s t a n t博士后出站

24、工作报告前言前言1、苏云金芽抱杆菌6 一 内毒素基因 苏云金芽 抱杆菌(B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s，简称B t)是一 种分布广泛的 革兰氏阳性细菌，它在形成芽抱的同时，在菌体的一端或两端形成一个或多个具有生物活性的蛋白质性质的晶体称为6 一 内毒素(d e l t a-e n d o t o x i n)或杀虫晶体蛋白(I n s e c t i c i d a l C r y s t a l P r o t e in，简 称I C P)，编 码杀 虫晶 体 蛋白 的 基因 简 称c r y 基因。由于此类杀虫晶体蛋白对鳞翅目(L e p

25、 i d o p t e r a)、双翅目(D i p t e r a),鞘翅目(C o l e o p t e r a)、同 翅目(H o m o p t e r a)、膜翅目(H y m e n o p t e r a)、直翅目(O r th o p t e r a)等多种昆 虫，以 及线虫、原生动物和瞒类具有特异性毒杀作用，对人畜无害，不污染 环境，在农 业、林 业 害 虫防 治 上 得到了 广泛的 应用(S c h n e p f e t a l,1 9 9 8).1.1 苏云金芽抱杆菌杀虫晶体蛋白 基因的分类 S c h n e p f 和W h i t e l e y 在1 9 8

26、 1 年从苏云金芽 抱杆菌中 克隆了 第一个编码6 一 内毒素的c r y 基因c ry l A a l(S c h n e p f e t a l,1 9 8 1)，并于1 9 8 5 年发表了 它的 核 昔酸序列(S c h n e p f e t a l,1 9 8 5)，到目 前为止国际上已 发现和克隆了3 2 5 种B t 杀虫基因，其中c ry基因3 0 3 种，c y t 基因 有2 2 种。1 9 8 9 年H o ft e 和W h i t e l e y 根据基因 的 杀 虫活 性 和同 源 性 将克 隆 的4 2 种 基因 分 为5 群1 4 类(H o ft e&W h

27、 it e le y,1 9 8 9);1 9 9 5 年C r i c h m o r e 等人在第2 8 届国际无脊椎动物病理学会年会(S I P)上提出了新的分类系统(C r i c h m o r e e t a l,1 9 9 5)，该分类系统根据氨基酸序列的同源性而非内毒素的生物活性来确定其不同的分类等级，是一个开放的分类系统。同源性在 4 5%以下为第一等级，用阿拉伯数字表示;同源性在 4 5%-7 8%之间，为第二等级，用大写的 英文字母表示;同 源性在7 8%-9 5%之间为第三等级，用小写的英文字母表示;同源性在9 5%以上为第四等级，用阿拉伯数字表示。目前克 隆的3 2

28、5 种 基因 分 为4 8 个 类群(第 一等 级)、9 1 个 类 别(第 二等 级)和1 4 7个亚 类(第 三等 级)(H t t p:/w w w.b i o ls.s u s x.a c.u k/N e i l C ri c k m o r e/B t/in d e x.h tm l)o1 2苏云金穿抱杆菌杀虫晶体蛋白的结构 结构研究最多的是C ry l 晶 体蛋白，它们由1 1 0 0-1 2 0 0 个氨基酸组成，全长的晶体蛋白对毒性的发挥并不都是必需的。用胰蛋白酶处理晶体蛋白可切除 N末端的2 8-2 9 个氨基酸残基以及 C末端的第 6 0 0-1 1 5 0 个氨基酸残基，

29、形成6 0 k D a博士后出站工作报告曰 曰 一 月 口舌的毒素核心片段，而晶体蛋白的 C半段主要用于维持晶体蛋白的形成和防止伴胞晶体被溶解(Wh i t e l e y&S c h n e p f,1 9 8 6)在毒素蛋白核心区可分为三个结构域(d o m a i n).D o m a i n I是一簇由7 个疏水的a螺旋形成的结构，与靶标害虫肠道表皮细胞孔洞形成有关:D o m a i n l l 是三个反向 平行的p 折叠结构，主要参与与靶标昆 虫中 肠受体结合;D o m a i n I I I 是紧裹在一起的p 三夹心结构，可与昆 虫中 肠受体结合，其中C末端包裹在该结构中。通过

30、 对C r y 蛋白 的 氨基酸 序列比 较发 现，在 大多 数的C ry毒蛋白 核心区 有5 个保守的区域，对于分子量大于1 3 0 k D a 的杀虫晶体蛋白又有3 个共同的保守区(图1，H o ft e&W h i t e l e y,1 9 8 9;S c h n e p f e t a l,1 9 9 8)0 在D o m a i n I I 的p 折叠连接处，有一些称为l o o p 的结构，这些位点与受体结合密切相关，l o o p l.2.3 和a-8 的 个别位点突变后，杀虫活性变化很大(表1)0D o ma i nD o ma i n 1 1 D o ma i n 1 1

