第三章液相色谱法PPT讲稿.ppt

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1、第三章 液相色谱法第1页，共87页，编辑于2022年，星期二2第2页，共87页，编辑于2022年，星期二3液相色谱仪（液相色谱仪（2 2）第3页，共87页，编辑于2022年，星期二4液相色谱仪（液相色谱仪（3 3）第4页，共87页，编辑于2022年，星期二5北京瑞利北京瑞利第5页，共87页，编辑于2022年，星期二6 3-1概述概述 高效液相色谱是在高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱气相色谱和经典色谱的的基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的色谱比

2、经典液相色谱有较高的效率效率 和实现了和实现了自自动化动化 操作。操作。高效液相色谱法是继气相色谱之后，高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术起来的一种以液体做流动相的新色谱技术.第6页，共87页，编辑于2022年，星期二7 7高效液相色谱高效液相色谱经典色谱经典色谱第7页，共87页，编辑于2022年，星期二8 经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法法引用了气相色谱的理论引用了气相色谱的理论，流动相改为高压

3、输送流动相改为高压输送（最（最高输送压力可达高输送压力可达4.5 107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、高高压、高速、高效或现代液相色谱法。效或

4、现代液相色谱法。第8页，共87页，编辑于2022年，星期二9 和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相固定相和流动相组成固定相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定吸附剂、化学键合固定相相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树离子交换树脂或多孔性凝胶；脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配吸附能力、分配系数、离子

5、交换作用或分子尺寸大小的差异进行分系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。离。3-1概述概述一、液相色谱分离原理及分类一、液相色谱分离原理及分类第9页，共87页，编辑于2022年，星期二10 液相色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）液相色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。3-13-1概述概述 根据分离机制不同，液相色谱可分为：根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸液固吸附色谱、液液分配色谱、化合键合色谱、离

6、子交换附色谱、液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。色谱以及分子排阻色谱等类型。第10页，共87页，编辑于2022年，星期二11二、液相色谱与气相色谱的比较二、液相色谱与气相色谱的比较 液相色谱所用液相色谱所用基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。分离度、选择性等与气相色谱一致。液相色谱所用液相色谱所用基本基本理论：塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。理论：塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。但但由于在液相色谱中以由于在液相色谱中以液体液体代替气相色谱中的代替气相色谱中的气体气体作为流作为流动相

7、，而液体和气体的性质不相同；此外，液相色谱所用动相，而液体和气体的性质不相同；此外，液相色谱所用的的仪器设备和操作条件仪器设备和操作条件也与气相色谱不同，所以，液相也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别，主要有以下几方面：色谱与气相色谱有一定差别，主要有以下几方面：第11页，共87页，编辑于2022年，星期二12 气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使

8、其应用受到一定程度的限制，较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，据统计据统计只有大约只有大约20%的有机物能用气相色谱分析的有机物能用气相色谱分析；液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机占有机物的物的70 80%。二、液相色谱与气相色谱的比较二、液相色谱与气相色谱的比较（1）应用范围不同）应用范围不同第12页，共87页，编辑于2022年，星期二13 因为：因为

9、：气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。只与固定相相互作用。而而在液相色谱中流动相液在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以上也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。的液体作流动相，增大分离的选择性。二、液相色谱与气相色谱的比较二、液相色谱与气相色谱的比较（2 2）液相色谱能完成难度较高的分离工作）液相色谱

10、能完成难度较高的分离工作第13页，共87页，编辑于2022年，星期二14液相色谱固定相类型多液相色谱固定相类型多,如如离子交换色谱离子交换色谱和排阻色谱和排阻色谱等，作为分析时选择余地等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。大；而气相色谱并不可能的。液相色谱通常在室温下操作，较低的温液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。度，一般有利于色谱分离条件的选择。二、液相色谱与气相色谱的比较二、液相色谱与气相色谱的比较第14页，共87页，编辑于2022年，星期二15（3 3）由于液体的扩散系数比气体的小）由于液体的扩散系数比气体的小10105 5倍，因此，倍，因此，

11、溶质在液相中的传质速率慢，溶质在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特柱外效应就显得特别重要别重要；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。不计。（4 4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，容易，而且回收是定量的，适合于大量制备适合于大量制备。液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。补充的。二、液相色谱与气相色谱的比较二、液相色谱与气相色谱的比较第15

