动植物细胞培养产酶tostudentsPPT课件.ppt

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1、EnzymeEngineering关于动植物细胞培养产酶关于动植物细胞培养产酶tostudents第一张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering 植物、动物、微生物细胞的特性比较植物、动物、微生物细胞的特性比较细胞种类细胞种类植物细胞植物细胞微生物细胞微生物细胞动物细胞动物细胞细胞大小细胞大小/um/um2002003003001 110101010100100倍增时间倍增时间/h/h12120.3-60.3-61515营养要求营养要求简单简单简单简单复杂复杂光照要求光照要求大多数要求大多数要求不要求不要求不要求不要求对剪切力对剪切力敏感敏感大多数不敏感大多数

2、不敏感非常敏感非常敏感主要产物主要产物色色素素、药药物物、香香精、酶等精、酶等醇、有机酸、氨基醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、抗生素、核苷酸、酶等酸、酶等疫疫苗苗、激激素素、单单克隆抗体、酶等克隆抗体、酶等第二张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering三者之间的差异主要有：三者之间的差异主要有：植物细胞植物细胞 动物细胞动物细胞 微生物细胞。微生物细胞。动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。

3、植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。第三张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering雪莲中黄酮类化合物为主要成分。黄酮类化合物以黄酮（雪莲中黄酮类化合物为主要成分。黄酮类化合物以黄酮（2-2-苯基色原酮）为母苯基色原酮）为母核而衍生的一类黄色色素。核而衍生的一类黄色色素。黄酮化合物具有多种生物活性，抗菌、消炎、抗突变、降压、清热解毒、镇静，黄酮化合物具有多种生物活性，抗菌、消炎、抗突变、降压、清

4、热解毒、镇静，在抗氧化、抗癌、防癌等方面也有显著效果；是大多数氧自由基的清除剂，对治疗在抗氧化、抗癌、防癌等方面也有显著效果；是大多数氧自由基的清除剂，对治疗冠心病、心绞痛、高血压等有显著效果；对降低舒张压，防治心律失常、心血管病冠心病、心绞痛、高血压等有显著效果；对降低舒张压，防治心律失常、心血管病和活血化瘀也起重要作用。和活血化瘀也起重要作用。自然资源有限，生长条件苛刻自然资源有限，生长条件苛刻，很难人工栽培。通过水母雪莲细胞培养生产黄酮有，很难人工栽培。通过水母雪莲细胞培养生产黄酮有着重要意义。着重要意义。第四张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动

5、动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶本章主要内容本章主要内容动植物细胞中酶生物合成的调节动植物细胞中酶生物合成的调节植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶植物细胞及其培养特点植物细胞及其培养特点植物细胞培养及产酶的工艺控制植物细胞培养及产酶的工艺控制动物细胞培养产酶动物细胞培养产酶动物细胞及其培养特点动物细胞及其培养特点动物细胞培养及产酶的工艺控制动物细胞培养及产酶的工艺控制第五张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶第一节 动

6、植物细胞中酶生物合成的调节从基因到蛋白质从基因到蛋白质有关微生物细胞中酶合成的调节理论也基本适用于动植有关微生物细胞中酶合成的调节理论也基本适用于动植物细胞物细胞动植物细胞具有比微生物更多的调节方动植物细胞具有比微生物更多的调节方式转录水平调节翻译水平调节激素、神经调节第六张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶动植物细胞中酶生物合成的调节一、细胞分化改变酶的生物合成一、细胞分化改变酶的生物合成 端粒（端粒（telomere）端粒是真核生物染色体的末端结构端粒是真核生物染

