益生素生产技术基础知识.docx

《益生素生产技术基础知识.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《益生素生产技术基础知识.docx（30页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第30页 共30页益生素生产技术基础知识1、益生素简介1.1益生素的概念益生素是微生态调节剂的一个种类，也可叫做微生物饲料添加剂。我国动物微生态学家和营养学家将其定义为：在动物微生态学理论的指导下，用正常微生物群成员，通过鉴定、培养、干燥等一系列工艺制成的一种活菌制剂及其代谢产物。它可直接饲喂动物，以促进动物生产性能为目的的活菌制剂。但也有学者认为益生素也应包括灭活菌体及代谢产物、和具有调节动物微生态平衡的其它制剂。微生态调节剂是指能够调节动物微生态平衡、促进动物健康及生产性能的制剂，其主要包括：益生素、益生源、合生素。益生源的

2、概念：益生源是一种不被宿主消化，能选择性地刺激一种或几种肠内常住菌的活性或生长繁殖，并能增进宿主健康的可食用物质。目前畜牧业用的益生源主要是低聚糖。合生素的概念：合生素是由益生素与益生源或其它功能成份复配而成的制剂。益生素的其它定义：直接饲喂的微生物制品（美国食品与医药管理局）。能够促进肠内菌群平衡，对宿主起有益作用的活菌制剂。含活菌或死菌包括其组分和代谢产物的微生物制品，经口或其它粘膜途径投入，旨在改善粘膜表面微生物或酶平衡，或者刺激特异性或非特异性免疫机制的制品。1.2益生素的种类按制品剂型可分为：液体剂型和固体剂型液体剂型：一般是将发酵菌悬液（或浓缩液）与其它功能成份混合复配制成。 固体

3、剂型：一般是将发酵液或收集的菌体附着于载体经干燥、粉碎、包装而成。 按制品所含有效微生物种类多少的不同可划分为：单一有效菌剂，多菌复合剂。单一有效菌剂：即有效活菌为某一种微生物构成的制剂，如乳酸菌剂、芽孢菌剂、酵母菌剂。商品如“赐美健”等都是单一菌剂。多菌复合剂：即有效菌是由二种或二种以上微生物构成的制剂。国内大部分是此类型制剂。按是否添加非微生物功能成份可分为：单纯微生物制剂，复合制剂单纯微生物制剂：即主要有效成份为微生物。复合制剂：即主要有效成份由微生物和其它功能成份（如酶制剂、寡糖等）共同组成。如：星星协力公司的产品，宝来利来的产品。1.3 益生素生产的常用菌1.3.1益生素生产用菌应具

4、备的条件：1.3.1.1必须具备的条件（1） 安全性。生产用菌不能产生有毒有害物质。从原则上讲，所用菌种必须进行严格的毒性试验，证实其安全性后方可使用。（2） 具有促进动物体内菌群平衡或预防失衡的功能。1.3.1.2其它非必备条件（1） 营养功能。能够分泌产生营养性物质或产生利于营养物质形成及吸收的物质，防止有害物积累的功能。这对促进动物生长，保持健康有直接的关系。（2） 具有产生抗菌物质的能力。如产生抗菌素、有机酸等。（3） 对动物肠壁具有粘附性能和定植抗力。此功能可使有益菌在肠道中长期发挥作用，可排斥病原菌的侵袭，是高档益生素应具备的条件。（4） 具有一定的抗逆性。a、应能耐受胃酸、胆汁、

5、胰液而不失活的。b、制成品中活菌应能保持较长时间。（5） 在肠道环境内具有较好的繁殖和代谢能力。（6） 生产的可操作性。做为一种工业制品，必须考虑生产成本及操作的可行性。应选择易培养、易保存、特性遗传稳定、生产工艺简单的菌株。1.3.2 常用菌及其功能特点1.3.2.1乳酸菌乳酸菌是指能发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称。这个名称以分类学而言是不规范的。益生素所用乳酸菌最好是从该动物消化道中分离获得，以利于在宿主体内定植。由乳酸菌制得的益生素，一般为活菌制剂，但也有少数为灭活菌体与其代谢产物制成的制剂，其作用原理解释为：灭活的菌体能与肠壁粘膜结合起到占位优势，防止有害菌的侵袭代谢产物具有抗

