蛋白质分离纯化和表征PPT课件.ppt

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1、关于蛋白质分离纯化与表征第一张，PPT共四十三页，创作于2022年6月蛋白质分离纯化是利用其特性的差异蛋白质分离纯化是利用其特性的差异分子的大小和形状酸碱性质溶解度吸附性质对配体分子的特异生物学亲和力蛋白质纯化应根据研究工作和生产的具体目的和要求，制蛋白质纯化应根据研究工作和生产的具体目的和要求，制订分离纯化的合理程序。订分离纯化的合理程序。第二张，PPT共四十三页，创作于2022年6月 蛋白质蛋白质含有酸含有酸/碱碱AAAA残基残基具有两性具有两性 碱碱/酸酸越大越大pI pI 越大越大pI通常在通常在 6.0 左右左右一、蛋白质的酸碱性质第三张，PPT共四十三页，创作于2022年6月 蛋白

2、质的分子量蛋白质的分子量 一般在一万至一百万道尔顿之间一般在一万至一百万道尔顿之间 1道尔顿道尔顿1C12绝对质量绝对质量/12 1.6610-27千克千克二、蛋白质分子的大小与形状第四张，PPT共四十三页，创作于2022年6月测定蛋白质相对分子质量的原理和方法（一）根据化学组成测定最低相对分子质量（二）渗透压法测定相对分子质量（三）蛋白质的扩散和扩散系数（四）沉降分析法测定相对分子质量（五）凝胶过滤法测定相对分子质量（六）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量第五张，PPT共四十三页，创作于2022年6月（一）根据化学组成测定最小分子量（一）根据化学组成测定最小分子量1 1、测定蛋白质中

3、某一微量元素的含量、测定蛋白质中某一微量元素的含量2 2、假设蛋白质中仅含一个铁原子、假设蛋白质中仅含一个铁原子最低相对分子质量最低相对分子质量=100*55.8/铁的百分含量铁的百分含量例如肌红蛋白含铁量为例如肌红蛋白含铁量为0.335%，那么其最低相对分子，那么其最低相对分子质量就是质量就是55.8/0.335 100=16700第六张，PPT共四十三页，创作于2022年6月（五）凝胶过滤法测定相对分子质量（五）凝胶过滤法测定相对分子质量蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不取决于分子的质量，而是它的斯托克半价。如果某种蛋白质与一理想的非水化球体过柱速度相同，则认为具有与该球体相同的半径，称斯托克

4、半径第七张，PPT共四十三页，创作于2022年6月蛋白质混合样蛋白质混合样w 标准蛋白质（已知标准蛋白质（已知Mr和斯托克半径）和待测蛋白质必和斯托克半径）和待测蛋白质必须具有相同的分子形状（接近球形）须具有相同的分子形状（接近球形）第八张，PPT共四十三页，创作于2022年6月（六）（六）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法 测定相对分子质量测定相对分子质量蛋白质颗粒在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，蛋白质颗粒在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于：它的迁移率取决于：w所带电荷所带电荷w分子量分子量w分子形状分子形状但是如果在该系统中添加SDS和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的电泳迁移率主

5、要取决于它的相对分子质量。第九张，PPT共四十三页，创作于2022年6月第十张，PPT共四十三页，创作于2022年6月十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠原态蛋白质变性？磺酸基磺酸基 极性亲水极性亲水烷基烷基 亲油亲油（蛋白质疏水区）（蛋白质疏水区）迁移率与电荷和形状无关，仅取决于迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量相对分子质量巯基乙醇破坏二硫键第十一张，PPT共四十三页，创作于2022年6月第十二张，PPT共四十三页，创作于2022年6月第十三张，PPT共四十三页，创作于2022年6月第十四张，PPT共四十三页，创作于2022年6月蛋白质分子的形状蛋白质分子的形状蛋白质分子在溶液中的形状或构

6、象的信息，可借助其摩擦系数与理想球体的摩擦系数之比，也就是所谓的蛋白质分子的摩擦比来推测。摩擦比越大，蛋白质分子的不对称性越高。第十五张，PPT共四十三页，创作于2022年6月三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀（一）（一）胶体性质胶体性质（colloidal system）胶体溶液的特点：胶体溶液的特点：w分子直径在分子直径在1-100 nm1-100 nm内内w溶于水溶于水w不易聚集沉淀不易聚集沉淀大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液第十六张，PPT共四十三页，创作于2022年6月蛋白质胶体溶液的稳定因素：蛋白质胶体溶液的稳定因素：1.1.同种蛋白带同

