第二章工具酶第三章载体精选文档.ppt

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1、第二章工具酶第三章载体第二章工具酶第三章载体第二章工具酶第三章载体第二章工具酶第三章载体本讲稿第一页，共一百零八页第二章第二章 用于核酸操作的工具酶用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶核酸酶核酸酶核酸修饰酶核酸修饰酶本讲稿第二页，共一百零八页（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的发现及其生物功能限制性核酸内切酶的发现及其生物功能识别双链识别双链DNADNA分子中的特定序列，并切割分子中的特定序列，并切割DNADNA双链双链主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNADN

2、A的入侵的入侵细菌的限制与修饰作用细菌的限制与修饰作用hsd hsd R R：编码限制性核酸内切酶编码限制性核酸内切酶hsd hsd MM：编码限制性甲基化酶编码限制性甲基化酶hsd hsd S S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达编码限制性酶和甲基化酶的协同表达19681968年，年，SmithSmith等人首先从等人首先从流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d d株中分离出株中分离出 Hind IIHind II和和Hind IIIHind III 本讲稿第三页，共一百零八页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的类型限制性核酸内切酶的类型主要特性主要特性 I I 型型 II II 型型 I

3、II III 型型限制修饰限制修饰多功能多功能单功能单功能双功能双功能蛋白结构蛋白结构异源三聚体异源三聚体同源二聚体同源二聚体异源二聚体异源二聚体辅助因子辅助因子ATP MgATP Mg2+2+SAM SAMATP MgATP Mg2+2+SAM SAMMgMg2+2+识别序列识别序列TGANTGAN88TGCTTGCT旋转对称序列旋转对称序列GAGCCGAGCCAACNAACN66GTGCGTGCCAGCAGCAGCAG切割位点切割位点距识别序列距识别序列1 1kbkb处处识别序列内或附近识别序列内或附近距识别序列下游距识别序列下游随机性切割随机性切割特异性切割特异性切割24-2624-26

4、bpbp处处本讲稿第四页，共一百零八页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名属名属名 种名种名 株名株名H i n d IIIH i n d III H i nH i n d III d IIIH Haemophilus aemophilus ininfluenzaefluenzae d d 嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌d d株株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶本讲稿第五页，共一百零八页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶II II 型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链识别双链DNAD

5、NA分子中分子中4-84-8对碱基的特定序列对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构回文结构5 5 G C T G C T G A A T T CG A A T T C G A G 3 G A G 33 3 C G A C G A C T T A A GC T T A A G C T C 5 C T C 5EcoR IEcoR I的识别序列的识别序列EcoR IEcoR I的切割位点的切割位点本讲稿第六页，共一百零八页EcoRIEcoRI等产生的等产生的55粘性末端粘性末端5

6、 5 GG-C C-T T-GG-A A-A A-T T-T T-C C-GG-A A-G 3G 33 3 C C-GG-A A-C C-T T-T T-A A-A A-GG-C C-T T-C 5C 5EcoRI 37 EcoRI 37 5 5 GG-C C-T T-GG-OHOH PP-A A-A A-T T-T T-C C-GG-A A-G 3G 33 3 C C-GG-A A-C C-T T-T T-A A-A A-PP OHOH-GG-C C-T T-C 5 C 5 退火退火 4-7 4-7 5 5 GG-CC-T T-GG AA-AA-T T-T T-CC-GG-AA-G 3G 3

7、3 3 CC-GG-AA-CC-T T-T T-AA-AA GG-CC-T T-C 5C 5OHOHPPOHOHPP本讲稿第七页，共一百零八页PstIPstI等产生的等产生的33粘性末端粘性末端5 5 GG-CC-T T-CC-T T-GG-CC-AA-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-AA-CC-GG-T T-CC-CC-T T-C 5C 5PstI 37 PstI 37 5 5 GG-CC-T T-CC-T T-GG-CC-AA-OHOH PP-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-PP OHOH-AA-CC-GG-T T-CC-CC-T

8、 T-C 5 C 5 退火退火 4-7 4-7 5 5 GG-CC-T T-CC-T T-GG-CC-AA GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG AA-CC-GG-T T-CC-CC-T T-C 5C 5OHOHPPOHOHPP本讲稿第八页，共一百零八页PvuIIPvuII等产生的平头末端等产生的平头末端5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-C 5C 5PvuII 37 PvuII 37 5 5 GG-C C-T T-C C-A A-GG-O