6、菌物质。我国农业部允许用作饲料添加剂的乳酸菌有：干酪乳杆菌、植物乳杆菌、粪链球菌、屎链球菌、乳酸片球菌、嗜酸乳杆菌、乳链球菌，共七种。乳酸菌的功能与作用机制：（1）预防肠道功能紊乱，调节肠道菌群平衡。乳酸菌通过自身代谢产物和其它细菌之间的相互作用调整菌群之间的关系，维护和保证菌群最佳优势组合和组合的稳定。这种作用主要取决于其粘附、竞争、占位和产生抑菌物的特性。乳酸菌可产生如下抗性物质：产酸。乳酸菌在体内发酵糖类，产生大量乳酸、醋酸，使环境PH下降，肠道处于酸环境；对病原性沙门氏菌、志贺氏菌、金黄葡萄球菌等具有拮抗作用，抑制其生长。产生过氧化氢。某些乳酸菌可产生H2O2，抑制葡萄球菌等致病的生长

7、，在细菌种群间的相互竞争中占优势。产生酶类。某些乳酸菌产生胞外糖苷酶，可降解肠粘膜上皮细胞的复合多糖，由于这些糖是致病菌和细菌毒素的潜在受体，通过酶的作用，可以防止毒素对上皮细胞的粘附和侵入。产生抗菌素。许多乳酸菌产生抗菌素，可对体外多种病原菌有拮抗作用。分解胆盐。有些乳酸菌可将结合的胆酸分解为游离的胆酸，游离的胆酸对细菌有较强的抑制作用。（2）免疫复活功能。大量研究证明，乳酸菌具有诱导干抗素、促进细胞分裂、产生体液免疫和细胞免疫的功能。（3） 营养作用。乳酸菌发酵后产生的有机酸，可提高Ca2+ 、Fe3+等的利用率，促进铁和维生素D的吸收。（4）控制内毒素。乳酸菌可抑制肠道内腐败菌的繁殖，从

8、而减少肠道中毒胺、靛基质、吲哚、氨、硫化氢和尿素酶的含量，使血液中毒素和氨含量下降，从而也降低了肝脏负担。1.3.2.2芽孢杆菌动物肠道中另星存在芽孢杆菌，用于益生素的芽孢杆菌是肠道的过路菌，不能定植于肠道中。现农业部允许用于饲料添加剂的芽孢杆菌有：枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌。益生素中的芽孢杆菌具有以下功能：(1) 促进有益菌的生长。基于“生物夺氧”学说，芽孢杆菌(好氧的)能消耗肠道内氧气，造成厌氧环境，有利于厌氧菌生长，从而使失调的菌群平衡调整为正常状态，达到防治疾病的目的。(注：正常情况下，动物肠道中占优势的微生物主要由厌氧菌群构成，对数平均值在99%以上)此项功能是非常重要的，它可派生出

9、乳酸菌的所有功能。(2) 拮抗肠道内有害菌大量研究表明，芽孢杆菌能产生多肽类抗菌物质，抑制病原菌在肠道内繁殖。 (3) 产生多种消化酶，促进营养的吸收。可产生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等，参与饲料消化，促进动物生长。 (4) 增强机体免疫力，提高抗病能力。研究发现，饲喂有益芽孢杆菌可促进机体免疫器官的生长发育，提高机体的免疫能力。(5) 促进动物器官的生理机能成熟，改善动物的生产性能。 研究表明，饲用有益芽孢杆菌可促进肠道结构和机能的成熟，可增强机体对糖原的利用程度，提高多糖代谢水平及提高蛋白质合成水平。1.3.2.3酵母菌酵母菌用于益生素：一种是活性酵母制剂，一种是酵母培养物。酵母及其培养物的应

10、用年代已久，开始多用作反刍动物的蛋白质资源，实践证明，酵母及其培养物对促进反刍动物生产性能有明显效果。对其作用机理一般认为：酵母及其培养物具有刺激瘤胃微生物群生长的作用。进而派生出：增加乳酸的利用、提高氨利用率、增加蛋白合成、稳定瘤胃PH值、提高纤维素消化率等等作用。其能够刺激瘤胃微生物生长的原因一般解释为：含有丰富的维生素(B)、酶、多肽及未知生长因子等促进瘤胃微生物生长的物质。现在酵母及培养物已广泛应用于各种动物的养殖中。目前农业部允许用于益生素的酵母菌有：啤酒酵母、产朊假生酵母。用做益生素的其它微生物还有光合细菌、曲霉、放线菌、拟杆菌、蛭弧菌等。2、常见的生产工艺流程根据所用菌种特点、剂