12、页，共87页，编辑于2022年，星期二16 综上所述，高效液相色谱法具有综上所述，高效液相色谱法具有高柱效、高选择高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。等优点。该法已成为现代分析技术的重要手段之一，目该法已成为现代分析技术的重要手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、环保、农业等科学领域前在化学、化工、医药、生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。获得广泛的应用。3-1概述概述第16页，共87页，编辑于2022年，星期二17332 2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪第17页，共87页，编辑于2022年，星期二18332

13、 2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 高效液相色谱仪的结构示意见图，一般可分为高效液相色谱仪的结构示意见图，一般可分为4 4个主要个主要部分：部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将样及数据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相经过进样器送入色谱柱，然后从控贮液器中流动相经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入待分离的样品时，流经进制器的出口流出。当注入待分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同

14、时带入色谱柱进行分样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。第18页，共87页，编辑于2022年，星期二19贮液器贮液器高压泵高压泵检测器检测器梯度淋梯度淋洗装置洗装置色谱柱色谱柱压力表压力表进样器进样器馏分馏分收集器收集器高压输液系统，进样系统，分高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统离系统和检测系统第19页，共87页，编辑于2022年，星期二20高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统高压输液系统，进样系统，分离系统

15、和检测系统第20页，共87页，编辑于2022年，星期二21第21页，共87页，编辑于2022年，星期二22 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是仪器最重要的部件：须配备有高压输液系统。它是仪器最重要的部件：由储液罐、由储液罐、高压输液泵高压输液泵*、过滤器、压力脉动阻力过滤器、压力脉动阻力器等组成。器等组成。对高压输液泵的要求：对高压输液泵的要求：密封性好，输出流量恒密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及定，压力平稳，可

16、调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。耐腐蚀等要求。1.1.高压输液系统高压输液系统 332 2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪第22页，共87页，编辑于2022年，星期二23 常用的输液泵分为常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵恒流泵和恒压泵两种。两种。32 高效液相色谱仪高效液相色谱仪恒流泵恒流泵特点是在一定操作条件下，特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定输出流量保持恒定而而与色谱柱引起阻力变化无关；与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵恒压泵是指能保持是指能保持输出压力恒定，输出压力恒定，但其流量则随色谱系但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差统阻力而变化，故保留时间的重现性差它

17、们各有优缺点。目前恒流泵比恒压泵优越，使用较普遍它们各有优缺点。目前恒流泵比恒压泵优越，使用较普遍恒流泵分机械注射泵和恒流泵分机械注射泵和机械往复泵机械往复泵*两种两种第23页，共87页，编辑于2022年，星期二24高压输液泵：高压输液泵：主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150450105 Pa。为为了了获获得得高高柱柱效效而而使使用用粒粒度度很很小小的的固固定定相相（10m），液液体体的的流流动动相相高高速速通通过过时时，将将产产生生很很高高的的压压力力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。第24页，共87页，编辑于2022年，星期二252

18、进样系统进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约（约5-30cm5-30cm），所以柱外展宽（又称柱），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括外的因素所引起的峰展宽，主要包括进进样系统、连接管道及检测器中存在死体样系统、连接管道及检测器中存在死体积积。进样系统是引起柱前展宽的主要因。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此素，因此高效液相色谱法中对进样技术高效液相色谱法中对进样技术要求较严。要求较严。第25页，共87页，编辑于2022年，星期二26 流路中为高压力工作状态，流路

19、中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：其结构如图所示：第26页，共87页，编辑于2022年，星期二27准备状态准备状态进样状态进样状态流动相入口流动相入口色谱柱入口色谱柱入口样品出口样品出口样品入口样品入口流动相入口流动相入口色谱柱入口色谱柱入口样品环样品环第27页，共87页，编辑于2022年，星期二283 3 分离系统分离系统色谱柱色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定柱管与固定相相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚

20、合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长一般色谱柱长530cm，内径为，内径为45mm。一般在分离前备有一个一般在分离前备有一个前置柱前置柱，前置柱内填充物和分离柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技术的性能不受影响。离技术的性能不受影响。第28页，共87页，编辑于2022年，星期二29 柱子装填得好坏对柱效影响很大。对

21、于细粒度柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（的填料（20m）一般采用匀浆填充法装柱，先）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。备用。对色谱柱的要求：柱效高，选择性好，分析速对色谱柱的要求：柱效高，选择性好，分析速度快等。度快等。第29页，共87页，编辑于2022年，星期二30第30页，共87页，编辑于2022年，星期二31使用色谱柱注意事项：使用色谱柱注意事项：1 1 溶剂要脱气，溶剂和样品应过滤，溶剂要脱气，溶剂和样品应