9、HOH PP-C C-T T-GG-GG-A A-G 3G 33 3 C C-GG-A A-GG-T T-C C-PP OHOH-GG-A A-C C-C C-T T-C 5 C 5 本讲稿第九页，共一百零八页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶II II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分大部分II II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HClTris-HCl50 mM pH 7.550 mM pH 7.5MgClMgCl2210 mM10 mMNaClNaCl0-150 mM0-150 mMDTTDTT1 mM1 m

10、M0-50 mM 0-50 mM 低盐酶低盐酶100 mM 100 mM 中盐酶中盐酶150 mM 150 mM 高盐酶高盐酶VolumeVolume20-100 20-100 m ml lT TT T37 37 1-1.5 1-1.5 hrhr1 1 U U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 1 小时，完全小时，完全水解水解 1 1 m mg g 标准标准DNADNA所需的酶量所需的酶量本讲稿第十页，共一百零八页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶II II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作II II 型核酸内切

11、酶的多酶联合酶解：型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：5 5 GCTACATGCTACATGGATCCCGGGGGATCCCGGGTTCGCAT3TTCGCAT33 3 CGATGTACGATGTACCTAGGGCCCCCTAGGGCCCAAGCGTA5AAGCGTA5BamHI SmaIBamHI SmaI5 5 GCTACATGCTACATG GATCCCGGGG GATCCCGGGTTCGCAT3 TTCGCAT3 3 3 CGATGTACGATGTACCTAG GGCCCCCTAG GGCC

12、CAAGCGTA5AAGCGTA55 5 GCTACATGCTACATGGATCCC GGGGGATCCC GGGTTCGCAT3TTCGCAT33 3 CGATGTACGATGTACCTAGGG CCCCCTAGGG CCCAAGCGTA5AAGCGTA5本讲稿第十一页，共一百零八页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶II II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作II II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解使用较贵的酶的

13、盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切0.10.1倍体积的倍体积的 5 5 M NaAc pH 5.4M NaAc pH 5.42.52.5倍体积的冰冷乙醇倍体积的冰冷乙醇冰浴冰浴 5 5 分钟、高速冷冻离心分钟、高速冷冻离心1010分钟、干燥分钟、干燥本讲稿第十二页，共一百零八页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素DNADNA样品的纯度：样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、蛋白质、苯酚、氯仿、

14、乙醇、EDTAEDTA、SDSSDS、NaClNaCl等等加大酶的用量，加大酶的用量，1 1 m mg DNA g DNA 用用 10 10U U 酶酶加大反应总体积加大反应总体积延长反应时间延长反应时间本讲稿第十三页，共一百零八页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素DNADNA样品的甲基化程度：样品的甲基化程度：大肠杆菌中的大肠杆菌中的damdam甲基化酶在甲基化酶在55GATC3GATC3序列中的腺序列中的腺嘌呤嘌呤NN66位位 引入甲基，受其影响的酶有引入甲基，受其影响的酶有Bcl IBcl I、MboIMboI等，但等，但BamH

15、 IBamH I、Bgl IIBgl II、Sau3A ISau3A I不受影响不受影响 大肠杆菌中的大肠杆菌中的dcmdcm甲基化酶在甲基化酶在55CCAGG3CCAGG3或或55CCTGG3CCTGG3序列序列中的中的胞嘧啶胞嘧啶CC55位位上引入甲基，上引入甲基，受其影响的酶有受其影响的酶有EcoR IIEcoR II等等哺乳动物中的甲基化酶在哺乳动物中的甲基化酶在55CG3CG3序列中的序列中的CC55位位上引入甲基上引入甲基本讲稿第十四页，共一百零八页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素核酸内切酶的缓冲液性质：核酸内切酶的缓冲液

16、性质：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pHpH值值等，等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的所谓的Star activityStar activity现象现象 EcoR IEcoR I在正常条件下识别并切割在正常条件下识别并切割55GAATTC3GAATTC3序列，但在甘序列，但在甘油浓度超过油浓度超过5%5%（v/vv/v）时，也可切割时，也可切割55PuPuATPyPy3PuPuATPyPy3或者或者55AATT3AATT3本讲稿第十五页，共一百零八页（二）（二）DN