7、种电荷，相互排斥同种蛋白带同种电荷，相互排斥2.2.水膜弹性水膜弹性3.3.质点的大小（质点的大小（1 1100nm100nm）w蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗运动蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质以及不能通过半透膜等性质第十七张，PPT共四十三页，创作于2022年6月（二）蛋白质的（二）蛋白质的沉淀沉淀 Pr从胶体溶液中析出从胶体溶液中析出任何破坏稳定蛋白质溶液的因素都可能使蛋白任何破坏稳定蛋白质溶液的因素都可能使蛋白质沉淀质沉淀I I 可逆沉淀可逆沉淀温和温和条件，改变溶液条件，改变溶液pH或或Pr所所带电荷带电荷Pr结构和性质没有变化结构和性质没有变化适当条件下可

8、适当条件下可重新溶解重新溶解 非变性沉淀非变性沉淀pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等第十八张，PPT共四十三页，创作于2022年6月 不可逆沉淀不可逆沉淀强烈强烈沉淀条件沉淀条件破坏破坏Pr胶体溶液胶体溶液稳定性稳定性也破坏也破坏Pr结构和性质结构和性质沉淀沉淀不能再重新溶解不能再重新溶解变性沉淀变性沉淀如加热沉淀、强酸如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐碱沉淀、重金属盐 和生物碱沉淀等和生物碱沉淀等第十九张，PPT共四十三页，创作于2022年6月1.1.盐析法盐析法加入大量中性盐（硫酸铵、硫酸钠和氯加入大量中性盐（硫酸铵、硫酸钠和氯化钠）脱去蛋白质的水化层，盐

9、析一般化钠）脱去蛋白质的水化层，盐析一般不引起变性不引起变性第二十张，PPT共四十三页，创作于2022年6月等电点沉淀的蛋白质溶液中等电点沉淀的蛋白质溶液中加入加入NaCl后沉后沉淀溶解淀溶解盐溶盐溶原因？原因？盐溶盐溶盐析盐析分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少加入少量盐离子量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中溶于水中盐溶第二十一张，PPT共四十三页，创作于2022年6月盐析向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出沉淀析出原因？原因？蛋白质脱去水化层而聚集沉淀盐析

10、（NH4）2SO4）第二十二张，PPT共四十三页，创作于2022年6月2.2.有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀脱去水化层以及降低介电常数而增加脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用带电质点间的相互作用3.3.等电点沉淀等电点沉淀蛋白质分子带有相同数量的正负电荷，因此，蛋白质分子带有相同数量的正负电荷，因此，蛋白质分子相互吸引，从而聚集沉淀。蛋白质分子相互吸引，从而聚集沉淀。第二十三张，PPT共四十三页，创作于2022年6月4.4.重金属盐沉淀重金属盐沉淀 与带负电荷蛋白质结成不溶性盐与带负电荷蛋白质结成不溶性盐5.5.生物碱试剂和某些酸类沉淀生物碱试剂和某些酸类沉淀 与带正电荷蛋白质生成

11、不溶性盐与带正电荷蛋白质生成不溶性盐6.6.加热变性沉淀加热变性沉淀 天然结构解体，疏水基外露，天然结构解体，疏水基外露，破坏水化层及带电状态破坏水化层及带电状态第二十四张，PPT共四十三页，创作于2022年6月四、蛋白质分离纯化的一般原则总目标：增加制品纯度或比活总目标：增加制品纯度或比活1.1.前处理：因动前处理：因动/植物植物/细菌而异细菌而异2.2.粗分级分离：采用盐析粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀等电点沉淀/有机有机溶剂分级分离等方法溶剂分级分离等方法3.3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等层析、吸附层析以及亲和层析等

12、4.4.结晶是最后步骤结晶是最后步骤第二十五张，PPT共四十三页，创作于2022年6月五、蛋白质的分离纯化方法（一）根据根据分子大小不同分子大小不同的纯化方法的纯化方法 1、透析和超过滤、透析和超过滤w利用蛋白质分子不能透过半透膜将其利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开与小分子物质分开w半透膜为玻璃纸或纤维素材料半透膜为玻璃纸或纤维素材料第二十六张，PPT共四十三页，创作于2022年6月血液透析血液透析小分子溶出小分子被带出小分子被带出透析机透析机透析液透析液加加压压血液血液第二十七张，PPT共四十三页，创作于2022年6月2 2、密度梯度（区带）离心、密度梯度（区带）离心用一定