11、型及生产条件，益生素可采用如下生产流程：2.1液体发酵类试管菌种菌种扩培（可用三角瓶或茄瓶） 菌悬液 种子罐培养 培养菌液发酵罐培养 发酵菌液 （发酵菌体分离 载体混合 浓缩 其它成份复配乏液） 菌泥湿菌粉 发 载体 混合（可造粒） 干 燥 酵 包装湿菌粉 干菌粉 液 干 燥 复 配其它成份 干菌粉 载体混合 复配其它成份粉 碎 包 装 湿菌粉干菌粉 干 燥包装其它成份复 配 复配其它成份包 装包装注：对于易失活的乳酸菌，可在适当的生产环节做包被处理。2.2固体发酵类试管菌种菌种扩培（三角瓶液体培养或固体培养或茄瓶斜面培养）种子发酵罐培养固体培养 固体种子 液体种子液固体发酵发酵物干燥干燥物粉

12、碎加其它成份复配包装益生素的生产从工艺过程上看很简单，但从产品功效对生产要求的角度来考虑，其生产技术变得即深遂又复杂。3、菌种的选育、制备与管理筛选出高性能的菌株是益生素产品的技术核心。好的菌种及其培育、加工过程是保证益生素生态效应的基础。如何选育或构建优良菌株，进而确定培养条件涉及多学科、多层次的理论与技术问题。3.1菌种的选择依微生态学原理，按来源于自然、回归于自然的准则，选出与宿主、原环境、原微生态、原微群落相适应的菌种是最理想的。但实际上很难做到。当前，人们一般是从历史成果、微生物学特性、饲喂效果、生产特性等出发进行选种。选择的菌种应具备的条件见1.3.1益生素生产用菌应具备的条件，但

13、一个菌株一般不会满足所有的条件。3.2菌种的选育为了提高菌种的有益功能，常常需要对菌种进行改造。菌种的改造可通过诱变或遗传工程的手段。在一般的中小企业中诱变育种是最广泛使用的手段。以下简要介绍诱变剂及诱变育种的步骤和方法。3.2.1诱变剂与诱变处理常用诱变剂大体可分为物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂三类。物理诱变剂有：紫外线、X射线、射线、快中子、射线、射线、超声波、激光等。化学诱变剂有：碱基类似物、烷化剂及移码诱变剂等。工业常用的有：紫外线。紫外线诱变的有效波长范围是200300纳米。紫外线所以能杀菌或诱变，主要是紫外线的作用光谱与核酸的吸收光谱一致，DNA最易受紫外线的影响。一般诱变用紫

14、外线由15W、30W紫外灯提供。紫外线处理细胞悬浮液的方法：取培养好的新鲜斜面菌种，用灭菌生理盐水洗下，倒入盛有玻璃珠的100ml三角瓶中，充分摇动10分钟，用滤纸或脱脂棉过滤，得分散单孢子悬浮液。调整悬浮液密度为105106个/ml;吸取上述孢子悬浮液45ml，倾于直径为9cm底部平整的平皿中，因紫外线易被水吸收，故皿内孢子悬浮液厚度不需要超过2mm。照射前先开紫外灯20分钟，使灯的功率稳定。培养皿置于磁力搅拌器上，放在紫外灯正中下方，距离20cm，先整个平皿照射1分钟，打开盖，并启动电磁搅拌器，照射一定时间。关紫外灯，将照射后的孢子悬浮液涂平皿、培养。电离辐射时，常用的电离辐射有、X射线、

15、射线、射线和快中子等。它们都是电磁波，并以量子形成放射能量，作用于某物质时，产生电离作用，导致DNA结构的改变，引起突变。X射线由X光机产生，射线来自于放射性同位素及核反应堆，使用剂量一般为215万伦琴。快中子来自核反应堆或加速器，使用剂量10150千拉德。电离辐射的使用：用薄壁小试管或塑料容器盛装待处理菌悬液或菌落，放置在辐射源前一定距离进行照射。然后稀释涂平皿培养。碱基类似物，这是一类分子结构和天然碱基相似的化合物。这些化合物作为微生物的培养基时，很容易渗入到微生物DNA分子中去，通过DNA复制而引起突变。常用碱类似物有嘧啶、嘌呤类似物：如5溴尿嘧啶（5Bu或5Fu），2氨基嘌呤（2Ap）

16、等等。碱基类似物的使用：将待处理微生物涂布于含一定浓度的碱基类似物培养基平皿上，在培养中得到处理，5Bu或5Fu的剂量为530mg/ml，如菌体经过饥饿培养，可提高碱基类似物的渗入量，诱变效果更好。烷化剂。烷化剂主要包括：硫芥、氮介、环氧衍生物、硫酸酯、亚硝基类化合物、重氮烷、乙撑亚胺等，是一类重要的诱变剂。常用的烷化剂：甲基磺酸乙脂（EMS）、亚硝基胍（NTG）、硫酸二乙脂、亚硝基乙基尿、乙撑亚胺。烷化剂的使用：（可参考相关书籍）。3.2.2诱变育种的步骤与方法诱变育种包括诱变和筛选两个步骤，即用诱变剂处理微生物细胞，引起突变，再通过筛选，获得优良菌株。其流程如下：出发菌株原种特性考察斜面培

