上海交通大学博士论文-自身免疫性疾病的遗传易感性研究.pdf

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1、上海交通大学博士学位论文自身免疫性疾病的遗传易感性研究姓名：雷蓉申请学位级别：博士专业：医学遗传学指导教师：黄薇20090501上海交通大学医学院博士学位论文自身免疫性疾病的遗传易感性研究中文摘要自身免疫性疾病是世界上发病率和死亡率最高的病种之一。因为机体对自身抗原发生免疫应答，许多无法治愈。好发于青壮年，给人类社会带来了极大的痛苦和负担。许多研究都已经成功定位了这类复杂性状疾病的易感区域。本研究在前期连锁分析研究的基础上，在强直性脊柱炎(A S)和G r a v e s 病(G D)的定位区域内，选取候选基因进行S N P 筛查和相关性研究。我们的研究表明，L T A 和T A P 2 基因

2、独立于H L A B 2 7 与A S 存在显著的相关性，并将I L 3 定位为中国人群G D 的易感基因。第一部分目的：A S 是一种慢性炎症性关节病，主要累及骶髂关节和脊柱。遗传度高达9 0，我们前期的连锁分析将其定位于D 6 S 1 6 9 1 一D 6 S 2 7 6-D 6 S 1 6 1 8，该区域与A S 的相关性在各人群的连锁分析中都得到了证实，包含众多的M H C I I 和M H C I I I 类基因，都可能是潜在的易感基因。H L A-B 2 7 是A S 最主要的易感基因，但具体病理机制仍未可知。本研究将在该区域内探寻其他A S 易感基因的存在。方法：在该区域内选择了

3、4 个属于U P S(泛素蛋白酶系统)通路的M H CI I 类基因(L M P 2、L M P 7、T A P I S H T A P 2)，以及2 个T N F 超家族的蹦C I 类基因(L T A 和T N F)。对这六个候选基因的启动子、外显子和邻近的内含子区域在全部1 9 4 例病例$H 4 7 5 例对照样本中都进行了直接测序，并进行了病例一对照关联研究。结果：在此区域内一共发现了4 5 0 个多态位点，其中1 5 8 个M A F I。进行相关性分析后发现，有4 0 个位点具有显著性。用最严格的B o n f e r r o n i 方法进行多重检验校正后，只有1 5 个位点还具

4、有统计学意义。经过进一步H L A-B 2 7 分层分析后，确定了两个与A S 独立相关的易感位点。分别是位于L T A 基因启动子区域的r s 9 1 5 6 5 4 和T A P 2 基因I n t r o n _ 1 1 的r s 4 1 3 1 6 5 4 8。r s 9 1 5 6 5 4 的T 等位基因(P c o r r e c t e d=O 0 0 4)具有显著的致病效应(显性模式：P c o r r e c t e d=O 0 0 6，O R=2 4 7 5，C 1 9 5=1 5 9 3 3 8 4 5)，在B 2 7阳性样本中依然具有显著性(P=O 0 1 6)。r s

5、 4 1 3 1 6 5 4 8 的A 等位基因上海交通大学医学院博士学位论文(P c o r r e c t e d=2 7 0 E 0 5)具有显著的致病效应(显性模式：P c o r r e c t e d=2 8 4 E-0 5，O R=3 6 1 8，C 1 9 5=2 1 8 1 6 0 0 2)，在B 2 7 F B 性样本中依然具有显著性(P=O 0 2 7)。结论：L T A 与T A P 2 基因多态存在独立的A S 相关性。L T A 基因编码的L T(淋巴细胞毒素)Q 对次级淋巴器官组织的发育和维护具有关键作用，并通过T N F 受体途径传导信号，导致多种炎症性细胞因子

6、和化学增活素的激活。L T s(L TQ、L Tt 3)和T N F、L I G H T(L T r e l a t e di n d u c i b l el i g a n d，L T 相关可诱导配基)共同组成信号网络，对于先天性和获得性免疫应答都具有重要的调节作用，本研究首次确定了它与A S 的相关性。T A P 2 基因编码的产物属于A T P 依赖性转运蛋白，负责各种分子胞内膜和胞外膜的转运，与多向性抗药有关。T A P I 和T A P 2 组成的异二聚体表达于内质网膜。负责将蛋白酶体水解产生的内源性抗原肽转运至内质网腔，与H L AI 类分子形成稳定的复合物后才能提呈给T 细胞，

