第六章好氧发酵机制精选文档.ppt

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1、第六章好氧发酵机制本讲稿第一页，共四十页一一.概述概述有机酸：给出氢离子的有机物。泛指:羧酸（R-COOH）、磺酸（R-SO2OH）、亚磺酸（R-SOOH）、硫代羧酸（R-COSH）种类多：一元羧酸、二元羧酸、三元羧酸多元羧酸,不饱和羧酸，广泛存在于植物果实中。本讲稿第二页，共四十页糖、淀粉、酒精、石油等均可经微生物转化生成各种有机酸最早:醋酸和乳酸贾思勰齐民要术记载了23种酿醋方法我国已经投产：柠檬酸、葡萄糖酸、长链二羧酸、曲酸等本讲稿第三页，共四十页二二.有机酸应用有机酸应用1.在食品和饮料中的应用酸味剂:汽水、硬糖、冰淇淋水果罐头、果冻、果酱保色作用抑制腐败微生物生长l2.在医药工业中的

2、应用l柠檬酸及钠盐是很好的抗凝血剂l葡萄糖酸钙补钙本讲稿第四页，共四十页l3.在化学工业中的应用l洗涤剂（脱锈）:无毒、无污染l无毒电镀:柠檬酸盐镀锌溶液代替氰化物l化妆品、香皂沐浴液:防止氧化和除臭l本讲稿第五页，共四十页4.其它工业卷烟(乳酸或乳酸钠):防干燥、防霉变、增香处理纤维(乳酸):柔软、光泽显影剂(酒石酸)乳酸钙是重要的医药和饲料添加剂本讲稿第六页，共四十页第一节 柠檬酸发酵机制柠檬酸（citricacid）,枸橼酸。学名：2-羟基-丙烷三羧酸或-羟基丙三酸分子式C6H8O7，分子量192.13无水柠檬酸是无色半透明全对称晶体柠檬酸在化工、医药、食品等方面有广泛的用途本讲稿第七页

3、，共四十页柠檬酸的生产：18741874年首次从柠檬汁中提出柠檬酸并结晶成固体；年首次从柠檬汁中提出柠檬酸并结晶成固体；19131913年首次实现利用黑曲霉发酵生年首次实现利用黑曲霉发酵生成柠檬酸。成柠檬酸。1893年前，主要从柑橘、菠萝和柠檬等提取1893年后发现微生物（青霉）可产生柠檬酸1951年美国Miles公司首先深层发酵法生产柠檬酸（Aspergillus niger）我国20世纪40年代初开始浅盘发酵生产柠檬酸60年代深层发酵本讲稿第八页，共四十页柠檬酸生产菌柠檬酸生产菌青霉、毛霉、木霉、曲霉及葡萄孢霉等利用淀粉质原料大量积累柠檬酸国内利用黑曲酶（Aspergillus niger

4、）工艺:固体或液体深层发酵原料:甘蔗渣、废糖蜜、白薯、马铃薯、玉米等本讲稿第九页，共四十页柠檬酸发酵的原理柠檬酸发酵的原理己糖、淀粉等原料柠檬酸生化过程复杂EMP糖酵解途径丙酮酸羧化通过三羧酸循环形成柠檬酸本讲稿第十页，共四十页一、三羧酸循环一、三羧酸循环l三羧酸循环TCA环的总反应式为：CH3COSCoA+2O2+12(ADP+Pi)2CO2+H2O+12ATP+CoATCA环产生能量的水平是很高的，每氧化一分子乙酰CoA，可产生12分子ATP。本讲稿第十一页，共四十页本讲稿第十二页，共四十页TCA循环的意义：循环的意义：l（1）生理意义：在一切分解代谢和合成代谢中占有枢纽地位，在动植物和微

5、生物细胞中普遍存在，不仅是糖分解代谢的主要途径，也是脂肪、蛋白质分解代谢的最终途径，具有重要生理意义l（2）实践意义：与微生物大量发酵产物如柠檬酸、苹果酸、琥珀酸和谷氨酸等的生产密切相关。l柠檬酸是葡萄糖经TCA循环形成的最有代表性的发酵产物。本讲稿第十三页，共四十页二、柠檬酸生物合成途径二、柠檬酸生物合成途径l主要生产菌：l黑曲霉本讲稿第十四页，共四十页TCA循环与柠檬酸的形成循环与柠檬酸的形成本讲稿第十五页，共四十页柠檬酸合成中柠檬酸合成中CO2固定系统本讲稿第十六页，共四十页l存在两个存在两个COCO2 2固定系统（需固定系统（需MgMg2 2、K K）：）：l 1 1）丙酮酸（）丙酮酸

