蛋白质和多肽氨基酸序列测定PPT课件.ppt
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1、关于蛋白质和多肽的氨基酸序列测定第一张,PPT共二十二页,创作于2022年6月 蛋白质和多肽是由蛋白质和多肽是由蛋白质和多肽是由蛋白质和多肽是由2020种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长链,然后通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠、链,然后通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠、链,然后通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠、链,然后通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠、卷曲形成一定的构象并发挥其独特作用。氨基
2、酸的排列顺序即蛋白质的卷曲形成一定的构象并发挥其独特作用。氨基酸的排列顺序即蛋白质的卷曲形成一定的构象并发挥其独特作用。氨基酸的排列顺序即蛋白质的卷曲形成一定的构象并发挥其独特作用。氨基酸的排列顺序即蛋白质的一级结构决定了蛋白质的高级结构及功能。因此,测定蛋白质的氨基酸一级结构决定了蛋白质的高级结构及功能。因此,测定蛋白质的氨基酸一级结构决定了蛋白质的高级结构及功能。因此,测定蛋白质的氨基酸一级结构决定了蛋白质的高级结构及功能。因此,测定蛋白质的氨基酸序列是进行蛋白质结构功能研究中不可缺少的部分。另外,蛋白质一级序列是进行蛋白质结构功能研究中不可缺少的部分。另外,蛋白质一级序列是进行蛋白质结构
3、功能研究中不可缺少的部分。另外,蛋白质一级序列是进行蛋白质结构功能研究中不可缺少的部分。另外,蛋白质一级结构的信息也有助于对其基因结构的研究。结构的信息也有助于对其基因结构的研究。结构的信息也有助于对其基因结构的研究。结构的信息也有助于对其基因结构的研究。目前,进行蛋白质序列测定有两个关键步骤,即:目前,进行蛋白质序列测定有两个关键步骤,即:目前,进行蛋白质序列测定有两个关键步骤,即:目前,进行蛋白质序列测定有两个关键步骤,即:氨基酸残基一个一个依次从蛋白质和多肽的末端切割下来;氨基酸残基一个一个依次从蛋白质和多肽的末端切割下来;氨基酸残基一个一个依次从蛋白质和多肽的末端切割下来;氨基酸残基一
4、个一个依次从蛋白质和多肽的末端切割下来;正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基。正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基。正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基。正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基。其中第一步可采用化学法或酶法进行裂解。由于化学法较之酶法具有其中第一步可采用化学法或酶法进行裂解。由于化学法较之酶法具有其中第一步可采用化学法或酶法进行裂解。由于化学法较之酶法具有其中第一步可采用化学法或酶法进行裂解。由于化学法较之酶法具有裂解率高、易于自动化、耗费少等诸多优点,被蛋白质化学实验室普遍裂解率高、易于自动化、耗费少等诸多优点,被蛋白质化学实验室普遍裂解率高、易于自动化、耗费少等诸多优点,被蛋白质化学实验室普