17、ADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质修复双链修复双链DNADNA上缺口处的磷酸二酯键上缺口处的磷酸二酯键DNADNA连接酶连接酶5 5 GG-CC-T T-CC-T T-GG-CC-AA GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG AA-CC-GG-T T-CC-CC-T T-C 5C 5OHOHPPOHOHPP5 5 GG-CC-T T-CC-T T-GG-CC-AA-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-AA-CC-GG-T T-CC-CC-T T-C 5C 5nicknicknicknick本讲稿第十六页，共一百零八页

18、DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质修复与修复与RNARNA链结合的链结合的DNADNA链上缺口处的磷酸二酯键链上缺口处的磷酸二酯键T4-DNAT4-DNA连接酶连接酶5 5 GG-CC-UU-CC-UU-GG-CC-CC-GG-GG-AA-GG 3 33 3 CC-GG-AA-GG AA-CC-GG-GG-CC-CC-T T-C 5C 5OHOHPPnicknick5 5 GG-CC-UU-CC-UU-GG-CC-CC-GG-GG-AA-GG 3 33 3 CC-GG-AA-GG-AA-CC-GG-GG-CC-CC-T T-C 5C 5本讲稿第十七页，共一百零

19、八页DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质连接多个平头双链连接多个平头双链DNADNA分子：分子：5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-GG-AA-GG 333 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-CC 5 55 5 GG-C C-T T-C C-A A-GG-OHOH PP-C C-T T-GG-GG-A A-GG 333 3 C C-GG-A A-GG-T T-C C-PP OHOH-GG-A A-C C-C C-T T-C C 5 5 T4-DNAT4-DNA连接酶连接酶本讲稿第十八页，共一百

20、零八页DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶的反应条件连接酶的反应条件Tris-HClTris-HCl50-100 mM pH 7.550-100 mM pH 7.5MgClMgCl2210 mM10 mMATPATP0.5-1 mM0.5-1 mMDTTDTT5 mM5 mMVolumeVolume10-20 10-20 m ml lT TT T4-15 4-15 4-16 4-16 hrhr1 1 U DNAU DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 15 反应反应 1 1 小时，小时，完全连接完全连接 1 1 m mg g l l-DNA-DNA（

21、Hind IIIHind III片段）所需的酶量片段）所需的酶量本讲稿第十九页，共一百零八页DNADNA连接酶连接酶平头双链平头双链DNADNA片段的连接操作片段的连接操作从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括：提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（加大连接酶用量（1010倍大于粘性末端的连接）倍大于粘性末端的连接）

22、加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入加入10%10%PEG8000PEG8000，促进大分子之间的有效作用促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（加入单价阳离子（NaClNaCl），），最终浓度最终浓度150-200 150-200 mMmM本讲稿第二十页，共一百零八页（三）（三）DNADNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I（DNA pol I DNA pol I）53535353的的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性53535353的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性35353535的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性

23、大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I的基本性质：的基本性质：3 3 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-GG-AA-GG-A 5A 55 5 CC-GG-AA-GG-T T-OHOH5 5 ppp dN Mgppp dN Mg2+2+3 3 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-GG-AA-GG-A 5A 55 5 CC-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-OHOHDNA pol IDNA pol I本讲稿第二十一页，共一百零八页DNADNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I（DNA pol I

24、 DNA pol I）缺口前移标记法缺口前移标记法大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 的基本用途：的基本用途：5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-CC-A A 5 5 MgMg2+2+5 5 dNTP dNTP 5 5 ppppp p dA dA（a a-3232P-dATPP-dATP）5 5 GG-CC-T T-C AC A-GG-CC-T T-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-C

25、C-CC-T T-CC-A A 5 5 5 5 GG-CC-T T-CC-A-GA-G-CC-T T-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-CC-A A 5 5 Nick translationNick translation制备制备3232P P标记的探针标记的探针DNase IDNase IDNA pol IDNA pol I本讲稿第二十二页，共一百零八页DNADNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（Klenow Klenow）KlenowKlenow酶的基本性质：酶的基

26、本性质：大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得经枯草杆菌蛋白酶处理，获得NN端端三分之二的大肽段，即为三分之二的大肽段，即为KlenowKlenow酶酶KlenowKlenow酶仍拥有酶仍拥有53535353的的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性和和35353535的核的核核酸外切酶活性核酸外切酶活性，但失去了，但失去了53535353的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性本讲稿第二十三页，共一百零八页DNADNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（Klenow Klenow）KlenowKlenow酶的基本用途：酶的基本用途