7、不同T A P 分子具有不同的多肽亲和力，在抗原选择和M H CI类分子表面再生水平上亦有不同。第二部分目的：G D 是常见的组织器官特异性自身免疫病，受遗传背景和多种因素影响，最近的调查表明甲亢发病率为O 2 5、1 0 9。此前，我们和日本人群的连锁分析曾将东亚人群定位于5 q 3 1 3 3。本研究选用T a gS N P 研究该区域多态位点的相关性。方法：共选择了1 9 个候选基因，包括6 个甲状腺特异表达基因，分别与凋亡(L A R S、S P I N E l)、转录(P O U 4 F 3、T C E R G I、P P P 2 R 2 B)及信号转导D P Y S L 3、P P

8、 P 2 R 2 B 有关。和1 3 个免疫相关基因，依次是：I L 3、S L C 2 2 A 4、S L C 2 2 A 5、I R F I、I L 5、I L l 3、I L 4、I L 9、G C C R、H L A H B I、A D R B 2、I L l 2 B 和I L I T B。通过测序(病例：2 4 v s 对照：2 4)共发现了1 9 2 个多态位点，选取了5 1 个T a gS N P s 分别采用来自上海(4 2 8 例病例和6 9 0 例对照)和山东(6 8 例病例矛I J 4 7 1 例对照)的2 组独立样本进行基因分型和关联研究，均属中国汉族人群。结果：用南方

9、人群进行T a gS N P 筛查后发现I L 3 基因的非同义突变位点r s 4 0 4 0 1(P 2 7 S)与G D 相关，对其所在的b l o c k 进行精细定位后，发现r s 4 0 4 0 1 或与之完全连锁的r s 3 1 4 8 0 是造成这种相关性的真正信号位点，r s 3 1 4 8 0 位于I L 3 基因5 端附近，上海交通大学医学院博士学位论文P a l l e l e =0 0 3，隐性模式下具有显著的致病效应：O R=I 5 3，C 1 9 5=1 6-2，。P=O 0 0 2。用北方人群样本进行验证后在北方人群和联合样本中表现出更强的相关性。北方人群P a

10、l l e l e =O 0 0 2，隐性模式：O R=I 7 6，C 1 9 5=1 3 2-2 3 6，P=0 0 0 1；联合样本P a l l e l e =O 0 0 0 7，隐性模式：O R=I 6 3，C 1 9 5=1 3 4 1 9 9，P=4 E-0 6。结论：本研究确定了I L 3 基因多态在中国人群中与G D 的相关性。I L 3 是种已经研究的非常充分的细胞因子，具有参与神经发育、刺激细胞生长、抑制细胞凋亡、增强造血作用等多种生物学功能，但主要功能是在体内作为致炎(炎症前)细胞因子，虽然机制尚不明确，对G D 的影响却毋庸置疑。关键词：强直性脊柱炎，G r a v e

11、 s 病，易感基因，测序，标签位点，关联研究上海交通大学医学院博士学位论文T h eG e n e t i cS u s c e p t i b i l i t yO fA u t o i m m u n eD i s e a s eA b s t r a c tA u t o i m m u n ed i s e a s e sa r em a jo rc a u s e so fm o r b i d i t ya n dm o r t a l i t yt h r o u g h o u tt h ew o r l d M a n yo ft h e s ed i s e a s e s

12、t e n dt ob ed i f f i c u l to ri m p o s s i b l et oc u r e，f o rt h eo b v i o u sr e a s o nt h a tt h ef o c u so ft h ei m m u n er e s p o n s e，s e l fa n t i g e n s c a n n o tb ee l i m i n a t e d T h ep h y s i c a l，p s y c h o l o g i c a la n de c o n o m i cb u r d e no ft h e s ed