22、过滤，防止堵塞。防止堵塞。2 2 加前置柱。加前置柱。3 3 更换流动相要渐变。更换流动相要渐变。4 4 用后要保护好。用后要保护好。第31页，共87页，编辑于2022年，星期二324检测系统检测系统 HPLC与与GC一样，要求检测器灵敏度高，重现性好，一样，要求检测器灵敏度高，重现性好，定量准确，对温度和流速的变化不敏感，应用范围广，线定量准确，对温度和流速的变化不敏感，应用范围广，线性范围宽等优点性范围宽等优点 检测器分为两大类：一类是检测器分为两大类：一类是溶质性检测器溶质性检测器，它仅对它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测

23、器的有的有紫外、荧光、电化学检测器紫外、荧光、电化学检测器等。等。另一类是另一类是总体检测器总体检测器，它对试样和洗脱液总的物它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示示差折光，差折光，电导检测器电导检测器等。现将常用的检测器介绍如下等。现将常用的检测器介绍如下:第32页，共87页，编辑于2022年，星期二33HPLCHPLC中应用最广泛的检测器。它的原理基于待测中应用最广泛的检测器。它的原理基于待测组分对特定波长的紫外或可见光的选择性吸收，试组分对特定波长的紫外或可见光的选择性吸收，试样浓度与吸光度的关系服从朗伯样浓度与吸光度的关系服

24、从朗伯-比尔定律。比尔定律。高效液相色谱检测器：高效液相色谱检测器：（1 1）紫外光度检测器（紫外光度检测器（UVUV）优点：灵敏度高，选择性好，对流量和温度的变化不优点：灵敏度高，选择性好，对流量和温度的变化不敏感，适用于梯度淋洗，线性范围宽，适用于痕量分敏感，适用于梯度淋洗，线性范围宽，适用于痕量分析。最小检测量析。最小检测量1010-9-9gmLgmL-1-1。第33页，共87页，编辑于2022年，星期二34高效液相色谱检测器：高效液相色谱检测器：（1）紫外光度检测器紫外光度检测器（UV）缺点：只适用于检测能吸收紫外、可见光的物质，缺点：只适用于检测能吸收紫外、可见光的物质，流动相选择受

25、限制。要求流动相在测定波长下无吸流动相选择受限制。要求流动相在测定波长下无吸收。收。第34页，共87页，编辑于2022年，星期二35光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光光电电二二极极管管阵阵列列检检测测器器：1024个个二二极极管管阵阵列列，各各检检测测特特定定波波长长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。第35页，共87页，编辑于2022年，星期二36 检测器是一种通用型检测器。它的作用原理是检测器是一种通用型检测器。它的作用原理是纯流动纯流动相与包含样品的流动相之间的折射率不同相与包含样品的流动相之间的折射率不同，检测，检测器把这种差值检测

26、出来，给出信号，信号的大小器把这种差值检测出来，给出信号，信号的大小与样品含量成正比。与样品含量成正比。纯流动相与待测组分的折射率相差越大，检测器灵纯流动相与待测组分的折射率相差越大，检测器灵敏度越高，灵敏度可达敏度越高，灵敏度可达1010-7-7gcmgcm-3-3。通用性强，不破坏样品，线性范围宽。主要缺点是通用性强，不破坏样品，线性范围宽。主要缺点是灵敏度低，不适宜痕量分析。对温度变化敏感，并灵敏度低，不适宜痕量分析。对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。且不能用于梯度淋洗。（3 3）荧光检测器）荧光检测器（4 4）电导检测器）电导检测器 （2 2）示差折光率检测器）示差折光率检测器第3

27、6页，共87页，编辑于2022年，星期二37 它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置压液相色谱仪中尤为重要的附属装置.HPLCHPLC梯度淋洗与梯度淋洗与GCGC中的程序升温一样。中的程序升温一样。对于某些复杂样品，组分的对于某些复杂样品，组分的kk范围很宽，用一种强范围很宽，用一种强度的溶剂淋洗时不能得到很好的分离，采用梯度淋洗。度的溶剂淋洗时不能得到很好的分离，采用梯度淋洗。就就是组成流动相的两种或两种以上不同的溶剂按一定程序

28、是组成流动相的两种或两种以上不同的溶剂按一定程序改变配比、极性、改变配比、极性、pHpH、离子强度、通过流动相极性的变、离子强度、通过流动相极性的变化来改变待分离样品的选择因子和化来改变待分离样品的选择因子和t tR R，提高分离效果和，提高分离效果和分析速度。分析速度。5、附属系统、附属系统第37页，共87页，编辑于2022年，星期二38梯度淋洗装置梯度淋洗装置外梯度外梯度:利用两台高压输液泵，将两利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。入色谱柱。内梯度内梯度:一台高压泵一台高压泵,通过比例调节