31、1C r y l AC r y 3 AC r y 4 AC r y 7 AC r y 8 AC r y 9 AC r y 1 0 AC r y 1 9 AC r y 2 0 AC r y 1 6 AC r y 1 7 A 图 1F i g.l P o s i t i o n sB t c r y 蛋白 的结构域和保守区 位置.o f c o n s e r v e d b l o c k s a n d d o m a i n s a m o n g C r y p r o t e i n s.表示保守区 序列1.3 苏云金芽抱杆菌杀虫晶体蛋白的作用机理 苏云金芽抱杆菌C ry蛋白 的作用机理

32、主要包括几个步骤:晶体在昆 虫中 肠的溶解;中 肠蛋白 酶对原毒素的消化;C ry蛋白 与昆 虫中 肠受体的结合;C r y 蛋白进入表皮膜形成离子通道或孔洞，最终导致昆虫死亡。G o m e z e t a l(2 0 0 2)认为博士后出站工作报告前言 表1 结构域I I 的l o o p 位点突变对C r y 蛋白活性影响E ff e c t o n C r y p r o t e i n s i n s e c t i c i d a l a c t i v i t y b y s i t e m u t a t i o n o f D o m a i n I I l o o p s基

33、因L o o p原序列突变序列昆虫参考文献朴sextasextasextasextasextaSextasextasextasextasextaL YRRI I LL YRRI I LAAAAAAA氨基酸 位置3 6 5-3 7 13 6 5-3 7 1毒性变化-1 0 0 0-1 0 0 0MM7口J、nMMMMM撇MM-1 9.6No n e-3.8一.5438439440441442443AAAAAAsGFsNs0y I A aC r y A a御 I A bC r y A bC r y J A bC r y A b0y J A bC t y l A bC r y l A cC r y

34、l A cC r y l A cC r y l A cC r y l A cC r y l A cC ry l A cC r y l A c0y 3 AS D F S 4 3 8 A4 1 1 0 0 04 3 8-4 4 1 1 0 0 04 3 9-4 414 4 0-4 41 1 0 0 0-3 3 34 3 8-4 4 1 -3 3.3M s e x t as 己 x t aMM4 3 9-4 4 1 -3 3 34 4 0-4 4 14 3 9-4 4 1-3 3.3-1 L1s ext aM.s e x t aQ叼QSQ口SQ卜5FfFfFFFP55555丫山Q行乙3 MQ G S

35、 R G4 8 1-4 8 6 +2.4 T.mo l i t o r L u e t a l,1 9 9 4 L u e t a l,1 9 9 4R a j a m o h a n e t a l,1 9 9 6R a j a m o h a n e t a l,1 9 9 6R a j a m o h a n e t a l,1 9 9 6R a j a m o h a n e t a l,1 9 9 6R a j a m o h a n e t a l,1 9 9 6R a j a m o h a n e t a l,1 9 9 6S m e d l e y D P e t a l,1

36、 9 9 6S m e d l e y D P e t a l,1 9 9 6S m e d l e y D P e t a l,1 9 9 6S m e d l e y D P e t a l,1 9 9 6S m e d l e y D P e t a l,1 9 9 6S m e d l e y D P e t a l,1 9 9 6S m e d l e y D P e t a l,1 9 9 6S m e d l e y D P e t a l,1 9 9 6 Wu e t a l,1 9 9 6原毒素的消化和受体结合是同时进行的，未完全活化的原毒素与受体结合进一步启动C ry蛋白的

37、活化和结合体的形成，最终在表皮膜形成孔洞。昆虫中肠内的胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶类将原毒素消化成活性毒素。C ry l A类原毒素首先被降解成6 5 k D a 的毒蛋白，进一步降 解成5 5-6 5 k D a 的毒蛋白 核 心(C h e s t u k h in a e t a l,1 9 8 2;C h o r n a e t a l,1 9 9 0).C ry l A 在 形 成毒蛋白 时 要 去除N末端的2 8 个氨基酸(B i e t l o t e t a l,1 9 8 9),C 末端的缺失在6 0 9 和6 3 0 之NJ(M a rt e n s e t a l,1 9 9

38、5;S t r i z h o v e t a l,1 9 9 6).C ry l C a 基因的胰蛋白 酶降 解核心区 在1 2 8-R 6 2 7 之(7，但要稳定表达仍需N端的2 7 个氨基酸(S t ri z h o v e t a l,1 9 9 6).C r y l I a 蛋白 的活性区 研究也比 较清楚，当C端的7 1 个氨基酸去除时，对欧洲玉米螟的活性保持 1 0 0%，但是继续缺失至 1 8 4 个氨基酸时，则活性完全丧失;但博士后出站工作报告口滋一 一月 U是用胰蛋白酶处理的核心毒素区(1 5 6-6 5 5 或6 5 9)的活性只有全长蛋白的2 0%,N端去除4 5 个