7、色体的末端结构由富含由富含 G、T 的的 DNA 简单重复序列不断重复而成简单重复序列不断重复而成人端粒序列：人端粒序列：TTAGGG保护真核生物染色体免遭破坏保护真核生物染色体免遭破坏牺牲自我，填补牺牲自我，填补 DNA 复制后在复制后在5-端留下的空隙端留下的空隙端粒随细胞年龄的增长而逐渐缩短端粒随细胞年龄的增长而逐渐缩短端粒酶（端粒酶（telomerase）催化端粒合成和延长催化端粒合成和延长核糖核蛋白，其中的核糖核蛋白，其中的 RNA 部分含核苷酸模板序列，可构建端粒重部分含核苷酸模板序列，可构建端粒重复序列复序列端粒酶一般存在于分化程度较低的细胞中端粒酶一般存在于分化程度较低的细胞中

8、第七张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶动植物细胞中酶生物合成的调节动植物细胞中酶生物合成的调节二、基因扩增加速酶的生物合成二、基因扩增加速酶的生物合成通过增加基因的数量调节基因表达，可以发生在个体发育某一阶通过增加基因的数量调节基因表达，可以发生在个体发育某一阶段或细胞分化某一过程段或细胞分化某一过程细胞的一种应急方式细胞的一种应急方式基因扩增可以由选择压力引起基因扩增可以由选择压力引起耐药性细胞的抗药性产生耐药性细胞的抗药性产生例：例：CHO（中国田鼠卵巢中国田鼠

9、卵巢）细胞为对抗氨甲基喋呤对二氢叶酸还原酶）细胞为对抗氨甲基喋呤对二氢叶酸还原酶的抑制，编码这种酶的基因急剧扩增的抑制，编码这种酶的基因急剧扩增第八张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶动植物细胞中酶生物合成的调节动植物细胞中酶生物合成的调节三、增强子促进酶的生物合成三、增强子促进酶的生物合成增强子（增强子（modulator）能高效增强或促进基因转录的一段能高效增强或促进基因转录的一段DNA 序列序列增强子能促进同源或异源启动基因的转录活性，可高效增强某些增强子能促进

10、同源或异源启动基因的转录活性，可高效增强某些酶基因的表达酶基因的表达具有细胞或组织特异性，在不同细胞或组织中增强效果不同具有细胞或组织特异性，在不同细胞或组织中增强效果不同第九张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering抗原和抗体抗原和抗体 当当外外源源物物性性物物质质，如如蛋蛋白白质质、毒毒素素、糖糖蛋蛋白白、脂脂蛋蛋白白、核核酸酸、多多糖糖、颗颗粒粒（细细菌菌、细细胞胞、病病毒毒）进进入入人人或或动动物物体体内内时时，机机体体的的免免疫疫系系统统便便产产生生相相应应的的免免疫疫球球蛋蛋白白（immune globin），并并以以之之结结合合，以以消消除除异异

11、物物的的毒毒害害。此此反反应应称称为为免免疫疫反反应应，此异物便是抗原，此球蛋白便是抗体。此异物便是抗原，此球蛋白便是抗体。抗体酶（抗体酶（Abzyme)Abzyme)是具有酶催化功能的抗体分子。是具有酶催化功能的抗体分子。本质本质为免疫球蛋白，在可变区被赋予了酶的属性。四、抗原诱导抗体酶的生物合成四、抗原诱导抗体酶的生物合成第十张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶动植物细胞中酶生物合成的调节动植物细胞中酶生物合成的调节四、抗原诱导抗体酶的生物合成四、抗原诱导抗体酶的

12、生物合成抗体酶（抗体酶（abzyme）：催化性抗体，）：催化性抗体，是具有生物催化功能的抗体分子，是是具有生物催化功能的抗体分子，是人工改造的对抗体可变区赋予催化特人工改造的对抗体可变区赋予催化特性的特殊抗体性的特殊抗体修饰法修饰法在抗体与抗原结合部位引进催化基团在抗体与抗原结合部位引进催化基团诱导法（主要方法）诱导法（主要方法）半抗原诱导半抗原诱导酶蛋白诱导酶蛋白诱导第十一张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering第二节第二节第二节第二节 植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶植物来源物质的生产方法有两种：植物来源物质的生产方法有两