29、通过比例调节阀阀,将两种或多种不同极性的溶将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中剂按一定的比例抽入高压泵中混合。混合。第38页，共87页，编辑于2022年，星期二上节课内容回顾上节课内容回顾液相色谱特点液相色谱仪的组成高压输液系统高压输液系统进样系统进样系统分离系统分离系统检测系统检测系统第39页，共87页，编辑于2022年，星期二403-3 高效液相色谱的固定相和流动相高效液相色谱的固定相和流动相（）固定相（）固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚刚性固体和硬胶性固体和硬胶两大类。两大类。刚性固体刚性固体以以二氧化硅

30、为基质，二氧化硅为基质，可承受可承受7.01081.0109Pa的高压，可制成直径、形状、的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是团，就是键合固定相键合固定相，可扩大应用范围，它是目前最广，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。泛使用的一种固定相。硬胶硬胶主要用于离子交换和尺寸排主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为承受压力上限为3.5108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相按孔

31、隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类固定相两类。第40页，共87页，编辑于2022年，星期二411.表面多孔型固定相表面多孔型固定相 它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由

32、于多孔层速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。厚度薄，最大允许量受限制。第41页，共87页，编辑于2022年，星期二422 2全多孔型固定相全多孔型固定相 它由直径为它由直径为10m的硅胶微粒凝聚而成。的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗粒很细（这类固定相由于颗粒很细（510m），孔），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析特别适合复杂混合物分离及痕量分析.第42页，共87页，编辑于2022年，星期二43（二）流动相（二）流动相 由由于于高高效效液液相相色色谱谱中中流流动动相相是是液液体体，它

33、它对对组组分分有有亲亲和和力力，并并参参与与固固定定相相对对组组分分的的竞竞争争。因因此此，正正确确选选择择流流动动相相直直接接影影响响组组分分的的分分离离度度。对对流流动动相相溶溶剂剂的的要要求求是：是：（1 1）溶溶剂剂对对于于待待测测样样品品，必必须须具具有有合合适适的的极极性性和和良良好的选择性。好的选择性。（2 2）溶剂要与检测器匹配。）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长截止波长要长。要长。所谓所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐

34、射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。表中列出了一些常用明的，它严重干扰组分的吸收测量。表中列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。溶剂的紫外截止波长。第43页，共87页，编辑于2022年，星期二44 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。第44页，共87页，编辑于2022年，星期二45（3）高高纯纯度度。由由于于高高效效液液相相色色谱谱灵灵敏敏度度高高，对对流流动动相相溶

35、溶剂剂的的纯纯度度也也要要求求高高。不不纯纯的的溶溶剂剂会会引引起起基基线线不不稳稳，或或产产生生“伪伪峰峰”。痕痕量量杂杂质质的的存存在在，将将使使截截止止波波长长值值增增加加50100 nm。（4）化化学学稳稳定定性性好好。不不能能选选与与样样品品发发生生反反应应或或聚聚合合的的溶剂。溶剂。(5)低粘度。低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙腈等。但粘分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙腈等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测

36、器内形成气泡，影响分离在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离.第45页，共87页，编辑于2022年，星期二46流动相及流动相的极性流动相及流动相的极性 （1）可可显显著著改改变变组组分分分分离离状状况况的的流流动动相相选选择择在在液液相相色色谱谱中中显显得得特特别别重重要要。液液相相色色谱谱的的流流动动相相又又称称为为：淋洗液，洗脱剂。淋洗液，洗脱剂。（2）亲亲水水性性固固定定液液常常采采用用疏疏水水性性流流动动相相，即即流流动动相相的的极极性性小小于于固固定定相相的的极极性性，称称为为正正相相液液液液色色谱谱法法，极性柱也称正相柱。极性柱也称正相柱。（3）若若流流动动相相的的极极性性大大于于固

37、固定定液液的的极极性性，则则称称为为反反相相液液液液色色谱谱，非非极极性性柱柱也也称称为为反反相相柱柱。组组分分在在两两种种类类型分离柱上的出峰顺序相反。型分离柱上的出峰顺序相反。第46页，共87页，编辑于2022年，星期二47流动相组成流动相组成 流动相按组成不同可分为单组分和多组分；流动相按组成不同可分为单组分和多组分；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂常用溶剂:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采采用用二二元元或或多