13、 i s e a s e si se s p e c i a l l yd e v a s t a t i n gb e c a u s et h e yo f t e na t t a c ky o u n ga d u l t s S e v e r a ls t u d i e sr e p o r t i n gt h em a p p i n go fs u s c e p t i b i l i t yl o c ii nt h e s ec o m p l e xh u m a nt r a i t s，i n c l u d i n go u rp r e v i o u ss

14、 t u d yw i t ha n k y l o s i n gs p o n d y l i t i s(A S)a n dG r a v e s d i s e a s e(G D)T h ea i mo fO U rs t u d yi st od e t e c tt h eS N Po fc a n d i d a t eg e n e sl o c a t e dw i t h i nr e g i o n so fl i n k a g et ot h e s ed i s e a s e sa n di d e n t i f yt h e i ra s s o c i a

15、 t i o n O u rs t u d yp r o v i d e sc o n v i n c i n ge v i d e n c et h a tL T Ag e n ea n dT A P 2g e n ea r ea s s o c i a t e dw i t hA Si n d e p e n d e n t l yo fH L A-B 2 7，a n dt h a tI L 3g e n ei sas u s c e p t i b i l i 押l o c u sf o rG Di nC h i n e s ep o p u l a t i o n P a r tIO

16、b j e c t i v e：A n k y l o s i n gs p o n d y l i t i s(A S)i sac h r o n i ci n f l a m m a t o r yj o i n td i s e a s et h a tc h i e f l ya f f e c t st h es a c r o i l i a cj o i n t sa n dt h es p i n e A Si sk n o w nt ob eh i g h l yh e r i t a b l e，w i t h 9 0 o ft h er i s ko fd e v e l

17、 o p i n gt h ed i s e a s ed e t e r m i n e dg e n e t i c a l l y W eh a v ep r e v i o u s l yd e m o n s t r a t e dl i n k a g eo fA St oc h r o m o s o m eD 6 S16 91 D 6 S 2 7 6 D 6 S1618，ar e g i o nc o n t a i n i n gv a r i o u sM H CI Ia n dM H CI I Ig e n e s，w h i c hi n c l u d e ss e

18、v e r a ls t r o n gc a n d i d a t e sf o ri n v o l v e m e n ti nt h ed i s e a s e，a n dt h i si sc o n s i s t e n tw i t ho t h e rl i n k a g es t u d i e sa c r o s sm u l t i p l ep o p u l a t i o ng r o u p s A Si so n eo ft h eb e s te x a m p l e so fd i s e a s e sl i n k e dt og e n N

19、 i cm a r k e r sa sH L A-B 2 7，b u tt h ep a t h o p h y s i o l o g yo fA Sr e m a i n sl a r g e l yu n k n o w n W eu n d e r t o o kt h i ss t u d yt oi n v e s t i g a t et h es u s c e p t i b i l i t yo fo t h e rc a n d i d a t eg e n e sl o c a t e di nt h i sr e g i o nt oA Si nt h eC h i

20、 n e s eH a np o p u l a t i o n M e t h o d s：W ep i c k e d4M H CI Ig e n e si n c l u d i n gL M P 2，L M P 7，T A P1a n dT A P 2，w h i c ha r ea l li n v o l v e di nU P Sp a t h w a y A n d2M H CI I Ig e n e si n c l u d i n gL T Aa n d盯虾，w h i c hb e l o n gt oT N Fs u p e r f a m i l y w es c r

21、 e e n e df o rS N P sb yr e s e q u e n c i n gt h e4一圭塑奎望奎兰堕兰堕堡主兰堡笙塞一_ _ _ _ _ 一一一一p r o m o t e r sa sw e l la se x o n sa n di n t r o n sO ft h e s e6g e n e si nS o u t h e a s t e r nC h i n e s es a m p l e s舶ms h a n g h a i，i n v o l v i n ga l l19 4A Sp a t i e n t sa n d4 7 5u n r e l a