13、的介质（如蔗糖）在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将蛋白质混合液置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使蛋白质分层、分离。第二十八张，PPT共四十三页，创作于2022年6月3、凝胶过滤、凝胶过滤3.凝胶过滤第二十九张，PPT共四十三页，创作于2022年6月（二）利用溶解度差别的纯化方法（二）利用溶解度差别的纯化方法 1.1.等电点沉淀等电点沉淀 调整溶液调整溶液pH 不同蛋白在各自不同蛋白在各自 pI处依次沉淀处依次沉淀 2.2.盐溶和盐析盐溶和盐析3.3.有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法w降低介电常数降低介电常数w争夺水化膜争夺水化膜影响溶解度的外部因素有：pH值、离子强度、介电

14、常数和温度。4.温度对蛋白质溶剂度的影响温度对蛋白质溶剂度的影响第三十张，PPT共四十三页，创作于2022年6月（三（三)根据电荷不同的分离方法根据电荷不同的分离方法1.1.电泳电泳原理：原理：蛋白质在非等电点时所带总电荷不为蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0 0分子大小不同，电场中移动速度也不同分子大小不同，电场中移动速度也不同第三十一张，PPT共四十三页，创作于2022年6月平板电泳平板电泳第三十二张，PPT共四十三页，创作于2022年6月等电聚焦电泳等电聚焦电泳第三十三张，PPT共四十三页，创作于2022年6月双向电泳双向电泳第三十四张，PPT共四十三页，创作于2022年6月离子交换层析

15、离子交换层析第三十五张，PPT共四十三页，创作于2022年6月（四）利用蛋白质选择性吸附的性质（四）利用蛋白质选择性吸附的性质羟磷石灰层析羟磷石灰层析疏水作用层析疏水作用层析第三十六张，PPT共四十三页，创作于2022年6月（五）利用对配体的特异生物学（五）利用对配体的特异生物学 亲和力的纯化方法亲和力的纯化方法亲和色谱颗粒亲和色谱颗粒具有极强的专一性具有极强的专一性第三十七张，PPT共四十三页，创作于2022年6月第三十八张，PPT共四十三页，创作于2022年6月（六）高效液相层析和快速蛋白质液相层析（六）高效液相层析和快速蛋白质液相层析多种类型的柱层析都可用多种类型的柱层析都可用HPLCH

16、PLC来代替，例如分配层析，来代替，例如分配层析，离子交换层析，吸附层析以及凝胶过滤。离子交换层析，吸附层析以及凝胶过滤。第三十九张，PPT共四十三页，创作于2022年6月六、蛋白质含量测定和纯度鉴定（一）蛋白质含量测定常用方法：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（Lowry法）、紫外吸收法、染料结合法（bradford或考马斯亮蓝法）和胶体金测定法。Lowry法，主要是利用folin-酚试剂能与Cu+离子反应，而Cu+是由蛋白质的巯基或酚基氧化Cu2+而产生双缩脲反应：含两个或两个以上的肽键化合物与CuSO4溶液都能发生双缩脲反应省市紫红色或蓝紫色复合物。第四十张，PPT共四十三页，

17、创作于2022年6月（二）蛋白质纯度鉴定通常采用电泳、沉降、HPLC和溶解度分析。第四十一张，PPT共四十三页，创作于2022年6月凝胶过滤和SDS-PAGE 均是利用凝胶，按照分子大小分离蛋白质的，为什么凝胶过滤时，蛋白质分子越小，洗脱速度越慢，而在SDS-PAGE中，蛋白质分子越小，迁移速度越快 凝胶过滤时，凝胶颗粒排阻Mr较大的蛋白质，仅允许Mr较小的蛋白质进入颗粒内部，所以Mr较大的蛋白质只能在凝胶颗粒之间的空隙中通过，可以用较小体积的洗脱液从层析柱中洗脱出来。而Mr小的蛋白质必须用较大体积的洗脱液才能从层析柱中洗脱出来。SDS-PAGE分离蛋白质时，所有的蛋白质均要从凝胶的网孔中穿过，蛋白质的相对分子质量越小，受到的阻力也越小，移动速度就越快。第四十二张，PPT共四十三页，创作于2022年6月19.09.2022感感谢谢大大家家观观看看第四十三张，PPT共四十三页，创作于2022年6月