5、遍裂解率高、易于自动化、耗费少等诸多优点,被蛋白质化学实验室普遍采用,可以从蛋白质和多肽的采用,可以从蛋白质和多肽的采用,可以从蛋白质和多肽的采用,可以从蛋白质和多肽的N N端进行裂解,也可以从端进行裂解,也可以从端进行裂解,也可以从端进行裂解,也可以从C C端进行分析。端进行分析。端进行分析。端进行分析。第二步通常是在氨基酸残基上衍生了一个生色基团,通过高效液相色第二步通常是在氨基酸残基上衍生了一个生色基团,通过高效液相色第二步通常是在氨基酸残基上衍生了一个生色基团,通过高效液相色第二步通常是在氨基酸残基上衍生了一个生色基团,通过高效液相色谱进行分离分析。谱进行分离分析。谱进行分离分析。谱进
6、行分离分析。本章将就蛋白质和多肽的本章将就蛋白质和多肽的本章将就蛋白质和多肽的本章将就蛋白质和多肽的N N端、端、端、端、C C端氨基酸序列分析端氨基酸序列分析端氨基酸序列分析端氨基酸序列分析的原理和方法、进行序列分析前蛋白质和多肽样品的准备作一介绍。的原理和方法、进行序列分析前蛋白质和多肽样品的准备作一介绍。的原理和方法、进行序列分析前蛋白质和多肽样品的准备作一介绍。的原理和方法、进行序列分析前蛋白质和多肽样品的准备作一介绍。第二张,PPT共二十二页,创作于2022年6月第一节第一节 N端分析原理端分析原理一、耦一、耦一、耦一、耦 联联联联 蛋白质和多肽的自由蛋白质和多肽的自由蛋白质和多肽的
7、自由蛋白质和多肽的自由 氨基经与异硫氰酸苯酯氨基经与异硫氰酸苯酯氨基经与异硫氰酸苯酯氨基经与异硫氰酸苯酯(PITC)(PITC)试试试试剂耦联后,与其紧邻的第二个残基的键合力大大减弱,很容剂耦联后,与其紧邻的第二个残基的键合力大大减弱,很容剂耦联后,与其紧邻的第二个残基的键合力大大减弱,很容剂耦联后,与其紧邻的第二个残基的键合力大大减弱,很容易断裂。易断裂。易断裂。易断裂。第三张,PPT共二十二页,创作于2022年6月二、裂二、裂二、裂二、裂 解解解解 在无水条件下酸裂解,仅仅切下反应的那个残基。紧挨的在无水条件下酸裂解,仅仅切下反应的那个残基。紧挨的在无水条件下酸裂解,仅仅切下反应的那个残基
8、。紧挨的在无水条件下酸裂解,仅仅切下反应的那个残基。紧挨的第二个氨基酸残基暴露出自由的第二个氨基酸残基暴露出自由的第二个氨基酸残基暴露出自由的第二个氨基酸残基暴露出自由的 氨基,又可与氨基,又可与氨基,又可与氨基,又可与PITCPITC进行进行进行进行耦联反应。耦联反应。耦联反应。耦联反应。第四张,PPT共二十二页,创作于2022年6月三、转三、转三、转三、转 化化化化 ATZATZ氨基酸不稳定,在三氟乙酸水溶液氨基酸不稳定,在三氟乙酸水溶液氨基酸不稳定,在三氟乙酸水溶液氨基酸不稳定,在三氟乙酸水溶液(25(25)中可转化中可转化中可转化中可转化成稳定的成稳定的成稳定的成稳定的PTHPTH氨基
9、酸。氨基酸。氨基酸。氨基酸。第五张,PPT共二十二页,创作于2022年6月第六张,PPT共二十二页,创作于2022年6月四、四、四、四、PTHPTH氨基酸的鉴定氨基酸的鉴定氨基酸的鉴定氨基酸的鉴定 可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及质谱等各种手段进行分析。近年来由于高效液相色质谱等各种手段进行分析。近年来由于高效液相色质谱等各种手段进行分析。近年来由于高效液相色质谱等各种手段进行分析。近年来由于高效液相色谱技术具有分析速度快、灵敏度高、定性定量准确谱技术具有分析
10、速度快、灵敏度高、定性定量准确谱技术具有分析速度快、灵敏度高、定性定量准确谱技术具有分析速度快、灵敏度高、定性定量准确等诸多优点,并且仪器自身结构也日臻完善,被广等诸多优点,并且仪器自身结构也日臻完善,被广等诸多优点,并且仪器自身结构也日臻完善,被广等诸多优点,并且仪器自身结构也日臻完善,被广泛应用于泛应用于泛应用于泛应用于PTHPTH氨基酸的鉴定。通常选用氨基酸的鉴定。通常选用氨基酸的鉴定。通常选用氨基酸的鉴定。通常选用C18C18反反反反相柱进行分离。相柱进行分离。相柱进行分离。相柱进行分离。第七张,PPT共二十二页,创作于2022年6月第二节第二节第二节第二节 N N端蛋白质序列仪端蛋白
