放线菌抗生素的发酵及目的产物的提取实验报告.pdf
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1、-放线菌抗生素的发酵及目的产物的提取一、实验目的1、熟悉掌握土壤中别离抗生素及培养方法2、了解和掌握种子制备和摇瓶发酵技术和方法3、了解抗生素发酵的一般规律和代谢调控理论4、了解小型发酵罐的根本构造5、熟悉掌握小型发酵罐的使用方法和保养6.掌握抗生素生物效价测定的原理和方法;7.掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。8.掌握放线菌次级代谢物的初步纯化及牛津杯实验的根本原理和操作技术二、实验原理发酵罐是进展液体发酵的特殊设备。生产上使用的发酵罐容积大,均用钢板或不锈钢板制成;供实验室使用的小型发酵罐,其容积可从约 lL 至数百升或稍大些。一般来说,5L 以下是用耐压玻璃制作罐体,5L 以上
2、用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器和各种电极,可以自动地调控试验所需要的培养条件,是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需的设备。抗生素antibiotics是由微生物包括细菌、真菌、放线菌属或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物,能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。现临床常用的抗生素有转基因工程菌培养液液中提取物以及用化学方法合.z.-成或半合成的化合物。放线菌发酵完毕后,次级代谢物可能与菌体结合,工业上常采用草酸或磷酸等酸化剂处理,释放与菌体结合的次级代谢物,并采用加热发酵液 70,2 min 使蛋白凝固,所得酸性滤液,在经碱处理,进一步
3、去除蛋白。抗生素的效价常采用微生物学方法测定,它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法,如管碟法。管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法,我国药典也采用此法。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用,比拟标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。管碟法的根本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管内径 6.00.l mm,外径 8.00.l mm,高 100.lmm,管内放人标准品和检品的溶液,经 1618 小时恒温培养,当抗生素在菌层培养基中扩散时,会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度,即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此,当抗生素
4、浓度到达或高于 MIC最低抑制浓度时,试验菌就被抑制而不能繁殖,从而呈现透明的无菌生长的区域,常呈圆形,称为抑菌圈。根据扩散定律的推导,抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系,比拟抗生素标准品与检品的抑菌圈大小,可计算出抗生素的效价。常用的管碟法有:一剂量法、二剂量法、三剂量法。后二法已经列入药典。二剂量法系将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例2:1 或 4:1的两种溶液,在同一平板上比拟其抗药活性,再根据.z.-抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。取含菌层的双层平板培养基,每个平板外表放置 4 个小钢管,管内分别放入供试品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液
5、。先测量出四点的抑菌圈直径,按以下公式计算出检品的效价。(1)求出 W 和 V:W=SH+UH-SL+UL(式 2.10-1)V=UH+UL-SH+SL(式 2.10-2)式中:UH:供试品高剂量之抑菌圈直径;UL:供试品低剂量之抑菌圈直径;SH:标准品高剂量之抑菌圈直径;SL:标准品低剂量之抑菌圈直径;(2)求出:=DantilogIV/W(式 2.10-3)式中:供试品和标准品的效价比;D:标准品高剂量与供试品高剂量之比,一般为 1I:上下剂量之比的对数,即 log2 或 log4。求出Pr:Pr=Ar(式 2.10-4)式中:Pr:供试品实际单位数;Ar:供试品标示量或估计单位甲醛滴定法
6、测定氨基氮含量:水溶液中的氨基酸为两性离子,因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。用甲醛处理氨基酸,甲醛与氨基结合,可形成羟甲基衍生物,使NH3+上的 H+游离出来,这样就可用碱滴定 NH3+放出的 H+,从而计算出氨基氮含量。如样品中只含.z.-有*一种氨基酸,由甲醛滴定的结果即可算出氨基氮的含量。如果样品是多种氨基酸的混合物如蛋白质水解物,则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。甲醛滴定法常用于测定蛋白质的水解程度,随着水解程度的增加,滴定值增加,当水解完全后,滴定值保持恒定。甲基红的变色范围是 PH4.46.2,意思是说:1.其 pH 值在 4.46.2 区间时,呈橙色,2.其 pH 值4.4
7、时,呈红色,因是靠近酸性强的一边时的颜色,故又称之为酸色。3.其 pH 值6.2 时,呈黄色,因是靠近碱性强的一边时的颜色,故又称之为碱色二、仪器与材料一培养基高氏一号培养基:高氏一号培养基:可溶性淀粉20.0gNaCl0.5gKNO3 1.0gK2HPO40.5gMgSO4.7H2O 0.5gFeSO4.7H2O0.01g蒸馏水 1000ml,PH 7.4,发酵瓶培养基:发酵瓶培养基:淀粉 3%,葡萄糖 2%,黄豆饼粉 2.5%,蛋白胨 0.5%,酵母粉 0.5%,MgSO40.1%,(NH4)2SO4 0.3%,KH2PO4,0.03%,CaCO3 0.4%,PH 6.0。黄豆饼粉 4g,
8、淀粉 10g,酵母粉 0.25 g,蛋白胨 1.5g,MgSO40.025 g,CaCO3 0.4g,(NH4)2SO40.3 g,.z.-淀粉酶105u/ml 0.01ml.可溶性淀粉 2.0g,NaCl 0.05g,KNO3 0.1g,K2HPO4 0.05g,MgSO4.7H2O 0.05g,FeSO4.7H2O0.001g,加蒸馏水至 100ml,PH 7.4,牛肉膏蛋白胨牛肉膏(5.0g,蛋白胨10.0g,NaCl5g,蒸馏水1000mL,pH 7.27.4发酵罐培养基发酵罐培养基(2L)(2L):黄豆饼粉80g淀粉200g酵母粉5 g蛋白胨30gMgSO40.5 gCaCO38g(
9、NH4)2SO46 g-淀粉酶105u/ml0.2ml二)流加补料碳源:碳源:葡萄糖10%300ml,控制 1%;2000*1%=20g,200ml氮源:氮源:硫酸铵10%250ml,控制 16%调调 PHPH 值:值:0.1MHCl0.1MNaOH三)分析指标及方法所用试剂及溶液测残糖-DNS 法1.3,5 二硝基水杨酸试剂DNS 试剂:将 6.3g 的 3,5 二硝基水杨酸和 2molNaOH 溶液加到 500ml 含有 182g 酒石酸钾钠的热水溶液中,再加5g 结晶苯酚和 5g 亚硫酸钠,搅拌溶解,冷却后加蒸馏水定容到 1000ml.z.-2.1.0mg/ml 葡萄糖溶液:称取 1g
10、葡萄糖,加蒸馏水定容到1L。3.6mol/l 氢氧化钠溶液:称取氢氧化钠 24g,加蒸馏水定容到100ml。4.6mol/l 的盐酸:取浓盐酸 49.68ml,加蒸馏水定容到 100ml。测残氮的方法-甲醛法1.甲基红:0.1g 甲基红,用 95%乙醇定容 100ml。2.0.3mol/LHCL:取浓盐酸 2.48ml,加蒸馏水定容到 100ml。3.0.02858mol/L NaOH:称 0.11432g,定容 100ml。4.1%酚酞指示剂:称取 1g 酚酞指示剂粉末。溶于 100ml 95%乙醇溶液中。5.95%乙醇:取乙醇 96ml,倒入 100ml 容量瓶中定容值 100ml。6.1
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