13、种：1 1、提取分离法：、提取分离法：原料有限原料有限2 2、细胞培养法、细胞培养法在人工控制条件的植物细胞反应器中进行优在人工控制条件的植物细胞反应器中进行优质细胞培养，从而获得各种所需产物。质细胞培养，从而获得各种所需产物。植物材料提取分离纯化产品第十二张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶1902年，Haberlandt首次提出分离植物单细胞并培养成植株的设想植物细胞的全能性HaberlandtHaberlandt哈勃兰德哈勃兰德哈

14、勃兰德哈勃兰德第十三张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶一、植物细胞培养产酶种类一、植物细胞培养产酶种类产酶植物细胞产酶品种胡萝卜细胞糖苷酶紫苜蓿细胞-半乳糖苷酶甜菜细胞过氧化物酶、酸性/碱性转化酶、糖化酶大豆细胞过氧化物酶、苯丙氨酸裂合酶花生细胞苯丙氨酸裂合酶假挪威槭细胞漆酶利马豆细胞-葡萄糖苷酶番木瓜细胞木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶大蒜细胞超氧化物歧化酶菠萝细胞菠萝蛋白酶剑麻细胞剑麻蛋白酶第十四张，PPT共四十六页，创作于2022年6

15、月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶植物细胞结构植物细胞结构第十五张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶二、植物细胞的主要特点二、植物细胞的主要特点体积较大：比动物细胞和微生物细胞都大体积较大：比动物细胞和微生物细胞都大细胞生长速率和代谢速率低于微生物细胞，生长周期长细胞生长速率和代谢速率低于微生物细胞，生长周期长营养要

16、求较动物细胞简单营养要求较动物细胞简单细胞生长及合成次级代谢产物需要光照条件细胞生长及合成次级代谢产物需要光照条件对剪切力较敏感对剪切力较敏感主要用于产天然产物、色素、香精等有机物（次级代谢物）主要用于产天然产物、色素、香精等有机物（次级代谢物）第十六张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶三、植物细胞培养的优势三、植物细胞培养的优势提高目标物的产率提高目标物的产率缩短生产周期缩短生产周期木瓜蛋白酶：木瓜生长期木瓜蛋白酶：木瓜生长期8个月，

17、木瓜细胞培养约个月，木瓜细胞培养约1个月个月易于管理，不受自然因素控制易于管理，不受自然因素控制可以提高产物质量可以提高产物质量通过严格的培养条件控制，减少植株病虫害和污染通过严格的培养条件控制，减少植株病虫害和污染四、缺点四、缺点培养条件要求高培养条件要求高 光照、剪切力影响显著光照、剪切力影响显著植物细胞生长缓慢植物细胞生长缓慢 相对于微生物相对于微生物第十七张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering五、工艺条件及控制五、工艺条件及控制五、工艺条件及控制五、工艺条件及控制1、工艺流程外植体 获取细胞（诱导愈伤组织）细胞培养分离纯化酶第十八张，PPT共四十六

18、页，创作于2022年6月EnzymeEngineering外植体：外植体：从植株取出，经过预处理后，用于植物组织培养的植物组织（包括从植株取出，经过预处理后，用于植物组织培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）片段或小块。根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）片段或小块。愈伤组织：愈伤组织：一种能迅速增殖、无特定结构和功能的薄壁细胞团一种能迅速增殖、无特定结构和功能的薄壁细胞团 将上述外植体植入诱导培养基中，于将上述外植体植入诱导培养基中，于2525左右培养一段时间，左右培养一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团。从外植体的切口部位长出小细胞团。第十九张，PPT共四十六页，创作于2

19、022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶植物细胞培养植物细胞培养 外植体选择和处理外植体选择和处理外植体（外植体（explant）从植株取出，经预处理后用于组织和细胞培养的植物组织片段或小块从植株取出，经预处理后用于组织和细胞培养的植物组织片段或小块根、茎、叶、芽、花、果实、种子等根、茎、叶、芽、花、果实、种子等选择：无病虫害、生长旺盛、生长有规则选择：无病虫害、生长旺盛、生长有规则切片：切片：0.51 cm消毒消毒70%乙醇乙醇5%次氯酸钠次氯酸钠/10%漂白粉漂白粉

