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1、第九章基因诊断本讲稿第一页，共六十九页第一节第一节基因诊断的概念基因诊断的概念及常用技术及常用技术本讲稿第二页，共六十九页基因诊断基因诊断利用分子生物学技术，从利用分子生物学技术，从DNA/RNA水平检测基因的存在水平检测基因的存在,分析基因的结构变异和表达状态，分析基因的结构变异和表达状态，从而对疾病作出诊断。从而对疾病作出诊断。一、基本概念一、基本概念本讲稿第三页，共六十九页二、基因诊断常用方法二、基因诊断常用方法核酸分子杂交核酸分子杂交PCRPCRDNADNA序列测定序列测定 DNADNA芯片技术芯片技术本讲稿第四页，共六十九页(一一)核酸杂交核酸杂交基本原理基本原理-核酸变性和复性理论

2、核酸变性和复性理论 即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。因此应用已知碱基序列的单链核苷酸片段作为探针，因此应用已知碱基序列的单链核苷酸片段作为探针，因此应用已知碱基序列的单链核苷酸片段作为探针，因此应用已知碱基序列的单链核苷酸片段作为探针，就可检测样本中是否存在与其互

3、补的同源核苷酸序就可检测样本中是否存在与其互补的同源核苷酸序就可检测样本中是否存在与其互补的同源核苷酸序就可检测样本中是否存在与其互补的同源核苷酸序列。列。列。列。本讲稿第五页，共六十九页probeprobe本讲稿第六页，共六十九页核酸杂交的关键要素核酸杂交的关键要素probe DNAprobe DNAtarget DNAtarget DNAsignal detectionsignal detection本讲稿第七页，共六十九页核酸杂交方法分类核酸杂交方法分类l按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。种类型。l l固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固

4、定在固体固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。l l液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。本讲稿第八页，共六十九页固相杂交分类固相杂交分类lSouthern 印记杂交lNorthern 印记杂交l斑点杂交l原位杂交本

5、讲稿第九页，共六十九页Southern blot是最经典的基因分析方法，不但能检出特异是最经典的基因分析方法，不但能检出特异的的DNADNA片段，而且能进行定量和测定分子量，片段，而且能进行定量和测定分子量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。等。本讲稿第十页，共六十九页Northern杂交l用于用于RNARNA的检测，能对组织细胞中总的检测，能对组织细胞中总RNARNA或或mRNAmRNA进行定性和定量分析。进行定性和定量分析。本讲稿第十一页，共六十九页斑点杂交（斑点杂交（Dot blotDot blot）可用基因组中特定基因及其表达的定性及定可用

6、基因组中特定基因及其表达的定性及定量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量，少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。特异性不高，有一定比例的假阳性。本讲稿第十二页，共六十九页原位杂交原位杂交（Colony in situ hybridizationColony in situ hybridization）可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾病的诊断；原位杂交的结果是显示有关核酸序病的诊断；原位杂交的结果是显示有关核酸序列的空间位置情况，因此可检出含核

7、酸序列的列的空间位置情况，因此可检出含核酸序列的具体细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可具体细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可检出基因和基因产物的亚细胞定位。检出基因和基因产物的亚细胞定位。本讲稿第十三页，共六十九页（二）利用（二）利用PCR及结合其他技术进行基因及结合其他技术进行基因诊断诊断l l直接采用直接采用PCRPCR进行基因诊断进行基因诊断l l采用采用PCRPCR产物的限制性片段长度多态性分析（产物的限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLPsPCR-RFLPs）进行基因诊断进行基因诊断l l采用采用PCRPCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针（结合等位基因特异性寡核苷酸探针（AS

8、OASO）斑点杂）斑点杂交进行基因诊断交进行基因诊断 *l l通过通过PCRPCR产物的反相点杂交产物的反相点杂交(RBD)(RBD)进行基因诊断进行基因诊断l l采用采用PCRPCR产物的单链构象多态性产物的单链构象多态性(SSCP)(SSCP)分析进行基因诊分析进行基因诊断断l l采用采用PCRPCR技术对靶核酸进行定量分析技术对靶核酸进行定量分析本讲稿第十四页，共六十九页寡核苷酸杂交分析寡核苷酸杂交分析SNP和等位基因特异和等位基因特异寡核苷酸杂交寡核苷酸杂交（ASO）#本讲稿第十五页，共六十九页（三）（三）DNA序列测定序列测定 DNA序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法，