22、t e dc o n t r o l s，t oc a r r i e do u tc a s e c o n t r 0 1a s s o c i a t i o ns t u d i e s R e s u I t s：W ei d e n t i f i e d4 5 0p o l y m o r p h i s m si nt h e s er e g i o n sa n d15 8o ft h e mw i t hM A F 1 C a s e-c o n t r o la n a l y s i ss h o w e dt h a tt h e r ew e r e4 3S N

23、P ss t a t i s t i c l ys i g n i f l c a n t A f t e rC o r r e c t e dw i t hB o n f e r r o n it e s t，o n l y15S N P sw e r es t i l la s s o c i a t e dw i t hA S T h e nw ef u r t h e ra n a l y s e db ys t r a t i f i e dw i t hH L A-B 2 7，t w on o v e la l l e l ew e r er e v e a l e da L s

24、s o c i a t e dw i t hr i s kf o rA Si n d e p e n d e n t l y R s 915 6 5 4(T)l o c a t e di np r o m o t e ro fL T Ag e n ei sa s s o c i a t e dw i t hr i s kf o rA S(P c o r r e c t e d=0 0 0 6，O R=2 4 7 5，C 1 9 5=1 5 9 3 3 8 4 5i nd o m i n a n td i s e a s em o d e l)t h eTa l l e l ei ss i g

25、n i f i c a n t l yi n c r e a s e di nc a s e(P c o r r e e t e d 2 0 0 0 4)，e v e ni nH L A-B 2 7p o s i t i v eg r o u p(P=0 016)r s 41316 5 4 8(A)l l o c a t e di nI n t r o n 一11o fT A P 2g e n es h o W Ss t r o n ga s s o c i a t i o nw i t hr i s kf o rA S(P m c t c d=2 8 4 E 0 5，0 R j 3 6 18

26、，C 1 9 5=2 1 8 1 6 0 0 2i nd o m i n a n td i s e a s em o d e l),t h eAa l l e l ei ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di nc a s e(P c o r r c c t c d-2 7 0 E 0 5)，e v e ni nH L A-B 2 7p o s i t i v eg r o u p(P=0 0 2 7)C o n c l u s i o n：A s s o c i a t i o ns t u d i e sh a v er e v e a l

27、 e dt h a tL T Ag e n ea n dT A P 2g e n ea p p e a r e dt oc o n t a i n st h em o s tl i k e l ys u s c e p t i b i l i t yv a r i a n to ft h ed e t e c t e dr e g i o nf o rA Si n d e D e n d e n t l yo fH L A-B 2 7 L TQi sc r i t i c a li nt h ed e v e l o p m e n ta n dm a i n t e n a n c eo f

28、o r g a n i z e ds e c o n d a r yl y m p h o i do r g a n s a n ds i g n a l st h r o u g ht h eT N Fr e c e p t o rp a t h w a y 1 e a d st oa c t i v a t i o no fv a r i o u si n f l a m m a t o r yc y t o k i n e sa n dc h e m o k m e S I n d e e d，L T s(L T a n dL TB)，t o g e t h e rw i t hT N

29、Fa n dL I G H T(L T-r e l a t e di n d u c i b l el i g a n d)f o r ma ni n t e g r a t e ds i g n a l i n gn e t w o r kw h i c hi si m p o r t a n tf o rt h er e g u l a t i o no fb o t hi n n a t ea n da d a p t i v ei m m u n er e s p o n s e s I nt h i sr e g a r d，L TQh a sb e e ni m p l i c a

30、 t e di nt h ep a t h 0 1 0 9 yo fA S T h em e m b r a n e a s s o c i a t e dp r o t e i ne n c o d e db yT A P 2i sam e m b e ro ft h es u p e r f a m i l vo fA T P b i n d i n gc a s s e t t e(A B C)t r a n s p o r t e r s A B Cp r o t e i n st r a n s p o r tv a r i o u sm o l e c u l e sa c r o

31、 s se x t r a a n di n t r a-c e l l u l a rm e m b r a n e s T h i sp r o t e i n1 Si n v o l v e di nm u l t i d r u gr e s i s t a n c ea n da n t i g e np r e s e n t a t i o n T h i sp r o t e i nf o r m sah e t e r o d i I n e rw i t hT A P1i no r d e rt ot r a n s p o r tp e p t i d e sf r o