11、质序列仪端蛋白质序列仪端蛋白质序列仪三、气相序列仪三、气相序列仪三、气相序列仪三、气相序列仪 自动化蛋白质序列仪刚问世时,需要样品量为自动化蛋白质序列仪刚问世时,需要样品量为自动化蛋白质序列仪刚问世时,需要样品量为自动化蛋白质序列仪刚问世时,需要样品量为1 12mg2mg。19781978年年年年TarrTarr等将一种四级铵盐聚合物等将一种四级铵盐聚合物等将一种四级铵盐聚合物等将一种四级铵盐聚合物“polybrene”polybrene”引入了蛋白质、多肽的序列测引入了蛋白质、多肽的序列测引入了蛋白质、多肽的序列测引入了蛋白质、多肽的序列测定,它能和肽链中的极性基团作用定,它能和肽链中的极性
12、基团作用定,它能和肽链中的极性基团作用定,它能和肽链中的极性基团作用(非共价键合非共价键合非共价键合非共价键合)而将蛋白质和多肽有效而将蛋白质和多肽有效而将蛋白质和多肽有效而将蛋白质和多肽有效地固定在玻璃纤维支持膜上,防止了萃取时样品的损失。为了适应分子地固定在玻璃纤维支持膜上,防止了萃取时样品的损失。为了适应分子地固定在玻璃纤维支持膜上,防止了萃取时样品的损失。为了适应分子地固定在玻璃纤维支持膜上,防止了萃取时样品的损失。为了适应分子生物学对蛋白质微量分析的要求,生物学对蛋白质微量分析的要求,生物学对蛋白质微量分析的要求,生物学对蛋白质微量分析的要求,2020世纪世纪世纪世纪8080年代初,
13、年代初,年代初,年代初,HewickHewick及及及及HunkpillarHunkpillar等人改进了自动化蛋白质序列仪中的仪器结构,它用弹筒型等人改进了自动化蛋白质序列仪中的仪器结构,它用弹筒型等人改进了自动化蛋白质序列仪中的仪器结构,它用弹筒型等人改进了自动化蛋白质序列仪中的仪器结构,它用弹筒型玻璃反应室玻璃反应室玻璃反应室玻璃反应室(内部体积约内部体积约内部体积约内部体积约0.05m1)0.05m1)代替了液相序列仪中的旋转玻璃杯,用代替了液相序列仪中的旋转玻璃杯,用代替了液相序列仪中的旋转玻璃杯,用代替了液相序列仪中的旋转玻璃杯,用polybrenepolybrene固定样品,固定
14、样品,固定样品,固定样品,EdamnEdamn降解反应中有的试剂如三甲胺以气体方式降解反应中有的试剂如三甲胺以气体方式降解反应中有的试剂如三甲胺以气体方式降解反应中有的试剂如三甲胺以气体方式输送,其他试剂以流动或液相脉冲方式输送。此仪器较之以前几种序列输送,其他试剂以流动或液相脉冲方式输送。此仪器较之以前几种序列输送,其他试剂以流动或液相脉冲方式输送。此仪器较之以前几种序列输送,其他试剂以流动或液相脉冲方式输送。此仪器较之以前几种序列仪具有以下明显优点:仪具有以下明显优点:仪具有以下明显优点:仪具有以下明显优点:灵敏度高,耗费样品量少,通常仅需灵敏度高,耗费样品量少,通常仅需灵敏度高,耗费样品
15、量少,通常仅需灵敏度高,耗费样品量少,通常仅需5050100pmol100pmol;试剂和溶剂消耗少,大约是液相序列仪的试剂和溶剂消耗少,大约是液相序列仪的试剂和溶剂消耗少,大约是液相序列仪的试剂和溶剂消耗少,大约是液相序列仪的l l1010,降低了费用;,降低了费用;,降低了费用;,降低了费用;缩短了每步降解循环时间,提高了分析效率。缩短了每步降解循环时间,提高了分析效率。缩短了每步降解循环时间,提高了分析效率。缩短了每步降解循环时间,提高了分析效率。2020世纪世纪世纪世纪8080年代末又对气相序列仪进行了部分改进,即将原来三氟乙酸年代末又对气相序列仪进行了部分改进,即将原来三氟乙酸年代末