9、可以确定突变的部位，突变的性质。本讲稿第十六页，共六十九页（四（四）DNA芯片技术芯片技术 应用DNA芯片，可以检测基因的结构及其突变多态性，对基因表达的情况进行分析。本讲稿第十七页，共六十九页二二 基因诊断的特点基因诊断的特点l高特异性高特异性l高灵敏度高灵敏度l获得稳定的结果获得稳定的结果l早期快速早期快速l适用性强，应用范围广适用性强，应用范围广本讲稿第十八页，共六十九页第二节第二节 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断本讲稿第十九页，共六十九页一、概述 l人类的遗传病达数千种地中海贫血在意大利等国家发病率达10镰状细胞贫血在美国黑人中发病率达14l我国常见的遗传性疾病有地中海贫血、异常血红

10、蛋白病和血友病。l有效治疗难；通过基因诊断进行携带者筛查，产前早期诊断，降低发病率。本讲稿第二十页，共六十九页二、镰状细胞贫血l血红蛋白病（异常血红蛋白病）l红细胞呈镰刀状，寿命短，引起溶血性贫血。l患者多在成年以前死亡本讲稿第二十一页，共六十九页Mst酶切位点酶切位点(CCTNAGG)53正常基因正常基因53突变基因突变基因1.15kb1.35kb（一）镰状红细胞贫血分子机制（一）镰状红细胞贫血分子机制5 67-Pro GluGlu-CCT GAG GAG-5 67-Pro AlaGlu-CCT GTG GAG-本讲稿第二十二页，共六十九页（二）镰状细胞贫血的基因诊断方法l限制性内切酶限制性

11、内切酶/Southern blot采集制备血液DNA内切酶Mst消化电泳转膜32P标记的珠蛋白cDNA杂交放射自显影本讲稿第二十三页，共六十九页+0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析本讲稿第二十四页，共六十九页l lPCR/PCR/限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶设计引物设计引物设计引物设计引物PCRPCRPCRPCR扩增扩增扩增扩增产物进行产物进行产物进行产物进行限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切电泳电泳电泳电泳EBEBEBEB染

12、色染色染色染色直接观察直接观察直接观察直接观察例：例：例：例：引物引物引物引物1 1 1 1：5-GGG CTG GGC ATA AAA GTCA-35-GGG CTG GGC ATA AAA GTCA-35-GGG CTG GGC ATA AAA GTCA-35-GGG CTG GGC ATA AAA GTCA-3引物引物引物引物2 2 2 2：5-AAT AGA CCA ATA GGC AGAG-35-AAT AGA CCA ATA GGC AGAG-35-AAT AGA CCA ATA GGC AGAG-35-AAT AGA CCA ATA GGC AGAG-3扩增产物扩增产物扩增产物扩

13、增产物294bp294bp294bp294bp镰状细胞贫血的基因诊断方法本讲稿第二十五页，共六十九页引物引物1CCT GAG GAGCCT GTG GAG引物引物1引物引物2引物引物2294bp103bp191bpMst酶切位点酶切位点(CCTNAGG)本讲稿第二十六页，共六十九页+103bp191bp294bp正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者镰状红细胞贫血患者PCR产物的限制性酶切分析产物的限制性酶切分析本讲稿第二十七页，共六十九页lRT-PCR/序列分析 采集制备血液RNART-PCR产物测序推测氨基酸序列进行诊断镰状细胞贫血的基因诊断方法本讲稿第二十八页，共六十

14、九页二、地中海贫血(Thalassaemia,简写thal或T)l l 珠珠珠珠蛋蛋蛋蛋白白白白基基基基因因因因突突突突变变变变导导导导致致致致该该该该多多多多肽肽肽肽链链链链的的的的合合合合成成成成大大大大为为为为减减减减少少少少（）或完全缺失（或完全缺失（或完全缺失（或完全缺失（0 0）l l 珠珠珠珠蛋蛋蛋蛋白白白白合合合合成成成成速速速速率率率率降降降降低低低低，导导导导致致致致 链链链链和和和和 链链链链合合合合成成成成的的的的不不不不平平平平衡衡衡衡多多多多余余余余的的的的珠珠珠珠蛋蛋蛋蛋白白白白链链链链沉沉沉沉积积积积在在在在红红红红细细细细胞胞胞胞膜膜膜膜上上上上改改改改变变变