39、氨基酸时，可以保持 1 0 0%的活性，(S e k a r e t a l,1 9 9 7)0 C r y l A c 蛋白的N端2 8 个氨基酸残基去除后影响了 该蛋白 在B t 中 形成晶 体，但如 果 在大肠 杆菌中 表 达C ry l A。蛋白 使细胞生 长 延迟，可能是 缺失N端的 蛋白可以有效的与细胞膜结合，所以说 N端的去除是活性激活的重要步骤，并且也是毒性发挥的 关键步骤(B r a v o e t a l,2 0 0 2).研究者 认为C ry蛋白C末端与晶 体形 成有 关，并 且 起到了 稳定蛋白 结 构的作 用，与 蛋白 的 毒 性 发 挥没 有 作 用(P a r k

40、 e t a l,2 0 0 0).V a z q u e z-P a d r o n (2 0 0 4)在研究中 发现，在大肠杆菌中表达C ry l A b 的C 末端(P 6 0 6-E 1 1 5 6)蛋白时，诱导表达的蛋白质对宿主细胞产生毒性，并且可以产生类似B t 中产生的晶体结构，晶体的溶解性很差，所以C末端在晶体蛋白中的作用还需要进一步的研究。2、地下害虫蟒蜡的危害与防治 虫害是世界农作物减产的一个重要因素，平均每年损失粮食总产量的9%,直接经济损失达5 7 亿美元(J a m e s C,2 0 0 3)。金龟子属鞘翅目 金龟总科，金龟子的幼虫统称螃蟾。金龟子的许多种类是农作物

41、、果树、林木的重要害虫，是国内 外公认的难防治的土栖性害虫，其幼虫(挤蜡)危害植物的地下部分，是地下害虫中 最大的类群，也是危害最重、造成损失最大的种类。据调查统计，植物地下部分受害的8 6%是由蟒婚危害造成的。每年全国蟒蟾发生面积约1 亿亩，严重年 份曾 达3 亿2 千 万亩，产量损失 达2 0 9 0-4 0 9 6(魏鸿 均，1 9 8 5)0 金龟子(蟒蜡)大部分1 年发生1 代，少数2 年或3 年发生1 代，5 月下旬至 1 0 月下旬是各种金龟幼虫发生盛期，也是对作物危害的盛期。金龟子是杂食性害虫，食植性金龟如鳃金龟科、丽金龟科等，成虫危害植物的叶和花，幼虫危害植物的根、块茎和块根

42、，是危害植物的优势种。粪食性和腐食性的金龟子都不危害植物。金龟科地下害虫中以鳃金龟和丽金龟幼虫危害为主，其主要取食地下部分如萌发的种子、嫩根、残留种皮、根茎以及块根、块茎等，尤其喜嗜柔嫩多汁的根茎部分，致使幼苗枯萎而死。不同作物被害部位和特征不同，例如玉米，蟒蜡除取食萌动种子外，在幼苗出土前后还残存的种皮及根茎下部分;小麦刚播种后，A 嘈取食尚少，幼苗出 土后，须根比较发达，蟒蟾穴居须根周围，取食大量的须根，使小麦很快干枯死亡;蟒蜡取食花生时，常将幼嫩的果皮咬破取食果仁，或钻入幼嫩的果夹内取食，将果仁取食完转入另一果继续危害，严重影响了花生的品质，也为防治带来了很大困难。博士后出站工作报告前言

43、 早在 1 9 世纪就己经开始了金龟子的防治研究，但进展缓慢。直到二十世纪初，才逐渐引起广泛重视，目 前采用的是化学防治和生物防治技术，化学防治起着主导作用(姚庆学，2 0 0 3)。在早期的 化学防治中 主要使用有机氯药剂，但是此类药剂剧毒和高残留，直接危害人体健康，在七十年代利用有机磷药剂来替代，效果也非常明显，但是长期使用化学药剂导致金龟子抗药性增强、杀伤天敌、生态平衡破坏、害虫猖撅、环境污染等问题越来越突出，开发和利用新型农药势在必行，己 有新 型 药 剂 在 农 林 生 产 上 应 用(黄 应昆，2 0 0 1;郝 德 君，2 0 0 2)0 对金龟子的生物防治研究较早，早在1 8