32、mt h ec y t o p l a s mt ot h ee n d o p l a s m i cr e t i c u l u m M u t a t i o n si nt h i sg e n em a yb ea s s o c i a t e dw i t hd i f f e r e n tp e p t i d es e l e c t i v i t ya n dl e v e lo fr e s t o r a t i o no fs u r f a c ee x p r e s s i o no fM H Cc l a s sIm o l e c u l e s 5上

33、海交通大学医学院博士学位论文P a r t O b j e e t i v e：G Di So n eo ft h em o s tc o m l l l o nh u m a na u t o i m m u n ed i s e a s e sw i t hr e c e n td a t as h o w i n gap r e v a l e n c eo fc l i n i c a lh y p e r t h y r o i d i s mo f0 2 5-1 0 9，i ti sac o m m o no r g a n-s p e c i f i ca u t o i m m

34、 u n ed i s o r d e r，w h i c hi sm u l t i f a c t o r i a la n dd e v e l o p si ng e n e t i c a l l ys u s c e p t i b l ei n d i v i d u a l s W ea n do t h e r sh a v ep r e v i o u s l yi m p l i c a t e dc h r o m o s o m a lr e g i o n5 q 31 3 3f o rc o n t r i b u t i o nt ot h eg e n e t

35、i cs u s c e p t i b i l i t yt oG Di nE a s t-A s i a np o p u l a t i o n si nl i n k a g es t u d i e s H e r ew eu s e dt a gs i n g l en u c l e o t i d ep o l y m)w i mo r p h i s m s(S N P st os e a r c hforgeneticv a r i a n t sa s s o c i a t e dG Da n de x a m i n e df u n c t i o n a lc a

36、 n d i d a t eg e n e si nt h i sc h r o m o s o m a lr e g i o n M e t h o d s：W ep i c k e d19c a n d i d a t eg e n e si n c l u d i n gs i xg e n e sw h i c hh a v ed e t e c t a b l ee x p r e s s i o ni nh u m a nt h y r o i da n dw e r ei m p l i c a t e di ns e v e r a lc e l l u l a rp r o

37、c e s s e s，a sa p o p t o s i s(L A R Sa n dS P I N K l)，t r a n s c r i p t i o n(P O U 4 F 3，T C E R G la n dP P P 2 R 2 B)a n ds i g n a lt r a n s d u c t i o n(D P Y S L 3a n dP P P 2 R 2 B)A n do t h e rt h i r t e e no n e sc o n t a i nac l u s t e ro fc y t o k i n ea n di m l T l u n e r

38、e l a t e dg e n e s，n a m e l yI L 3，S L C 2 2 A 4，S L C 2 2 A 5，1 5I R F l，I L 5，I L l 3，I L 4，I L 9，G C C R,H L A H B l，A D R B 2，I L l 2 Ba n dI L l 7 B W ei d e n t i f i e d1 9 2p o l y m o r p h i s m sb yr e s e q u e n c i n gi n4 8i n d i v i d u a l s(2 4c a s e sa n d2 4c o n t r o l s)，

39、a n ds e l e c t e d51t a g S N P sg e n o t y p e dt oc a r r yo u ta s s o c i a t i o ns t u d i e si n2i n d e p e n d e n tC h i n e s eh a nc o h o r t s(S o u t h e a s t e r nC h i n e s ef r o ms h a n g h a ia n dE a s t e r nC h i n e s ef r o ms h a n d o n g)，i n v o l v i n g(4 2 8c a

40、s e sa n d6 9 0c o n t r o l s)a n d(4 6 8c a s e sa n d4 71c o n t r o l s)r e s p e c t i v e l y C o n c l u s i o n：I n i t i a la n a l y s i ss u g g e s t e dan o n s y n o n y m o u sS N Pr s 4 0 4 01(P 2 7 S)o fi n t e r l e u k i n3(I L 3)w a sa s s o c i a t e dw i t hG D，i nac a s e c o