15、变了了了了膜膜膜膜的的的的通透性和硬度通透性和硬度通透性和硬度通透性和硬度导致溶血性贫血。导致溶血性贫血。导致溶血性贫血。导致溶血性贫血。l l高危人群地中海人、中东人、印度人、中国人；中国人高危人群地中海人、中东人、印度人、中国人；中国人高危人群地中海人、中东人、印度人、中国人；中国人高危人群地中海人、中东人、印度人、中国人；中国人群中又一广东、广西、四川、贵州等省发病率最高。群中又一广东、广西、四川、贵州等省发病率最高。群中又一广东、广西、四川、贵州等省发病率最高。群中又一广东、广西、四川、贵州等省发病率最高。l l缺乏有效治疗措施。缺乏有效治疗措施。缺乏有效治疗措施。缺乏有效治疗措施。本

16、讲稿第二十九页，共六十九页（一）地贫病的分子基础l珠蛋白基因全长珠蛋白基因全长2053bp，含，含2个内含子个内含子（IVSI和和IVS-II），），3个外显子。个外显子。l目前发现突变有百余种，中国人群发现约目前发现突变有百余种，中国人群发现约20种；种；l一般对特定种族来说，一般对特定种族来说，90%的的地贫基因仅地贫基因仅由由46种突变组成。种突变组成。本讲稿第三十页，共六十九页（二）地中海贫血的基因诊断lPCR/ASO斑点杂交法合成2对PCR引物（扩增区段700bp和580bp，分别包含14种和1种可能突变）合成等位特异寡核苷酸(ASO)探针（46对，分别标记）制备DNA样品PCR扩增

17、斑点印迹杂交lRFLP分析法本讲稿第三十一页，共六十九页三地中海贫血的基因诊断a ac左侧缺失左侧缺失4.2kb右侧缺失右侧缺失3.7kbbbba2112N端端1C端端正常基因正常基因序列序列PCR扩增法定性分析左侧缺失型左侧缺失型基因序列基因序列右侧缺失型右侧缺失型基因序列基因序列ac扩增0.4kbab无扩增片段ab扩增1.2kb本讲稿第三十二页，共六十九页+0.4kb1.2kb正常人正常人右侧缺右侧缺失患者失患者地中海贫血患者基因组的地中海贫血患者基因组的PCR分析分析左侧缺左侧缺失患者失患者本讲稿第三十三页，共六十九页四、杜氏肌营养不良症（四、杜氏肌营养不良症（DMD）1.DMD是常见的

18、性连锁隐性遗传病，是常见的性连锁隐性遗传病，2.主要特征是进行性肌萎缩和肠肌假性肥大，主要特征是进行性肌萎缩和肠肌假性肥大，XP21.2121.3区抗肌萎缩蛋白基因突变形式不区抗肌萎缩蛋白基因突变形式不同。同。DMD多在多在5岁发病，岁发病，10岁左右瘫痪，岁左右瘫痪，在在20岁左右由于心力和呼吸衰竭而死亡，岁左右由于心力和呼吸衰竭而死亡，其发病率为活产男婴的其发病率为活产男婴的1/3500。本讲稿第三十四页，共六十九页（一）（一）DMD分子基础：分子基础：抗肌萎缩蛋白基因长约抗肌萎缩蛋白基因长约抗肌萎缩蛋白基因长约抗肌萎缩蛋白基因长约2900kb2900kb，含，含，含，含7979个外显子。

19、抗个外显子。抗个外显子。抗个外显子。抗肌萎缩蛋白基因突变分为基因缺失型和非基因缺失型。肌萎缩蛋白基因突变分为基因缺失型和非基因缺失型。肌萎缩蛋白基因突变分为基因缺失型和非基因缺失型。肌萎缩蛋白基因突变分为基因缺失型和非基因缺失型。（1 1）DNADNA片段缺失（片段缺失（片段缺失（片段缺失（60%60%的病例的病例的病例的病例导致阅读框移码导致阅读框移码导致阅读框移码导致阅读框移码移码移码移码移码实变实变实变实变致致致致DMDDMD，整码缺失，整码缺失，整码缺失，整码缺失BMDBMD）。缺失的）。缺失的）。缺失的）。缺失的2 2个热点区个热点区个热点区个热点区该基因该基因该基因该基因55端处端