44、0 9 年欧洲学者L i n k 发现卵抱白僵菌对金龟幼虫有寄生现象;1 8 9 7年俄国学者从奥国金龟(A n is o p l i a a u s t r i a c aH e r b s t)分离出绿僵菌，并进行防治小麦金龟子的 研究，开始了真菌防治害虫的序幕。1 9 9 2 年，O h b a 等人在世界上首次从B t 菌株中 筛选出 对金龟子幼虫具有特异杀 虫活性的 新B t 菌 株(B.t.s u b s p.J a p o n e n s is B u i B u i;O h b a e t a l,1 9 9 2)，在该菌株中克隆了c ry 8 C a 1 基因，利用克隆的晶体

45、蛋白 基因制成的生物制剂己 经用于草坪草金龟子幼虫的防治(A l m S R,1 9 9 7)。另外，利用天敌防治(We i X,1 9 9 5),病原线虫防治的研究也在进行中，但是生物防治见效慢、成本高、受环境条件约束严格，在实际生产应用比 较少。B t 转基因植物在抗食叶类害虫防治中的成功，为金龟子幼虫的防治提供了一个新的思路，培育抗V F 赠的转基因植物是一条值得探索的新的防治途径。3、苏云金芽抱杆菌c r y 8 类基因的研究 苏云金芽 抱杆菌c ry 8 类 基因 是对 鞘翅目 害 虫有特 异杀 虫活性的 基因，目 前克隆的c ry 8 类基因 有1 2 种，它们对金龟子科、象甲 科

46、、叶甲 科等多 种鞘翅目 害虫具有杀虫作用。1 9 9 2 年，O h b a 等人在 世界上首次 从B t 菌株中 筛选出 对金龟子幼虫具 有 特异杀 虫 活性的 新 菌 株(B.t.s u b s p.J a p o n e n s is B u i B u i)(O h b a M e t a l.,1 9 9 2);S u z u k i等对 B u i b u i 菌株的杀虫谱做了进一步的研究，主要对赤铜丽金龟、日 本金龟子等丽金龟科的害虫有毒杀作用(S u z u k i,1 9 9 2;S u z u k i,1 9 9 4);1 9 9 4 年，H o ri等证明菌株的毒性来自

47、细菌内的1 3 0 k D a 的蛋白 质，S a t。等从中克隆了一种新的杀虫基因。ry 8 C a 1(S a t o R e t a l.,1 9 9 4)，该基因已 经用于生物杀虫剂的开发 A lm S R,1 9 9 7)，但是还没有市场化。C ry 8 类基因由1 1 6 0-1 2 1 0 个氨基酸组成，分子量在1 2 8-1 3 7 k D a 之间(表2)。由 于c ry 8 类 基因 具有很大的 潜在 应用 价值，大 多 数基因都己 经申 请专利，美国M y c o g e n 公司分离的c ry 8 A a 1 和c ry 8 B a 1 对金龟科的多种害虫具有明显的杀虫

48、活性(M i c h a e l s e t a l,1 9 9 4);美国 杜邦公司克隆的c ry 8 B b 1,博士后出站工作报告前言基因 表2己 克 隆的。y 8 基因 和生 物活性T a b l e 2 B t c r y 8 g e n e s a n d t h e i r i n s e c t ic i d a l a c t i v it y分子量B t 菌株杀虫活性参考文献C ry8 A a lC ry 8 B a 1C ry8 B b 11 3 1.0 0US P 5 5 5 4 5 3 41 3 3.5 4k u m a mo t o e n s i s加ma m o

49、 t o e n s isUS P 5 5 5 4 5 3 4WO 0 2/3 4 7 7 4 A2WO 0 2/3 4 7 7 4 A2l36l37C ry8 C a l0y B C a 2C ry8 D a l0y 8 口 a 2C ry8 D a 3C ry8 E a l0y 8 F a 10y 8 6 口 了1 3 0.4 2j a p o n e n s i s B u i b u i1 3 0 51HBF-11 2 8.0 5B t g a l l e r i a e1 3 0.5 11 3 0.5 1BtBtBt 1 8 5 蟒槽 蟒婚 马铃薯甲虫西方玉米根叶甲南方玉米根叶甲 丽

50、金龟 丽金龟 大绿丽金龟 螃婚 蟒增 暗黑鳃金龟 US P 5 3 5 9 0 4 8 S o n g,e t a l.u n p u b l i s h e dJ P 2 0 0 2 0 4 5 1 8 6-AJ P 2 0 0 2 0 4 5 1 8 6-A/21 3 1.5 61 3 3.0 7Bt二 8 51 3 1.2 4HBF-1 8S o n g,e t a lS o n g,以a lS o n g,e t a lc ry 8 B c 1 基因对西方玉米根叶甲(W e s t e m c o m r o o tw o n n)具有显著杀虫效果(A b a de t a l,2 0