6、（PYRPYR）在丙酮酸羧化酶作用下，）在丙酮酸羧化酶作用下，生成草酰乙酸（此作用更强）生成草酰乙酸（此作用更强）l 2 2）磷酸烯醇丙酮酸（）磷酸烯醇丙酮酸（PEPPEP）在）在PEPPEP激酶的作激酶的作用下，生成草酰乙酸用下，生成草酰乙酸本讲稿第十七页，共四十页三、柠檬酸生物合成的代谢调节l（一）、糖酵解及丙酮酸代谢的调节一）、糖酵解及丙酮酸代谢的调节l1 1、正常情况下，柠檬酸、正常情况下，柠檬酸、ATPATP对磷酸果糖激酶有抑制作用，而对磷酸果糖激酶有抑制作用，而AMPAMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是还能解、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是还能解除柠檬酸、除柠

7、檬酸、ATPATP对磷酸果糖激酶的抑制作用。对磷酸果糖激酶的抑制作用。l 铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是由于细胞内浓铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是由于细胞内浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。本讲稿第十八页，共四十页本讲稿第十九页，共四十页l2.2.比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最大活力时发比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最大活力时发现，锰缺乏时黑曲霉的组成（合成）代谢受损伤，这与柠现，锰缺乏时黑曲霉的组成（合成）代谢受损伤，这与柠檬酸的积累有关。檬酸的积累有关。l 锰缺乏时，细胞内锰缺

8、乏时，细胞内NHNH4 4 浓度高，浓度高，AaAa浓度高（蛋白合成受阻，导浓度高（蛋白合成受阻，导致升高）。因此，锰离子效应是通过致升高）。因此，锰离子效应是通过NHNH4 4升高而减少柠檬酸对升高而减少柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制来实现的磷酸果糖激酶的抑制来实现的。l3.3.丙酮酸激酶是丙酮酸激酶是EMPEMP途径的第途径的第2 2个调节点，在某些真菌得到证实，个调节点，在某些真菌得到证实，但黑曲霉未被证实。但黑曲霉未被证实。本讲稿第二十页，共四十页（二）、TCA循环的调节l 1 1、TCATCA环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中，柠檬酸

9、合成酶没但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉有调节作用，这是黑曲霉TCATCA环的第一个特点。环的第一个特点。顺乌头酸酶失活，阻断顺乌头酸酶失活，阻断TCATCA环是柠檬酸积累的必要条件，顺乌头酸水合酶需环是柠檬酸积累的必要条件，顺乌头酸水合酶需要要FeFe2 2。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0pH2.0时失活，线粒体顺乌头酸酶在催化时失活，线粒体顺乌头酸酶在催化时有柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸时有柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90=90：3 3：7 7的平衡，这个平衡可能就是的平衡，这个平衡可能就是造成柠檬酸的最初积累而使造成柠檬酸的最初积累而使pHp

10、H值降低。值降低。本讲稿第二十一页，共四十页l2.2.第二个特点：黑曲霉菌体内第二个特点：黑曲霉菌体内-酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低（酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低（TCATCA环被环被阻断），它被葡萄糖和阻断），它被葡萄糖和NHNH4 4抑止抑止。（。（是是TCATCA循环中唯一不可逆的反应步骤）循环中唯一不可逆的反应步骤）l3.3.氧和氧和pHpH值对柠檬酸发酵的影响很大。值对柠檬酸发酵的影响很大。氧是发酵过程（氧是发酵过程（EMPEMP途径和丙酮酸脱氢）生成的途径和丙酮酸脱氢）生成的NADHNADH2 2重新氧化时所需重新氧化时所需标准呼吸链产生标准呼吸链产生ATPATP积累，侧呼吸链不产

11、生积累，侧呼吸链不产生ATPATP，缺氧导致侧呼吸链失活，使，缺氧导致侧呼吸链失活，使ATPATP积积累，柠檬酸积累减少。累，柠檬酸积累减少。本讲稿第二十二页，共四十页本讲稿第二十三页，共四十页 TCA循环在柠檬酸积累中所起作用可归纳为：l（1 1）大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键）大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键l（2 2）丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不）丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制或其控制及微弱，而且这两受代谢调节的控制或其控制及微弱，而且这两个反应的平衡保证了草酰乙酸的提供，增加了个反应的平衡保证了草酰乙酸的提供，增加了柠檬酸的合成能力柠檬酸的合成能力本讲稿