20、处端处端处45554555外显子范围内。外显子范围内。外显子范围内。外显子范围内。（2 2）非基因缺失型部分重复（病例的）非基因缺失型部分重复（病例的）非基因缺失型部分重复（病例的）非基因缺失型部分重复（病例的5%5%）本讲稿第三十五页，共六十九页（1 1）基因组探针法）基因组探针法）基因组探针法）基因组探针法 用用用用XP21XP21区分离得到的不同探针如（区分离得到的不同探针如（区分离得到的不同探针如（区分离得到的不同探针如（P20P20）来进行相应内切酶）来进行相应内切酶）来进行相应内切酶）来进行相应内切酶酶谱分析、检出率取决于探针数和酶切位点数目。酶谱分析、检出率取决于探针数和酶切位点

21、数目。酶谱分析、检出率取决于探针数和酶切位点数目。酶谱分析、检出率取决于探针数和酶切位点数目。（2 2）cDNAcDNA探针法探针法探针法探针法抗抗抗抗肌肌肌肌萎萎萎萎缩缩缩缩蛋蛋蛋蛋白白白白基基基基因因因因系系系系列列列列cDNAcDNA探探探探针针针针分分分分析析析析患患患患者者者者基基基基因因因因缺缺缺缺失失失失、外外外外显显显显子拼接改变和基因内部分重复。子拼接改变和基因内部分重复。子拼接改变和基因内部分重复。子拼接改变和基因内部分重复。（3 3）多重）多重）多重）多重PCRPCR法法法法如如如如有有有有人人人人设设设设计计计计多多多多对对对对引引引引物物物物进进进进行行行行多多多多重

22、重重重PCRPCR扩扩扩扩增增增增该该该该基基基基因因因因的的的的9 9个个个个易易易易发发发发缺缺缺缺失失失失“热热热热点点点点区区区区”DNA”DNA片片片片段段段段，可可可可检检检检出出出出80%80%有有有有基基基基因因因因缺缺缺缺失失失失的的的的DMDDMD患者。患者。患者。患者。（4 4）多态性分析法）多态性分析法）多态性分析法）多态性分析法基因内及其旁侧探针进行基因内及其旁侧探针进行基因内及其旁侧探针进行基因内及其旁侧探针进行RFLPRFLP连锁分析。连锁分析。连锁分析。连锁分析。（5 5）RTPCRRTPCR扩扩扩扩增增增增该该该该基基基基因因因因外外外外显显显显子子子子（全全

23、全全长长长长2.4MB2.4MB、外外外外显显显显子子子子起起起起来来来来全全全全长长长长c14kbc14kb、用用用用多多多多对对对对引引引引物物物物）可可可可检检检检出出出出：外外外外显显显显子子子子拼拼拼拼接接接接异异异异常常常常。联联联联用用用用测测测测序序序序：可定位基因缺失的起始和终止。可定位基因缺失的起始和终止。可定位基因缺失的起始和终止。可定位基因缺失的起始和终止。本讲稿第三十六页，共六十九页1 1、苯丙酮尿症是一种常见的隐性遗传性氨基酸代谢病。、苯丙酮尿症是一种常见的隐性遗传性氨基酸代谢病。、苯丙酮尿症是一种常见的隐性遗传性氨基酸代谢病。、苯丙酮尿症是一种常见的隐性遗传性氨基

24、酸代谢病。2 2、主要特征：、主要特征：、主要特征：、主要特征：（1 1）苯丙氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸 酪氨酸酪氨酸酪氨酸酪氨酸多巴多巴多巴多巴儿茶酚胺儿茶酚胺儿茶酚胺儿茶酚胺 苯丙酮酸苯丙酮酸苯丙酮酸苯丙酮酸 酪胺酪胺酪胺酪胺 黑色素黑色素黑色素黑色素 （2 2）患患患患儿儿儿儿出出出出生生生生后后后后须须须须及及及及早早早早得得得得到到到到低低低低phephe饮饮饮饮食食食食治治治治疗疗疗疗，否否否否则则则则发发发发生生生生不不不不可逆大脑损害和严重智力发育障碍可逆大脑损害和严重智力发育障碍可逆大脑损害和严重智力发育障碍可逆大脑损害和严重智力发育障碍。苯丙氨酸苯丙氨酸羟化酶羟化酶（肝）