38、多元元组组合合溶溶剂剂作作为为流流动动相相可可以以灵灵活活调调节节流流动动相相的的极极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。第47页，共87页，编辑于2022年，星期二481.吸吸附附色色谱谱（液液-固固吸吸附附色色谱谱）：以以固固体体吸吸附附剂剂为为固固定定相相，如如硅硅胶胶、氧氧化化铝铝等等，较较常常使使用用的的是是510m的的硅硅胶胶吸吸附附剂剂。流流动动相相可可以以是是各种不同极性的一元或多元溶剂。各种不同极性的一元或多元溶剂。2.分分配配色色谱谱（液液-液液分分配配色色谱谱）：早早期期通通过过在在载载体体上上涂涂渍渍一一薄薄层层固固定定液

39、液制制备备固固定定相相,现现多多为为化化学学键键合合固固定定相相，即即用用化化学学反反应的方法通过化学键将固定液结合在载体表面。应的方法通过化学键将固定液结合在载体表面。3-4高效液相色谱法的主要类型及选择高效液相色谱法的主要类型及选择HPLC根据分离机理的不同分为几种类型：根据分离机理的不同分为几种类型：第48页，共87页，编辑于2022年，星期二49高效液相色谱法的主要分离类型高效液相色谱法的主要分离类型3.离离子子交交换换色色谱谱：固固定定相相为为离离子子交交换换树树脂脂，流流动动相相为为无无机机酸酸或或无无机机碱碱的的水水溶溶液液。各各种种离离子子根根据据它它们们与与树树脂脂上上的的交

40、换基团的交换能力的不同而得到分离。交换基团的交换能力的不同而得到分离。4.凝凝胶胶色色谱谱（空空间间排排阻阻色色谱谱）：以以凝凝胶胶为为固固定定相相。凝凝胶胶是是一一种种经经过过交交联联的的、具具有有立立体体网网状状结结构构和和不不同同孔孔径径的的多多聚聚体体的的通通称称。如如葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶、琼琼脂脂糖糖等等软软质质凝凝胶胶；多多孔孔硅硅胶胶、聚聚苯苯乙乙烯烯凝胶等硬质凝胶；凝胶等硬质凝胶；第49页，共87页，编辑于2022年，星期二503-4 高效液相色谱法的主要类型及选择高效液相色谱法的主要类型及选择一、液一液分配色谱法（一、液一液分配色谱法（LLPC）在液在液-液色谱中，流动相和固

41、定相都是液体液色谱中，流动相和固定相都是液体,它能它能适用适用于各种样品类型的分离和分析于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。合物。1分离原理分离原理 液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是在所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成

42、各组柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。分。第50页，共87页，编辑于2022年，星期二51 2、固定相、固定相 由由于于液液液液色色谱谱中中流流动动相相参参与与选选择择竞竞争争，因因此此，对对固固定定相相选选择择较较简简单单。只只需需使使用用几几种种极极性性不不同同的的固固定定液液即即可可解解决决分分离离问问题题。例例如如，最最常常用用的的强强极极性性固固定定液液，一一氧氧二二丙丙腈腈，中等极性的中等极性的聚乙二醇聚乙二醇，非极性的非极性的角鲨烷角鲨烷等。等。为了更好解决固定

43、液在载体上流失问题。产生了为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键化学键合固定相合固定相。它是将各种不同有机基团通过化学反应键合。它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机械涂渍，到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。它是目前应它是目前应用最广泛的一种固定相。据统计，用最广泛的一种固定相。据统计，约有约有3/4以上的分离问题以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。

44、详细介绍见后。是在化学键合固定相上进行的。详细介绍见后。第51页，共87页，编辑于2022年，星期二523流动相流动相 在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。根据所使且流动相与固定相的极性差别越显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分正相分配色谱配色谱和和反相分配色谱反相分配色谱。如果采用如果采用流动相的极性小于固定相的极性流动相的极性小于固定相的极性，称为称为

45、正正相分配色谱相分配色谱，它适用于极性化合物的分离。其它适用于极性化合物的分离。其流出顺序流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。是极性小的先流出，极性大的后流出。如果采用如果采用流动相的极性大于固定相的极性流动相的极性大于固定相的极性，称为，称为反反相分配色谱相分配色谱。它适用于非极性化合物的分离，其。它适用于非极性化合物的分离，其流流出顺序与正相色谱恰好相反。出顺序与正相色谱恰好相反。第52页，共87页，编辑于2022年，星期二53二、化学键合相色谱法（二、化学键合相色谱法（CBPC）采采用用化化学学键键合合相相的的液液相相色色谱谱称称为为化化学学键合相色谱法，简称键合相色谱。键合相色谱