20、0.010.1%HgCl2水稻的外植体（幼胚）水稻的外植体（幼胚）第二十张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶植物细胞培养植物细胞培养 获取植物细胞：直接分离法获取植物细胞：直接分离法直接分离法即直接从外植体中分离直接分离法即直接从外植体中分离机械法机械法将外植体捣碎，过滤或离心分离细胞将外植体捣碎，过滤或离心分离细胞质壁未分离；细胞破碎率高，完整细胞数量少质壁未分离；细胞破碎率高，完整细胞数量少酶解法酶解法利用果胶酶、纤维素酶等处理外植

21、体，分离具有代谢活性的细胞利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体，分离具有代谢活性的细胞能降解细胞壁，必须对细胞给予渗透压保护能降解细胞壁，必须对细胞给予渗透压保护第二十一张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶植物细胞培养植物细胞培养 获取植物细胞：愈伤组织诱导法获取植物细胞：愈伤组织诱导法愈伤组织（愈伤组织（callus）由外植体组织增生的细胞产生的团状不定型的疏散排列的薄壁细胞由外植体组织增生的细胞产生的团状不定型的疏散排列的薄壁细胞群体；

22、本意是指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的群体；本意是指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的可帮助伤口愈合的组织可帮助伤口愈合的组织诱导过程诱导过程配制半固体诱导培养基配制半固体诱导培养基灭菌、植入外植体灭菌、植入外植体13周后继代培养周后继代培养第二十二张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶植物细胞培养植物细胞培养 获取植物细胞：原生质体再生法获取植物细胞：原生质体再生法一般采用酶解法分离原生质体，使用纤维素酶和果胶酶

23、混合物一般采用酶解法分离原生质体，使用纤维素酶和果胶酶混合物保持溶液的高渗状态保持溶液的高渗状态防止原生质体胀裂防止原生质体胀裂渗透压稳定剂：糖、盐、甘露醇、山梨醇等渗透压稳定剂：糖、盐、甘露醇、山梨醇等原生质体培养，再生细胞壁原生质体培养，再生细胞壁第二十三张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶植物细胞培养植物细胞培养 悬浮培养悬浮培养将游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密度悬浮在液体培养基将游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密度悬浮在

24、液体培养基中进行培养的方法中进行培养的方法悬浮培养的细胞一般来源于愈伤组织，选择较松散的为宜悬浮培养的细胞一般来源于愈伤组织，选择较松散的为宜植物细胞培养植物细胞培养 产物分离纯化产物分离纯化收集培养液，从中获得所需的产物收集培养液，从中获得所需的产物第二十四张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering2 2、培养基的特点、培养基的特点 （1 1）需大量无机盐）需大量无机盐 （2 2）需维生素和生长激素：）需维生素和生长激素：硫胺素、吡哆素、盐酸、肌醇、硫胺素、吡哆素、盐酸、肌醇、生长素、分裂素等生长素、分裂素等 （3 3）一般为无机氮源：）一般为无机氮源：硝酸

25、盐和铵盐硝酸盐和铵盐 （4 4）一般以蔗糖为碳源）一般以蔗糖为碳源第二十五张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶3、工艺条件及其控制、工艺条件及其控制温度温度室温范围（室温范围（25 oC左右）左右）最适产酶温度和最适生长温度不同最适产酶温度和最适生长温度不同pH微酸性（微酸性（pH 56）细胞培养时，细胞培养时，pH一般变化不大一般变化不大溶解氧溶解氧植物细胞需氧量不高，供氧不宜过量植物细胞需氧量不高，供氧不宜过量对剪切力敏感，通风搅拌

26、不宜太剧烈对剪切力敏感，通风搅拌不宜太剧烈第二十六张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶工艺条件及其控制工艺条件及其控制光照光照光照对植物细胞的生长和产物合成具有重要影响（植物特色）光照对植物细胞的生长和产物合成具有重要影响（植物特色）光照有时也抑制产物合成光照有时也抑制产物合成添加前体添加前体前体：处于目的代谢物代谢途径上游的物质前体：处于目的代谢物代谢途径上游的物质添加前体相对于添加了反应的底物添加前体相对于添加了反应的底物刺激剂（刺