25、（肝）五、苯丙酮尿症（五、苯丙酮尿症（PKU）本讲稿第三十七页，共六十九页（一）PKU分子基础分子基础（1 1）迄迄迄迄今今今今约约约约3/43/4的的的的导导导导致致致致中中中中国国国国人人人人PKUPKU的的的的突突突突变变变变基基基基因因因因已已已已被被被被查查查查清清清清 ，它它它它们们们们分分分分属属属属1111种种种种PAHPAH基基基基因因因因点点点点突突突突变变变变。体体体体外外外外研研研研究究究究表表表表明明明明，这些突变导致这些突变导致这些突变导致这些突变导致PAHPAH活力活力活力活力 或丧失。或丧失。或丧失。或丧失。（2 2）PAHPAH第第第第1111外外外外显显显显

26、子子子子的的的的第第第第399399密密密密码码码码GTAGTA（valval）GTTGTT（valval）中中中中性性性性突突突突变变变变：不不不不改改改改变变变变任任任任何何何何限限限限制制制制酶酶酶酶识识识识别别别别位位位位点点点点，故故故故又又又又称称称称“序序序序列列列列多多多多态态态态性性性性”。这这这这一一一一“序序序序列列列列多多多多态态态态性性性性”在在在在PKUPKU患患患患者者者者和和和和正正正正常常常常人人人人中中中中存存存存在在在在着着着着连连连连锁锁锁锁不不不不平平平平衡衡衡衡性性性性，故故故故可可可可作作作作为为为为一一一一种种种种“遗遗遗遗传传传传标标标标记记记

27、记”应应应应用用用用于于于于产产产产前前前前诊诊诊诊断。断。断。断。本讲稿第三十八页，共六十九页PCR/ASO探探针针法法和和PCR-RFLP连连锁锁分分析法。析法。PCR/SSCP直直接接测测序序法法若若待待诊诊断断的的PKU家家系系的的基基因突变类型尚属因突变类型尚属“未知未知”或无或无RFLP信息。信息。（二）（二）PKU的的DNA诊断诊断本讲稿第三十九页，共六十九页l先合成ASOl如：正常探针：TCCATTAACAGTAAGAATTT突变探针：TCCATTAACAATAAGAATTT利用利用PCR/ASO探针法诊断苯丙酮探针法诊断苯丙酮尿症尿症本讲稿第四十页，共六十九页利用利用PCR/

28、ASO探针法诊断苯丙酮探针法诊断苯丙酮尿症尿症l 健康男性健康男性 男性携带者男性携带者男性患者男性患者 健康女性健康女性 女性携带者女性携带者女性患者女性患者正常探针突变探针本讲稿第四十一页，共六十九页第三节第三节 肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断本讲稿第四十二页，共六十九页1 1通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤慢粒：（染色体易位）费城染色体慢粒：（染色体易位）费城染色体PCRPCR检测融合基因检测融合基因2 2检测肿瘤相关基因检测肿瘤相关基因检测肿瘤相关基因检测肿瘤相

29、关基因癌基因（癌基因（rasras）、抑癌基因（）、抑癌基因（p53 p53）、肿瘤转移基因）、肿瘤转移基因3 3检测肿瘤相关病毒基因检测肿瘤相关病毒基因检测肿瘤相关病毒基因检测肿瘤相关病毒基因HBV HCVHBV HCV肝癌肝癌EBEB鼻咽癌鼻咽癌4 4检测肿瘤标志物基因或检测肿瘤标志物基因或检测肿瘤标志物基因或检测肿瘤标志物基因或mRNAmRNA 肝癌肝癌甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFPAFP）结肠癌结肠癌癌胚抗原（癌胚抗原（CEACEA）肿瘤基因诊断的策略肿瘤基因诊断的策略本讲稿第四十三页，共六十九页1.肿瘤标记物基因的检测肿瘤标记物基因的检测着丝粒着丝粒 染色体染色体 22 bcr gene

30、c-abl gene 染色体染色体 9 bcr-mRNA bcr-abl mRNA 染色体染色体 9,22 bcr-abl 融合蛋白（具融合蛋白（具PTK活性）活性）慢性骨髓白血病慢性骨髓白血病 引物A 引物 B本讲稿第四十四页，共六十九页2癌基因和抑癌基因的检测癌基因和抑癌基因的检测ras癌基因的检测癌基因的检测ras基因中最常见的点突变是第基因中最常见的点突变是第12，13或或61密码密码子突变子突变检测方法：检测方法：1.1.PCR/ASOPCR/ASO2.2.PCR-SSCPPCR-SSCP本讲稿第四十五页，共六十九页 p53的检测的检测p53基因突变主要为点突变，热点区域位于密基因突