16、又对气相序列仪进行了部分改进,即将原来三氟乙酸年代末又对气相序列仪进行了部分改进,即将原来三氟乙酸以气体方式输送改为液相脉冲方式,称为脉冲液相序列仪,以适应不同以气体方式输送改为液相脉冲方式,称为脉冲液相序列仪,以适应不同以气体方式输送改为液相脉冲方式,称为脉冲液相序列仪,以适应不同以气体方式输送改为液相脉冲方式,称为脉冲液相序列仪,以适应不同样品的分析需要。另外,由于载有活性基团的功能性样品的分析需要。另外,由于载有活性基团的功能性样品的分析需要。另外,由于载有活性基团的功能性样品的分析需要。另外,由于载有活性基团的功能性PVDFPVDF膜的问世,膜的问世,膜的问世,膜的问世,蛋白质和多肽可
17、以共价固定在此类膜上,直接在上述两种序列仪上进行蛋白质和多肽可以共价固定在此类膜上,直接在上述两种序列仪上进行蛋白质和多肽可以共价固定在此类膜上,直接在上述两种序列仪上进行蛋白质和多肽可以共价固定在此类膜上,直接在上述两种序列仪上进行固相序列分析。固相序列分析。固相序列分析。固相序列分析。第八张,PPT共二十二页,创作于2022年6月 在这两种序列仪中,在这两种序列仪中,在这两种序列仪中,在这两种序列仪中,EdmanEdman降解后的降解后的降解后的降解后的PTHPTH氨基酸衍生物可及时直接氨基酸衍生物可及时直接氨基酸衍生物可及时直接氨基酸衍生物可及时直接从转化腔中自动输入高效液相色谱仪中进行
18、从转化腔中自动输入高效液相色谱仪中进行从转化腔中自动输入高效液相色谱仪中进行从转化腔中自动输入高效液相色谱仪中进行PTHPTH氨基酸衍生物的定性及氨基酸衍生物的定性及氨基酸衍生物的定性及氨基酸衍生物的定性及定量分析,这样不仅快速可靠,而且防止了样品的损失。这两台仪器统一定量分析,这样不仅快速可靠,而且防止了样品的损失。这两台仪器统一定量分析,这样不仅快速可靠,而且防止了样品的损失。这两台仪器统一定量分析,这样不仅快速可靠,而且防止了样品的损失。这两台仪器统一用电脑控制,包括化学反应和分析鉴定以及数据的自动记录和处理。图用电脑控制,包括化学反应和分析鉴定以及数据的自动记录和处理。图用电脑控制,包
19、括化学反应和分析鉴定以及数据的自动记录和处理。图用电脑控制,包括化学反应和分析鉴定以及数据的自动记录和处理。图4.24.2为标准为标准为标准为标准PTHPTH氨基酸的色谱分离图。由图可见,欲在氨基酸的色谱分离图。由图可见,欲在氨基酸的色谱分离图。由图可见,欲在氨基酸的色谱分离图。由图可见,欲在20min20min内将各组分内将各组分内将各组分内将各组分较好分离,需选择合适的色谱条件,表较好分离,需选择合适的色谱条件,表较好分离,需选择合适的色谱条件,表较好分离,需选择合适的色谱条件,表4.14.1列出了各种条件的改变导致个列出了各种条件的改变导致个列出了各种条件的改变导致个列出了各种条件的改变
20、导致个别组分位置的迁移及图谱的改善。别组分位置的迁移及图谱的改善。别组分位置的迁移及图谱的改善。别组分位置的迁移及图谱的改善。第九张,PPT共二十二页,创作于2022年6月第十张,PPT共二十二页,创作于2022年6月第三节第三节第三节第三节 影响影响影响影响N N端端端端EdmanEdman反应裂解率的因素反应裂解率的因素反应裂解率的因素反应裂解率的因素 在测序中往往可以发现,即使在测序中往往可以发现,即使在测序中往往可以发现,即使在测序中往往可以发现,即使N N端很均一的蛋白质端很均一的蛋白质端很均一的蛋白质端很均一的蛋白质(第一个循环出现单第一个循环出现单第一个循环出现单第一个循环出现单