17、养或液体培养单孢子悬液菌悬液诱变处理稀释涂布观察菌落形态，选取功能菌株挑取单菌落接斜面或平皿对照试验保藏菌种（沙土、冻干、砖坯胶、琼脂斜面等）传种斜面平皿或摇瓶复筛选高性能菌株、保藏，并做稳定性试验，安全鉴定放大试验（可用发酵罐）各项鉴定投入生产一些要考虑的问题：（1） 出发菌株的选择。一般选取已具有某项功能，但需加强的常用生产菌株。（2） 在众多菌株中，选取对诱变剂敏感性强、变异幅度大的菌株。在不了解出发菌株敏感性的条件下，同时采用多个出发菌株以提高工作效率。（3） 诱变用的菌悬液应是生理状态一致的单细胞或单孢子的悬液，处理前尽可能使细胞达到同步生长状态。（4） 诱变剂及剂量的选择：不同微生

18、物对各诱变剂的敏感性不一样，不断变换诱变剂比使用单一诱变剂效果好，几种诱变剂复合处理比用一种诱变剂好。诱变剂剂量的选择依类型、出发菌株及其生理状态不同而不同。（5）诱变剂都是致癌物，操作时应小心。3.2.3平皿快速检测的一些方法（1） 耐酸菌株的筛选耐酸菌株的筛选可采用“梯度平板法”（具体操作见相关书籍），选择醋酸为抗性物，将出发菌株经诱变后，稀释成一定的倍数，涂布于梯度平板上，选取抗性菌株，其后要反复训化，多次筛选。（2）耐热菌株的筛选可采用“一次性筛选法”（3）耐药菌株可采用“梯度平板法”或“纸片扩散法”（4）产生抗菌素菌株的筛选采用“抑菌圈法”以摇瓶试验复筛和验证，指示菌（或叫工具菌）可

19、用畜禽致病菌。（5）产酶菌株的筛选淀粉酶、蛋白酶的产生能力可用“透明圈法”，淀粉、酪素作指示。（6）产酸能力采用“透明圈法”，用CaCO3做指示剂（7）产氨基酸或维生素的菌株可用“生长圈法”对于初步筛选的菌株要进行多次复筛，复筛后的菌株，还要经过如下程序方可投入生产使用：摇瓶或小型罐试验，检测其产物的生成量，做工艺上的研究。鉴定。主要是安全性。稳定性试验3.3菌种的管理用于益生素的生产皆要符合国家的有关规定。生产者要清楚菌种的来源、形态及生理生化特性。确定使用菌种一般应进行鉴定，鉴定内容主要包括形态、培养特性、生化反应观察、毒性试验、血清学检查、代谢产物等等。使用中的菌种应注意传代次数，对于传

20、代次数多的菌株最好重新鉴定。培菌人员在日常操作中，应密切注意菌株的变化（如菌落形状、大小、颜色、气味等），发现异常情况应对菌株重新鉴定，以避免变异菌株在生产中使用。培菌室的菌种应建立档案，以便于了解控制菌种的使用状况。菌种的保藏、使用、检测等环节都应有专门记录。3.4菌种的退化与保藏3.4.1菌种的退化菌种的退化通常是指微生物一定时间的接种、传代、培养或保藏后，它的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或丧失，可以表现为生长能力的减弱、代谢产物的下降或更改等。益生素生产用菌的退化，主要指菌种各项有益功能的降低，在生产过程中判断其退化主要检查：菌体繁殖能力、芽孢形成能力、代谢产物的变化（包括发酵液

21、的抑菌性能）等。例如，某个菌种原来在某特定培养基及培养条件下（控制参数、周期等），其发酵液含菌数为20108个/ml，芽孢率80%，菌种保藏一段时间后，在与过去相同的培养基及培养条件下，其发酵液含菌数降为10108个/ml，芽孢形成率降为50%，则我们可以说它已经退化。当我们改变培养基和培养条件，基发酵结果又达到原来的水平，我们也不能说它没退化，只能说它有另一个更好的培养工艺条件。微生物的变异是绝对的，使用和保藏中，菌种某些生理性状的变化是不可避免的，但退化一般来说是针对某一项或几项有益功能而言。有些微生物的遗传特征是稳定的，有些是易变异的，在生产实践中应注意观察如下现象：（1） 相同培养条件