31、变主要为点突变，热点区域位于密码子码子130290，以，以175、273、284最多见最多见检测方法：检测方法：1.PCRSSCP2.PCR测序测序3.PCRRFLP本讲稿第四十六页，共六十九页 其它基因的其它基因的 检测检测PCR结合其它技术结合其它技术基因芯片基因芯片本讲稿第四十七页，共六十九页4、肿瘤标志物检测或、肿瘤标志物检测或mRNA诊断诊断肿瘤标志物肿瘤标志物肿瘤标志物肿瘤标志物是由肿瘤组织细胞产生的、与肿瘤形成和发展相是由肿瘤组织细胞产生的、与肿瘤形成和发展相是由肿瘤组织细胞产生的、与肿瘤形成和发展相是由肿瘤组织细胞产生的、与肿瘤形成和发展相关的物质，包括肿瘤抗原、激素、酶、同工

32、酶等。关的物质，包括肿瘤抗原、激素、酶、同工酶等。关的物质，包括肿瘤抗原、激素、酶、同工酶等。关的物质，包括肿瘤抗原、激素、酶、同工酶等。基因标志和基因表型标志（胚胎性抗原）基因标志和基因表型标志（胚胎性抗原）基因标志和基因表型标志（胚胎性抗原）基因标志和基因表型标志（胚胎性抗原）检测方法：检测方法：检测方法：检测方法：1.1.PCRASOPCRASO2.2.PCRPCR测序测序测序测序3.3.PCRRFLPPCRRFLP4.4.PCRPCRSSCPSSCP本讲稿第四十八页，共六十九页第四节第四节 感染性疾病的感染性疾病的基因诊断基因诊断本讲稿第四十九页，共六十九页一、感染性疾病基因一、感染性

33、疾病基因诊断的策略诊断的策略1.针对病原体特异的核酸序列设计探针进针对病原体特异的核酸序列设计探针进行杂交行杂交2.应用应用PCR技术扩增病原体基因保守序列技术扩增病原体基因保守序列3.核酸杂交技术与核酸杂交技术与PCR技术联合应用技术联合应用本讲稿第五十页，共六十九页特点l简便、特异、快捷l能检测出潜在的病原体l可对病原体进行分类、分型鉴定l不能得知病原体进入体内后机体的反应本讲稿第五十一页，共六十九页二、基因诊断的感染性疾病（一）、病毒（一）、病毒特点：特点：1.1.分离培养分离培养周期长，操作繁杂，制约因素多周期长，操作繁杂，制约因素多2.2.电镜观察电镜观察直观快速，但昂贵直观快速，但

34、昂贵3.3.免疫学诊断免疫学诊断简便快速，但存在问题：简便快速，但存在问题：l l不易检出潜伏期的病毒不易检出潜伏期的病毒l l有些病毒亚型多，抗原变异性大有些病毒亚型多，抗原变异性大l l整合进入人基因组的病毒整合进入人基因组的病毒本讲稿第五十二页，共六十九页病毒核酸分析技术HBV包含4个开放阅读框，S、C、P、XPCRPCR/限制性内切酶谱分析PCR/点杂交,PCR/Southern blot基因芯片目的基因目的基因引物序列引物序列扩增片段扩增片段C C5ACTGTTCAAGCCTCCAAGCT35ACTGTTCAAGCCTCCAAGCT3425 425 bpbp5AGTGCGAATCCA

35、CACTC35AGTGCGAATCCACACTC3本讲稿第五十三页，共六十九页 调节和调节和调节和调节和启动转录启动转录启动转录启动转录 LTR gag pol env tat，rev LTR 长末端长末端长末端长末端重复序列重复序列重复序列重复序列调节蛋白基因调节蛋白基因正常的病毒基因正常的病毒基因正常的病毒基因正常的病毒基因产生病毒产生病毒产生病毒产生病毒核心蛋白核心蛋白核心蛋白核心蛋白产生逆转录产生逆转录产生逆转录产生逆转录酶和整合酶酶和整合酶酶和整合酶酶和整合酶 产生病毒产生病毒产生病毒产生病毒 外膜蛋白外膜蛋白外膜蛋白外膜蛋白附加基因附加基因附加基因附加基因*HIV*HIV病毒基因组