12、第二十四页，共四十页l（3 3）TCATCA循环的阻断微弱，导致循环中间代谢循环的阻断微弱，导致循环中间代谢物积累。由于各种酶处于平衡状态，使柠檬酸物积累。由于各种酶处于平衡状态，使柠檬酸积累，当柠檬酸浓度超过一定水平时，就通过积累，当柠檬酸浓度超过一定水平时，就通过抑止异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身的积累。抑止异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身的积累。本讲稿第二十五页，共四十页柠檬酸的积累机制柠檬酸的积累机制本讲稿第二十六页，共四十页丙酮酸氧化脱羧生成乙酰丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoACoA和和CO2CO2固定两个反应的平衡，以及柠固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。

13、檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90=90：3 3：7 7 同时控制同时控制FeFe2+2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。本讲稿第二十七页，共四十页随着柠檬酸积累，随着柠檬酸积累，pHpH降低到一定程度时，使顺降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。檬酸的积累及排出细胞外。本讲稿第二十八页，共四十页三、乙醛酸

14、循环和醋酸发酵柠檬酸l丙酮酸脱羧反应是不可逆的，草酰乙酸的供给丙酮酸脱羧反应是不可逆的，草酰乙酸的供给只能由乙醛酸循环来完成只能由乙醛酸循环来完成l存在异柠檬酸裂解酶，合成柠檬酸的存在异柠檬酸裂解酶，合成柠檬酸的C4C4二羧酸二羧酸只能由乙醛酸提供。只能由乙醛酸提供。本讲稿第二十九页，共四十页乙醛酸循环乙醛酸循环本讲稿第三十页，共四十页第二节、氨基酸发酵机制第二节、氨基酸发酵机制本讲稿第三十一页，共四十页一、氨基酸发酵的代谢控制一、氨基酸发酵的代谢控制本讲稿第三十二页，共四十页二、谷氨酸的发酵二、谷氨酸的发酵本讲稿第三十三页，共四十页1.谷氨酸生产菌中存在2个糖酵解途径EMP/HMP生物素参与

15、糖代谢作用：增加糖代谢的速度而丙酮酸氧化脱羧的速度未改变丙酮酸积累乳酸积累2.-酮戊二酸脱氢酶缺失TCA环阻断，-酮戊二酸积累本讲稿第三十四页，共四十页3.四碳二羧酸的来源在生产菌中检出CO2固定反应酶活性磷酸烯醇丙酮酸(PEF)羧化酶和苹果酸酶 谷氨酸对糖的转化率达到81.7%DCA循环标志酶：异柠檬酸裂解酶在谷氨酸发酵中，DCA环一方面可以作为TCA循环有缺陷时C4二羧酸的补充 在谷氨基酸生产菌的生长中提供能量作用谷氨酸生成期中要封闭DCA环？通过DCA环提供C4二羧酸时谷氨酸对糖的转化率仅为54.4%本讲稿第三十五页，共四十页4.异柠檬酸脱氢酶活力强提供NADPH,用于还原-酮戊二酸生成

16、谷氨酸，形成氧化还原共扼体系5.氨的导入合成谷氨酸的反应有3种：-酮戊二酸+NH4+NADPH+谷氨酸H2ONADP+谷氨酸脱氢酶-酮戊二酸+天冬氨酸或丙氨酸谷氨酸转氨酶谷氨酸-酮戊二酸+-酮戊二酸+谷氨酰胺NADPH+2谷氨酸NADP+谷氨酸合成酶本讲稿第三十六页，共四十页生产菌中谷氨酸转氨酶活力低，转氨作用可以不考虑谷氨酸合成酶由于不受高浓度谷氨酸抑制，其作用值得重视谷氨酸脱氢酶是合成积累谷氨酸的主要酶氨的导入时生物素缺乏，NH4+影响糖代谢速度：提高糖代谢速度高效合成谷氨酸生物素充足时，NH4+不影响糖代谢速度6.谷氨酸合成的调节机制谷aa比天冬aa优先合成谷aa脱氢酶谷aa对其反馈抑制和反馈阻遏柠檬酸合成酶TCA的关键酶，受能荷调节，谷aa反馈阻遏，乌头酸反馈抑制异柠檬酸脱氢酶-酮戊二酸反馈抑制-酮戊二酸脱氢酶先天丧失或微弱PEP受天冬aa反馈抑制，受谷aa和天冬 aa反馈阻遏本讲稿第三十七页，共四十页7.细胞膜通透性控制本讲稿第三十八页，共四十页本讲稿第三十九页，共四十页本讲稿第四十页，共四十页