27、激剂（elector）引导物质朝特定的代谢方向进行，强化次级代谢产物的生物合成引导物质朝特定的代谢方向进行，强化次级代谢产物的生物合成常用微生物细胞壁碎片和果胶酶、纤维素酶等胞外酶常用微生物细胞壁碎片和果胶酶、纤维素酶等胞外酶第二十七张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶植物细胞培养产酶六、产酶实例 大蒜细胞培养产 SOD超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD，EC 1.15.1.1）生物体内清除超氧化物阴离子自由基（O2-）的重要金属酶类SO

28、D 和过氧化氢酶(catalase)、过氧化物酶(peroxidase，POD)一起构成了生物体内重要的酶促反应防御体系，从而维护生物体内细胞正常的生理代谢和生化反应第二十八张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶植物细胞培养产酶产酶实例 大蒜细胞培养产 SOD大蒜愈伤组织的诱导选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮先用70%乙醇消毒 20 s，再用0.1%升汞消毒 10 min，然后无菌水漂洗3次在无菌条件下，切成0.5 cm3 的小块，植入含有3 mg/L 2,

29、4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）和1.2 mg/L 6-BA（卞基腺嘌呤）的半固体 MS 培养基中25 oC，600 lux，12 h/d光照条件下培养18天，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次第二十九张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶植物细胞培养产酶产酶实例 大蒜细胞培养产 SOD大蒜细胞悬浮培养将上述在半固体 MS 培养基上培养18天的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3 mg/L 2,4-D 和 1.2 mg/L 6-BA 的液体 MS 培养基中，加入灭菌的玻璃珠，

30、25 oC，600 lux，12 h/d光照条件下振荡培养1012天，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3 mg/L 2,4-D和1.2 mg/L 6-BA 的液体 MS 培养基中，25 oC，600 lux，12 h/d光照条件下振荡培养18天SOD 分离纯化收集细胞，破碎，用pH 7.8 磷酸盐缓冲液提取第三十张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering七、现状：1、产率低 2、周期长，易染菌 3、光照难控制，放大难 4、成本高，生产高价值产品第三十一张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngi

31、neering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶第二节第二节 动物细胞培养产酶动物细胞培养产酶动物细胞特性动物细胞特性没有细胞壁，细胞脆弱（区别于植物和微生物）没有细胞壁，细胞脆弱（区别于植物和微生物）体积比微生物细胞大几千倍，但稍小于植物细胞体积比微生物细胞大几千倍，但稍小于植物细胞在肌体内相互粘连，以群体形式存在在肌体内相互粘连，以群体形式存在在培养时具有群体效应、贴壁依赖性、接触抑制性、功能全能性在培养时具有群体效应、贴壁依赖性、接触抑制性、功能全能性营养要求复杂（血清培养基营养要求复杂（血清培养基）第三十二张，PPT共四十六页，创作

32、于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶动物细胞培养产酶动物细胞培养产酶动物细胞培养的特点动物细胞培养的特点主要用于生产蛋白质主要用于生产蛋白质生长缓慢生长缓慢容易受污染（细菌、支原体），培养过程中需添加抗生素容易受污染（细菌、支原体），培养过程中需添加抗生素对剪切力特别敏感（胞外缺少保护结构）对剪切力特别敏感（胞外缺少保护结构）大部分具有贴壁依赖性大部分具有贴壁依赖性 贴壁培养贴壁培养培养基成分复杂，价格高昂培养基成分复杂，价格高昂细胞生命有限，一般最多继代培养细胞生命有限，一般最多继代培养50