27、：补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的55粘性末端粘性末端DNADNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记cDNAcDNA第二链的合成第二链的合成双脱氧末端终止法测定双脱氧末端终止法测定DNADNA序列序列本讲稿第二十四页，共一百零八页DNADNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（Klenow Klenow）KlenowKlenow酶的基本用途：酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的55粘性末端粘性末端5 5 GG-CC-T T-GG-OHOH PP-AA-AA-T T-T T-CC-GG-AA-G 3G 33 3 C

28、C-GG-AA-CC-T T-T T-AA-AA-PP OHOH-GG-CC-T T-C 5 C 5 KlenowKlenowdATP dTTPdATP dTTP5 5 GG-CC-T T-GG-AA-AA-T T-T T-OHOH PP-AA-AA-T T-T T-CC-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-CC-T T-T T-AA-AA-PP OH-OH-T T-T T-AA-AA-GG-CC-T T-C 5 C 5 本讲稿第二十五页，共一百零八页DNADNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（Klenow Klenow）Klenow

29、Klenow酶的基本用途：酶的基本用途：DNADNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记5 5 GG-CC-T T-GG-OHOH PP-AA-AA-T T-T T-CC-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-CC-T T-T T-AA-AA-PP OHOH-GG-CC-T T-C 5 C 5 KlenowKlenowaa-3232P-ppP-ppppdA dTTPdA dTTP5 5 GG-CC-T T-GG-AA-AA-T T-T T-OHOH PP-AA-AA-T T-T T-CC-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-CC-T T-T T-AA-AA-PP

30、OH-OH-T T-T T-AA-AA-GG-CC-T T-C 5 C 5 本讲稿第二十六页，共一百零八页DNADNA聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA酶的基本特性：酶的基本特性：在无在无dNTPdNTP时，可以从任何时，可以从任何3-3-OHOH端外切端外切在只有一种在只有一种dNTPdNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止时，外切至互补核苷酸暴露时停止在四种在四种dNTPdNTP均存在时，聚合活性占主导地位均存在时，聚合活性占主导地位53535353的的DNADNA聚合酶活性和聚合酶活性和35353535的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性本讲稿第二十七页，

31、共一百零八页DNADNA聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA聚合酶的基本用途：聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的切平由核酸内切酶产生的3 3 粘性末端粘性末端5 5 GG-CC-T T-CC-T T-GG-CC-AA-OHOH PP-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-PP HOHO-AA-CC-GG-T T-CC-CC-T T-C 5 C 5 T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶5 5 GG-CC-T T-CC-OHOH PP-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-PP HOHO-CC-CC-T T-

32、C 5C 5注意：该酶也能降解双链注意：该酶也能降解双链DNADNA，只是其活性比单链降解活性低很多只是其活性比单链降解活性低很多本讲稿第二十八页，共一百零八页DNADNA聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA聚合酶的基本用途：聚合酶的基本用途：DNADNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-CC-A A 5 5 MgMg2+2+5 5 ppp dN ppp dN 5 5 pppppp

33、 dA dA（aa-3232P-dATPP-dATP）5 5 GG-CC-T T-C AC A-GG-CC-T T-GG-OHOH HO HO-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-CC-A A 5 5 T4-DNA polT4-DNA polT4-DNA polT4-DNA pol5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-GG-AA-GG-T T 333 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-CC-A A 5 5 本讲稿第二十九页，共一百零八页DNADNA聚合酶聚合酶依赖于依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶（反转录酶）

34、聚合酶（反转录酶）反转录酶的基本特性：反转录酶的基本特性：以以RNARNA为模板聚合为模板聚合cDNAcDNA链链3 3AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA55mRNAmRNA反转录酶反转录酶MgMg2+2+dNTP dNTP5 5TTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTT oligo(dT)oligo(dT)12-1812-183 3AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA55mRNAmRNA5 5TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT33cDNAcDNA本讲稿第三十页，共一百零八页DNADNA聚合酶聚合酶依赖于依赖于RNARNA

35、的的DNADNA聚合酶（反转录酶）聚合酶（反转录酶）反转录酶的基本特性：反转录酶的基本特性：双向外切双向外切DNA-RNADNA-RNA杂合链中的杂合链中的RNARNA链链反转录酶反转录酶3 RNA3 RNA55 DNADNA33553 RNA3 RNA55 DNADNA3355反转录酶反转录酶55 DNADNA33本讲稿第三十一页，共一百零八页（四）核酸酶（四）核酸酶单链核酸外切酶：核酸外切酶单链核酸外切酶：核酸外切酶VIIVII（ExoVIIExoVII）大肠杆菌的核酸外切酶大肠杆菌的核酸外切酶VIIVII不需要不需要MgMg2+2+ExoVIIExoVII3355335533553355