21、个氨基酸残基个氨基酸残基个氨基酸残基个氨基酸残基),经过十几个循环后背景明显不及第一个残基清晰。这是,经过十几个循环后背景明显不及第一个残基清晰。这是,经过十几个循环后背景明显不及第一个残基清晰。这是,经过十几个循环后背景明显不及第一个残基清晰。这是由于由于由于由于EdmanEdman反应是一个化学过程,在其耦联、裂解、转化等步骤都有可反应是一个化学过程,在其耦联、裂解、转化等步骤都有可反应是一个化学过程,在其耦联、裂解、转化等步骤都有可反应是一个化学过程,在其耦联、裂解、转化等步骤都有可能发生一些副反应,从而影响最终裂解效率。目前最佳产率为能发生一些副反应,从而影响最终裂解效率。目前最佳产率
22、为能发生一些副反应,从而影响最终裂解效率。目前最佳产率为能发生一些副反应,从而影响最终裂解效率。目前最佳产率为95959898。因此,经过。因此,经过。因此,经过。因此,经过5050次循环后,次循环后,次循环后,次循环后,PTHPTH氨基酸分析谱中将出现较多杂峰,氨基酸分析谱中将出现较多杂峰,氨基酸分析谱中将出现较多杂峰,氨基酸分析谱中将出现较多杂峰,影响正确辨认,也就是说对于一般蛋白质最多能分析至影响正确辨认,也就是说对于一般蛋白质最多能分析至影响正确辨认,也就是说对于一般蛋白质最多能分析至影响正确辨认,也就是说对于一般蛋白质最多能分析至N N端第端第端第端第5050个氨基个氨基个氨基个氨基
23、酸左右,欲知全顺序,则需将蛋白质降解成一系列肽段分析后再拼接。酸左右,欲知全顺序,则需将蛋白质降解成一系列肽段分析后再拼接。酸左右,欲知全顺序,则需将蛋白质降解成一系列肽段分析后再拼接。酸左右,欲知全顺序,则需将蛋白质降解成一系列肽段分析后再拼接。对于有些蛋白质由于含有较多的对对于有些蛋白质由于含有较多的对对于有些蛋白质由于含有较多的对对于有些蛋白质由于含有较多的对EdmanEdman反应敏感的残基或肽键,裂反应敏感的残基或肽键,裂反应敏感的残基或肽键,裂反应敏感的残基或肽键,裂解效率将更低。解效率将更低。解效率将更低。解效率将更低。循环至循环至循环至循环至SerSer和和和和ThrThr时产
24、率突然降低,这是因为在进行这两个氨基酸残基时产率突然降低,这是因为在进行这两个氨基酸残基时产率突然降低,这是因为在进行这两个氨基酸残基时产率突然降低,这是因为在进行这两个氨基酸残基分析前一个循环中,三氟乙酸除起裂解作用外,可能与分析前一个循环中,三氟乙酸除起裂解作用外,可能与分析前一个循环中,三氟乙酸除起裂解作用外,可能与分析前一个循环中,三氟乙酸除起裂解作用外,可能与SerSer和和和和ThrThr上的羟上的羟上的羟上的羟基反应,继而部分封闭基反应,继而部分封闭基反应,继而部分封闭基反应,继而部分封闭SerSer和和和和ThrThr的的的的N N端端端端氨基。氨基。氨基。氨基。另外,丝氨酸和
25、苏氨酸的另外,丝氨酸和苏氨酸的另外,丝氨酸和苏氨酸的另外,丝氨酸和苏氨酸的PTI-PTI-汀生物也会部分转化成其他产物,造汀生物也会部分转化成其他产物,造汀生物也会部分转化成其他产物,造汀生物也会部分转化成其他产物,造成产率的降低。成产率的降低。成产率的降低。成产率的降低。耦联试剂耦联试剂耦联试剂耦联试剂PITCPITC本身也将发生下列副反应,形成一些本身也将发生下列副反应,形成一些本身也将发生下列副反应,形成一些本身也将发生下列副反应,形成一些“杂质杂质杂质杂质”。测序完成。测序完成。测序完成。测序完成后,电脑将每个循环的产率处理,得出起始产率后,电脑将每个循环的产率处理,得出起始产率后,电
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