36、结构病毒基因组结构本讲稿第五十四页，共六十九页目的基因目的基因引物序列引物序列扩增片段扩增片段envenv5ACAATTATTGTCTGGTATAG35ACAATTATTGTCTGGTATAG3135 135 bpbp5AGGTATCTTTCCACAGCCAG35AGGTATCTTTCCACAGCCAG3HIV-1HIV-1Probe TGAGTTGCAACAGATGCTGTTGCGCCTCAATAGCCCTCAGPCR/核酸杂交诊断艾滋病本讲稿第五十五页，共六十九页SARSRTPCR 多重PCR 荧光定量PCR本讲稿第五十六页，共六十九页（二）、细菌细菌性痢疾志贺菌，侵袭性大肠杆菌，大质粒；

37、PCR结核病PCR 本讲稿第五十七页，共六十九页（三）、寄生虫 重复序列探针法、寡核苷酸探针法、基因组探针法、PCR本讲稿第五十八页，共六十九页第五节第五节 基因诊断策略基因诊断策略本讲稿第五十九页，共六十九页（一）检测致病基因突变（一）检测致病基因突变基因变异致病的类型：基因变异致病的类型：1.内源基因的变异内源基因的变异基因结构的突变基因结构的突变基因结构的突变基因结构的突变点突变、插入、缺失、重排、异位点突变、插入、缺失、重排、异位点突变、插入、缺失、重排、异位点突变、插入、缺失、重排、异位基因表达异常基因表达异常基因表达异常基因表达异常mRNAmRNA剪接异常剪接异常剪接异常剪接异常2

38、.外源基因的插入外源基因的插入本讲稿第六十页，共六十九页点突变的诊断点突变的诊断诊断已知的点突变诊断已知的点突变（PCR）一对探针一对探针突变碱基置探针中央突变碱基置探针中央控制杂交条件控制杂交条件结果分析：结果分析：反向杂交技术反向杂交技术本讲稿第六十一页，共六十九页诊断未知的突变诊断未知的突变 PCR/测序测序DNA芯片技术芯片技术本讲稿第六十二页，共六十九页分析与疾病连锁的遗传标志分析与疾病连锁的遗传标志 对于还不清楚基因的多数基因病，可对于还不清楚基因的多数基因病，可通过检测与特定染色体位点连锁的遗通过检测与特定染色体位点连锁的遗传标记来进行基因诊断。传标记来进行基因诊断。基基本本方方

39、法法：PCR产产物物酶酶切切产产物物电电泳泳分分析析。基基因因连连锁锁分分析析（PCR/RFLP连连锁分析法）锁分析法）本讲稿第六十三页，共六十九页（三）建立多基因疾病表型克隆（三）建立多基因疾病表型克隆l一些多基因、多因素疾病，不仅涉及多个基因还涉及一些环境因素及其与基因的相互作用。l表型克隆从分析正常与异常基因组的相同或差异，找到正常人与疾病患者之间的差异序列和相同序列，进而分离、鉴定与疾病相关的多个基因，确定导致疾病的分子缺陷。本讲稿第六十四页，共六十九页定量分析致病基因的表达水平定量分析致病基因的表达水平 1.mRNA的相对定量分析的相对定量分析斑点杂交或狭缝杂交斑点杂交或狭缝杂交RT

40、PCR2.mRNA的绝对定量分析的绝对定量分析RTPCR/竞争性竞争性PCR3.mRNA长度分析长度分析Northern杂交杂交/RTPCR产物电泳产物电泳本讲稿第六十五页，共六十九页第六节基因诊断的应用前景第六节基因诊断的应用前景本讲稿第六十六页，共六十九页一、基因诊断技术的发展史l20世纪80年代初以前，DNA分子杂交、RFLPlPCR技术建立和完善后PCRl基因芯片技术的建立高通量密集型技术本讲稿第六十七页，共六十九页二、基因诊断技术的前景l人类基因组计划的完成l功能基因组计划的进行本讲稿第六十八页，共六十九页三、基因诊断技术的问题l理论问题l技术问题l伦理问题本讲稿第六十九页，共六十九页