46、法，简称键合相色谱。由由于于键键合合固固定定相相非非常常稳稳定定，在在使使用用中中不不易易流流失失，适适用用于于梯梯度度淋淋洗洗，特特别别适适用用于于分分离离容容量量因因子子k值值范范围围宽宽的的样样品品。由由于于键键合合到到载载体体表表面面的的官官能能团团可可以以是是各各种种极极性性的，因此它适用于种类繁多样品的分离。的，因此它适用于种类繁多样品的分离。第53页，共87页，编辑于2022年，星期二541键合固定相类型键合固定相类型 用用来来制制备备键键合合固固定定相相的的载载体体，几几乎乎都都用用硅硅胶胶。利利用用硅硅胶胶表表面面的的硅硅醇醇基基(Si一一OH)与与有有机机分分子子可可成成键

47、键,即可得到各种性能的固定相。一般可分三类即可得到各种性能的固定相。一般可分三类（1）疏疏水水基基团团 如如不不同同链链长长的的烷烷烃烃（C8和和C18）和和苯苯基基等等（2）极性基团极性基团 如氨丙基，氰基、醚和醇等。如氨丙基，氰基、醚和醇等。（3）离离子子交交换换基基团团 如如作作为为阴阴离离子子交交换换基基团团的的胺胺基基，季胺盐；作为阳离子交换基团的磺酸基等季胺盐；作为阳离子交换基团的磺酸基等.第54页，共87页，编辑于2022年，星期二552反相健合相色谱法反相健合相色谱法 此此法法的的固固定定相相是是采采用用极极性性较较小小的的键键合合固固定定相相，如如硅硅胶胶一一C18H37、硅

48、硅胶胶一一苯苯基基等等；流流动动相相是是采采用用极极性性较较强强的的溶溶剂剂，如如甲甲醇醇水水、乙乙腈腈一一水水、水水和和无无机机盐盐的的缓冲溶液等。缓冲溶液等。它它多多用用于于分分离离多多环环芳芳烃烃等等低低极极性性化化合合物物；若若采采用用含含一一定定比比例例的的甲甲醇醇或或乙乙腈腈的的水水溶溶液液为为流流动动相相，也也可可用用于于分分离离极极性性化化合合物物；若若采采用用水水和和无无机机盐盐的的缓缓冲冲液液为为流流动动相相，则则可可分分离离一一些些易易离离解解的的样样品品，如如有有机机酸酸、有有机机碱碱、酚酚类类等等。反反相相键键合合相相色色谱谱法法具具有有柱柱效效高高，能能获获得得无无

49、拖拖尾尾色色谱谱峰的优点。峰的优点。第55页，共87页，编辑于2022年，星期二563.正相键合相色谱法正相键合相色谱法 此此法法是是以以极极性性的的有有机机基基团团，CN、NH2双双羟羟基基等等键键合合在在硅硅胶胶表表面面作作为为固固定定相相；而而以以非非极极性性或或极极性性小小的的溶溶剂剂（如如烃烃类类）中中加加入入适适量量的的极极性性溶溶剂剂（如如氯氯仿仿、醇醇、乙乙腈腈等等）为为流流动动相相，分分离离极极性性化化合合物物。此此时时，组组分分的的分分配配比比k值值随随其其极极性性的的增增加加而而增增大大，但但随随流流动动相相极极性的增加而降低。性的增加而降低。这这种种色色谱谱方方法法主主

50、要要用用于于分分离离异异构构体体、极极性性不不同同的的化化合合物物，特特别别适适用用于于分分离离不不同同类类型型的化合物。的化合物。第56页，共87页，编辑于2022年，星期二574.离子性键合相色谱法离子性键合相色谱法 当当以以薄薄壳壳型型或或全全多多孔孔微微粒粒型型硅硅胶胶为为基基质质，化化学学键键合合各各种种离离子子交交换换基基团团，如如一一SO3H 一一CH2NH2、C00H等等时时，就就形形成成了了离离子子性性键键合合相相色色谱谱的的固固定定相相；流流动动相相一一般般采采用用缓缓冲冲溶溶液液。其其分离原理与离子交换色谱类同。分离原理与离子交换色谱类同。以上讨论了各种类型化学键合相色谱