33、50代即退化死亡代即退化死亡第三十三张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶动物细胞培养产酶动物细胞培养产酶动物细胞培养方式 悬浮培养适用于非贴壁依赖型细胞杂交瘤细胞、肿瘤细胞、体液（血液、淋巴液）细胞类似于微生物细胞的深层发酵，但工艺条件有较大差别对通气、搅拌耐受性差对氧气的要求较微生物低，培养时需通入一定比例 CO2优点（相对于贴壁培养）细胞在培养液中均匀分散，生长情况良好传代培养容易，无需消化分散细胞培养基中营养成分利用率高第三十四张，PPT共四十六页，创作于202

34、2年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶动物细胞培养产酶动物细胞培养产酶动物细胞培养方式 贴壁培养适用于贴壁依赖型细胞上皮细胞、成纤维细胞细胞在培养容器表面迅速铺展并分裂滚瓶培养系统结构简单，但比表面积小微载体培养系统由葡聚糖凝胶等聚合物制得的微球兼具单层培养和悬浮培养的优势细胞生长环境均一第三十五张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶动物细胞培养产酶动物细胞培养产酶动物细胞培养方

35、式 固定化培养贴壁或非贴壁依赖型细胞均适用吸附法载体为多孔性颗粒，如陶瓷颗粒、玻璃珠及硅胶颗粒贴壁型细胞的微载体培养即属此类包埋法将细胞包埋于琼脂、琼脂糖、胶原及血纤维等海绵状基质中细胞不易脱落固定化培养优点细胞损伤程度低，可重复使用产物分离容易第三十六张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶动物细胞培养产酶动物细胞培养过程种质细胞体细胞（动物体内组织取出）杂交瘤细胞基本工艺过程第三十七张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动

36、植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶动物细胞培养产酶培养基培养基（1 1）加血清或代用品）加血清或代用品（2 2）水用双蒸水）水用双蒸水（3 3）用无机盐调节渗透压）用无机盐调节渗透压（4 4）一般加抗生素）一般加抗生素（青霉素（青霉素&链霉素）链霉素）第三十八张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶动物细胞培养产酶动物细胞培养的工艺条件及其控制动物细胞培养的工艺条件及其控制温度温度哺乳动物细胞培养一般控制在哺乳动物细胞培养一般控

37、制在 36.50.25 oC温度也影响温度也影响 CO2 溶解度，从而影响培养液溶解度，从而影响培养液 pH 值值渗透压渗透压保持细胞内外等渗状态，一般保持细胞内外等渗状态，一般700850 kPa溶解氧溶解氧供氧不足：细胞生长受抑制供氧不足：细胞生长受抑制过量供氧：容易产生较多氧自由基，杀伤细胞过量供氧：容易产生较多氧自由基，杀伤细胞用混合气代替空气（空气、用混合气代替空气（空气、O2、N2、CO2）第三十九张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶动物细胞培养产酶动物细

38、胞培养的工艺条件及其控制pH 值与值与 CO2 浓度浓度动物细胞培养液动物细胞培养液 pH 在在 7.07.6 之间，以之间，以 pH 7.4 为最佳为最佳最常用的缓冲体系为最常用的缓冲体系为 CO2/HCO3-动物细胞培养时缺少动物细胞培养时缺少 CO2，培养液中的，培养液中的 HCO3-会被耗尽；会被耗尽；CO2 保保持了持了 HCO3-的浓度，以提供稳定的缓冲环境的浓度，以提供稳定的缓冲环境通常通常 CO2 浓度维持在浓度维持在 210%之间之间指示剂：酚红指示剂：酚红第四十张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细

39、 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶动物细胞培养产酶动物细胞培养的工艺条件及其控制pH 值 HEPES 缓冲体系HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-1-ethanesulfonic acidHEPES is a zwitterionic organic chemical buffering agent.HEPES is widely used in cell culture,largely because it is better at maintaining physiological pH despite chang

40、es in carbon dioxide concentration(produced by cellular respiration)when compared to bicarbonate buffers,which are also commonly used in cell culture.HEPES is like water in that its dissociation decreases as the temperature decreases.This makes HEPES a more effective buffering agent for maintaining