36、本讲稿第三十二页，共一百零八页核酸酶核酸酶双链核酸外切酶：核酸外切酶双链核酸外切酶：核酸外切酶 IIIIII（ExoIIIExoIII）ExoExoIIIIII33553355MgMg2+2+33553355大肠杆菌的核酸外切酶大肠杆菌的核酸外切酶 III III 特异性地从特异性地从3 3 端外切端外切本讲稿第三十三页，共一百零八页核酸酶核酸酶双链核酸外切酶：双链核酸外切酶：l l 核酸外切酶核酸外切酶（l lExoExo）l lExoExo33553355MgMg2+2+l l核酸外切酶特异性地从核酸外切酶特异性地从5 5 端外切端外切33553355本讲稿第三十四页，共一百零八页核酸酶核

37、酸酶单链核酸内切酶：单链核酸内切酶：S1S1核酸酶核酸酶S1S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（Aspergillus oryzaeAspergillus oryzae）ZnZn2+2+必需必需最适最适pHpH范围为范围为4.0-4.34.0-4.3需要需要NaCl 10-300 mMNaCl 10-300 mM降解单链降解单链DNADNA的速度比降解双链的速度比降解双链DNADNA快快7500075000倍倍降解单链降解单链DNADNA的速度比降解单链的速度比降解单链RNARNA快快7 7倍倍本讲稿第三十五页，共一百零八页核酸酶核酸酶单链核酸内切酶：单链核

38、酸内切酶：S1S1核酸酶核酸酶S1S1核酸酶的基本反应：核酸酶的基本反应：内切单链内切单链DNADNA或或RNARNA5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-CC-T T-T T-GG-AA-GG-GG-AA-GG-T 3T 3S1S1ZnZn2+2+5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-C TC T-T T-GG-AA-GG-GG-AA-GG-T 3T 35 5 GG-CC-T T-C AC A-GG-CC-T T-C TC T-T T-GG-AA-G GG G-AA-GG-T 3T 35 5 dNMPs dNMPs 或或 5 5 NMPsNMPs本

39、讲稿第三十六页，共一百零八页核酸酶核酸酶单链核酸内切酶：单链核酸内切酶：S1S1核酸酶核酸酶S1S1核酸酶的基本反应：核酸酶的基本反应：内切带缺口或缺刻的双链内切带缺口或缺刻的双链DNADNA或或RNARNA5 5 GG-CC-T T-CC-AA-G CG C-T T-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-CC-A A 5 5 5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC AA-CC-CC-T T-CC-A A 5 5 ni

40、cknickgapgapS1S1ZnZn2+2+5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG3 3 CC-GG-AA-GG-T T-CCT T-GG-GG-AA-GG-T 3T 3AA-CC-CC-T T-CC-A A 5 5 本讲稿第三十七页，共一百零八页核酸酶核酸酶单链核酸内切酶：单链核酸内切酶：S1S1核酸酶核酸酶S1S1核酸酶的重要用途：核酸酶的重要用途：在在DNADNA上定位上定位RNARNA（S1 mappingS1 mapping）DNADNAmRNAmRNA杂交杂交S1S1EcoRIEcoRI本讲稿第三十八页，共一百零八页核酸酶核酸酶单链内切双链外切的核酸酶：单链内切双链外切的

41、核酸酶：Bal31Bal31核酸酶核酸酶Bal31Bal31核酸酶的基本特性核酸酶的基本特性:来自艾氏交替单胞菌（来自艾氏交替单胞菌（A.espejianaA.espejiana）CaCa2+2+5 5 dNMPs dNMPs 或或 5 5 NMPsNMPsssDNA or RNAssDNA or RNACaCa2+2+CaCa2+2+本讲稿第三十九页，共一百零八页核酸酶核酸酶单链内切双链外切的核酸酶：单链内切双链外切的核酸酶：Bal31Bal31核酸酶核酸酶Bal31Bal31核酸酶的基本用途：诱发核酸酶的基本用途：诱发DNADNA突变突变EcoRIEcoRIA ABBCCEcoRIEcoR