41、n t r o lc o l l e c t i o no fS o u t h e a s t e mH a nC h i n e s es u b j e c t s a n df u r t h e rf i n e-m a p p i n gs h o w e dr s 4 0 4 01(P a l l e l e 2 0 0 3；R e c e s s i v ed i s e a s em o d e l：O R=I 5 3，C 1 9 5=1 6 2，P=0 0 0 2)，o ri t sp e r f e c tp r o x yS N Pr s 31 4 8 0i nt h

42、e5 f l a n k i n gr e g i o no fI L 3，f u l l ya c c o u n t e df o rt h ea s s o c i a t i o ns i g n a la tt h i sl o c u s W er e p l i c a t e ds i g n i f i c a n ta s s o c i a t i o no f r s 4 0 4 01w i t hG Di na i li n d e p e n d e n ts a m p l ec o l l e c t i o no fn o r t hH a nC h i n

43、e s e S t r o n g e rv a l i d a t i o no ft h i sa s s o c i a t i o nw e r er e v e a l e di nn o r t hH a nC h i n e s e(P a l l e l e =0 0 0 2；R e c e s s i v ed i s e a s em o d e l：O I P l 7 6，C 1 9 5=1 3 2 2 3 6，P=0 0 0 1)a n dt h ec o m b i n e da n a l y s i s(P a l l e l e =0 0 0 0 7；R e c

44、 e s s i v ed i s e a s em o d e l：O I P1 6 3，C 1 9 5=1 3 4 1 9 9，P=4 E 0 6)R e s u l t s：T h i ss t u d yp r o v i d e sc o n v i n c i n ge v i d e n c et h a tI L 3g e n ei sas u s c e p t i b i l i t y6上海交通大学医学院博士学位论文l o c u sf o rG D i nC h i n e s ep o p u l a t i o n I L 3i saw e l l-s t u d

45、i e d c y t o k i n et h a tr e g u l a t e st h ep r o l i f e r a t i o n,d i f f e r e n t i a t i o n，a c t i v a t i o na n ds u r v i v a lo ft h r e eh e m a t o p o i e t i cl i n e a g e si nb o n em a r r o w B u ti tm a yf u n c t i o ni nv i v op r e d o m i n a n t l ya sap r o i n f l

46、a m m a t o r ye y t o k i n ea n dr e p r e s e n t sap o t e n t i a lc a n d i d a t ef o rG D K e yw o r d：a n k y l o s i n gs p o n d y l i t i s，G r a v e Sd i s e a s e，s u s c e p t i b l eG e n e，r e s e q u e n c i n g，t a g S N P，a s s o c i a t i o ns t u d y1上海交通大学医学院博士学位论文A I T DA P C

47、A SC IG DG W A SH W EL DM A FM S0 RR AS L ES N PS P AU P ST 1 D缩略词A u t o i m m u n et h y r o idd is e a s e s自身免疫性甲状腺疾病a n t i g e n p r e s e n t i n gc e l l s抗原呈递细胞a n k y l o s i n gs p o n d y li t iSc o n f i d e n c ei n t e r v a l S强直性脊柱炎置信区间G r a v e s d i s e a s e格雷夫斯(氏)病g e n o m e w

48、i d ea s s o c i a t i o ns t u d i e s全基因组关联研究H a r d y-W e i n b e r ge q u i1i b r i u m哈迪温伯格平衡li n k a g ed is e q u i1i b r i u mm i n o ra ll e lef r e q u e n c ym u l t i p l es c l e r o s i SO d d sr a t i o sr h e u m a t o i da r t h r i t i S连锁不平衡最小等位基因频率多发性硬化比值比类风湿关节炎s y s t e m icl u

49、p u se r y t h e m a t o s u s系统性红斑狼疮s i n g l en u c l e a rp o l y m o r p h i s m单核苷酸多态性s e r o n e g a t i v es p o n d y l o a r t h r o p a t h i 血清阴性脊柱关节病U b i q u i t i n P r o t e a s o m eS y s t e m泛素蛋白酶系统t y p e 一1d i a b e t e sI 型糖尿病；胰岛素依赖性糖尿病上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独

50、立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：E t 期：年月日上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在一年解密后适用本授权书。本学位