41、enzyme structure and function atlow temperatures.第四十一张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动物细胞培养产酶动物细胞培养产酶相关问题相关问题 为什么培养的细胞要及时传代为什么培养的细胞要及时传代传代培养：将原代培养的细胞分离、稀释并接种到新培养基上继传代培养：将原代培养的细胞分离、稀释并接种到新培养基上继续扩大培养的阶段续扩大培养的阶段体外培养的细胞大多具有生长接触抑制的特性，也就是说当一个体外培养的细胞大多具有生长接触抑制的特性，也就是说当一个细胞被其他细胞包围的时候，它就会停止生长细胞被其他细胞包围的

42、时候，它就会停止生长当细胞铺满培养器皿的表面时，正常的细胞停止生长，但是转化当细胞铺满培养器皿的表面时，正常的细胞停止生长，但是转化（即发生遗传物质突变）的、对接触抑制不敏感的细胞会继续生（即发生遗传物质突变）的、对接触抑制不敏感的细胞会继续生长长如果不及时传代，这些转化的细胞就会逐步取代正常的细胞，导如果不及时传代，这些转化的细胞就会逐步取代正常的细胞，导致正常细胞的退化致正常细胞的退化动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶?第四十二张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细

43、细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶动物细胞培养产酶产酶实例产酶实例 人黑色素瘤细胞培养生产人黑色素瘤细胞培养生产 tPAtPA（组织纤溶酶原激活剂组织纤溶酶原激活剂催化纤溶酶原水解，生成纤溶酶。纤溶酶催化血栓中的血纤维蛋白水解，催化纤溶酶原水解，生成纤溶酶。纤溶酶催化血栓中的血纤维蛋白水解，对血栓性疾病有显著疗效对血栓性疾病有显著疗效）Tissue plasminogen activator(abbr.tPA)is a protein involved in the breakdown of blood clots.It is a serine protease(EC 3.

44、4.21.68)found on endothelial cells,the cells that line the blood vessels.As an enzyme,it catalyzes the conversion of plasminogen to plasmin,the major enzyme responsible for clot breakdown.Because it works on the clotting system,tPA is used in clinical medicine to treat only embolic or thrombotic str

45、oke.Use is contraindicated in hemorrhagic strokeand head trauma.第四十三张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶动物细胞培养产酶动物细胞培养产酶人黑色素瘤细胞培养基：人黑色素瘤细胞培养基：Eagle Eagle 培养基培养基人黑色素瘤细胞培养人黑色素瘤细胞培养种质细胞用胰蛋白酶消化，分散细胞，种质细胞用胰蛋白酶消化，分散细胞，pH 7.4 pH 7.4 磷酸盐缓冲液洗磷酸盐缓冲液洗涤，稀释成细胞悬液涤，稀释成

46、细胞悬液细胞悬液接种至反应器，浓度细胞悬液接种至反应器，浓度 1 13103103 3/mL/mL，在含，在含5%CO5%CO2 2 的培的培养箱中养箱中 37 37 o oC C 培养，至长成单层致密细胞培养，至长成单层致密细胞倾去培养液，用倾去培养液，用pH 7.4 pH 7.4 磷酸盐缓冲液洗涤细胞，再加入无血清磷酸盐缓冲液洗涤细胞，再加入无血清Eagle Eagle 培养液，继续培养培养液，继续培养每每3 34 4天取出部分培养液分离纯化天取出部分培养液分离纯化 tPAtPA，再补加新鲜无血清，再补加新鲜无血清Eagle Eagle 培养液，连续操作培养液，连续操作tPA tPA 分离

47、纯化分离纯化 tPA tPA 抗体为配基的亲和层析法抗体为配基的亲和层析法第四十四张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering酶酶 工工 程程Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第第 三三 章章动植物细胞培养产酶动植物细胞培养产酶The production of Enzyme byThe production of Enzyme byCulturing of Animal or Plant CellsCulturing of Animal or Plant Cells第四十五张，PPT共四十六页，创作于2022年6月EnzymeEngineering感感谢谢大大家家观观看看第四十六张，PPT共四十六页，创作于2022年6月