42、IEcoRIEcoRIBBCCA ABal31Bal31BBCCA A环化环化A ACC本讲稿第四十页，共一百零八页（五）核酸修饰酶（五）核酸修饰酶末端脱氧核苷酰转移酶（末端脱氧核苷酰转移酶（TdTTdT）TdTTdT的基本特性：来自小牛胸腺的基本特性：来自小牛胸腺不需要模板的不需要模板的DNADNA聚合酶，聚合酶，随机掺入随机掺入dNTPsdNTPs5 p3 HOOH 3 p 5 TdTTdTMgMg2+2+dATPdATP5 p3 HOAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 本讲稿第四十一页，共一百零八页TdTTdT的基本特性：的基本特性：5 p3 HOOH 3 p 5 TdTTdTC

43、oCo2+2+dATPdATP5 p3 HO AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 5 p3 HOOH 3 p 5 TdTTdTCoCo2+2+dATPdATP5 p3 HOAAAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 AAAAAAAAAAA本讲稿第四十二页，共一百零八页核酸修饰酶核酸修饰酶碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIPCIP）来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAPBAP）5 pOH 3 DNA or RNA5 ppp dN5 pppNBAP/CIPBAP/CIPOH 3 5

44、HO5 HO dN5 HO N本讲稿第四十三页，共一百零八页核酸修饰酶核酸修饰酶T4-T4-多核苷酸磷酸激酶（多核苷酸磷酸激酶（T4-PNPT4-PNP）T4-PNPT4-PNP的基本特性：在的基本特性：在DNADNA、RNARNA、dNRdNR、NRNR的的5-5-OHOH上加磷上加磷5 HO3 HOOH 3 OH 5 T4-PNPT4-PNPMgMg2+2+p pppATPppATP（g g-3232P-ATPP-ATP）5 p3 HOOH 3 p 5 用于探针的末端同位素标记：用于探针的末端同位素标记：本讲稿第四十四页，共一百零八页第三章第三章 用于基因克隆的载体用于基因克隆的载体质粒（

45、质粒（plasmidplasmid）噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA考斯质粒（考斯质粒（cosmidcosmid）与噬菌粒与噬菌粒人造染色体载体人造染色体载体载体的功能及特征载体的功能及特征本讲稿第四十五页，共一百零八页载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件本讲稿第四十六页，共一百零八页载体的功能及特征载体的功能及特征载体应具备的条件载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转

46、移性）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有合适的筛选标记具有合适的筛选标记 具有较具有较高的外源高的外源DNADNA的载装能力的载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 本讲稿第四十七页，共一百零八页质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子被稳定遗传的一类核酸分子质粒常见于原核细菌和真菌中质粒常见于原核细菌和真菌中绝大多数

47、的质粒是绝大多数的质粒是DNADNA型的型的绝大多数的天然绝大多数的天然DNADNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即即cccDNAcccDNA质粒质粒DNADNA的分子量范围：的分子量范围：1-300 1-300 kbkb本讲稿第四十八页，共一百零八页质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的自主复制性质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNADNA复制系统进行自主复制复制系统进行自主复制质粒质粒DNADNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可

48、分为根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：两大复制类型：严紧型复制控制的质粒严紧型复制控制的质粒 1-3 1-3 拷贝拷贝 stringent plasmidstringent plasmid松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒 10-60 10-60 拷贝拷贝 stringent plasmidstringent plasmid本讲稿第四十九页，共一百零八页质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制 质粒质粒DNADNA复制启动控制复制启动控制控制复制引物与模板的结合控制复制引物与模板的结合orior

49、iE.coli E.coli ColE1ColE1 plasmidplasmid复制方向复制方向roprop（+）RopRopRNA IIRNA IIRNA IRNA I33555533本讲稿第五十页，共一百零八页质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制 质粒质粒DNADNA复制启动控制复制启动控制控制复制起始因子与复制起始位点（控制复制起始因子与复制起始位点（oriori）的结合的结合PcopPcopcopcopP/OrepP/OreprepreporioriCopCopRepRep本讲稿第五十一页，共一百零八页质粒质粒质粒的基

50、本特征质粒的基本特征质粒的不相容性质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性质粒的不相容性，不相容性的质，不相容性的质以大肠杆菌的质粒为例：以大肠杆菌的质粒为例：ColE1ColE1、pMB1 pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101pSC101、F F、RP4 RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15Ap15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似