22、下的所测发酵结果，如菌数、芽孢率、PH等。（2） 斜面或平皿上的单菌落形态，如菌落形状、颜色等。（3） 菌体细胞的镜检形态。（4） 发酵液、发酵产物的气味、颜色、某些醪液物理特征、泡沫等。即使上述某项发生了变化，我们并不能判断为其有益功能的退化。但当发生某项变化时，应注意对有益功能的测定，看其是否发生退化现象。3.4.2菌种退化的预防措施菌种退化的原因是有关基因的负突变。由于自发突变的频率是较低的，因此一般情况下菌种短期快速降低生产性能也是很不容易的，但就一个经常处于旺盛生长状态的细胞而言，发生突变的机率大大高于休眠状态的细胞。在一定条件下，群体多次繁殖，可使退化细胞数量易逐渐占优势，于是体现

23、出退化性状。因此连续接种、传代是菌种退化的一个原因；另外，培养条件、保藏条件、菌种本身的遗传背景等对菌种退化有较大影响。防止菌种退化可采取下列措施：（1）妥善的保藏方法将菌种保藏在低温、干燥、真空的环境中，可降低菌种的突变率。（2）减少传代次数生产菌种每移植一代，最好多接种一些斜面，以供一段时间生产所需，这样移植次数就可减少。（3）定期分离纯化菌种保藏一段时间后，进行单细胞分离筛选，保藏未退化菌落，这是防止退化的最有效措施。3.4.3菌种的保藏方法菌种保藏的目的：保持菌种的优良性状，防止菌种退化、死亡或污染杂菌。菌种保藏都是依据微生物的特点，人为创造一些条件。这些条件主要是：低温、干燥、缺氧等

24、。菌种保藏一般有如下方法：（1） 定期移植保藏法（传代培养保藏法）将菌种接于培养基上，置于最适条件下培养，待得到健壮菌体后，放4，湿度小于70%的条件下保藏。该法包括斜面培养、液体培养、穿刺培养等。益生素用的乳酸菌、芽孢菌、酵母菌，在日常生产中都可用此法。（2） 液体石蜡保藏法此法是用液体石蜡浇在斜面上以减少氧气供给，防止水份蒸发，抑制细胞代谢，达到延长保藏时间的目的。芽孢菌、酵母菌、乳酸菌可用此法。（3） 砂土保藏法和硅胶保藏法此法适用于对芽孢菌、霉菌孢子等进行保藏。（4） 冷冻真空干燥保藏法此法具有低温、真空、干燥三种保藏条件，具有变异少、保藏时间长、运输方便等优点。适用于大部分细菌、酵母

25、菌、霉菌、放线菌和病毒的保藏。但不适用于担子菌、嗜热菌、疫霉菌等少数微生物，此法保藏一般在5年以上。（5） 液氮超低温保藏法这种超低温保藏的原理是：生物在-130的低温下，代谢活动暂时停止而生命延续，并不发生变异。此法适合各种微生物。3.4.4生产菌种的制备益生素的生产用菌有许多种，而每一种菌种都有适合它生长及保持原有特征的最适培养条件。严格意义上说，生产上，任一菌种其培养条件应是不同的。本节不对某种菌的制备流程进行叙述，仅对菌种制备过程需注意的问题进行讨论。对于工业生产来说，生产用菌种的制备是非常重要的，菌种的质量直接影响发酵的结果，菌种的质量与培养过程及日常管理紧密相关。（1）种子的培养基

26、。生产者要对制种用培养基原料严格要求，对于商品蛋白胨、琼脂等由于生产厂家不同、加工工艺不同、所有原料的不同，因而在质量上、使用效果上可能会有较大的不同。生产者应根据研究或选定某种品牌的产品，在生产过程中不轻易改动，以免影响菌种的稳定性。配制培养基时，不能忽视对水质的要求。为避免水质的影响，有的用蒸馏水配制，并添加某些无机元素；有的用硬度和PH值来控制水质。为避免琼脂对培养基的影响，可用清水浸泡过夜处理，尽可能除去其中的可溶性杂质。有些菌种培养基质量对其生产性能影响是非常大的，请切记！（2）培养条件培养条件，不仅对菌种的生长数量有影响，更重要的是对菌株生产性能的影响。例如链霉菌生产斜面培养温度高

27、于37时，接入发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮提前回升，发酵活力下降现象。培养箱内的相对湿度对菌体生长速度和质量也有影响，相对湿度低时，斜面上水分易蒸发而干瘪，上部长不好；相对湿度高时，斜面底部有积水，斜面上部长得好，下部长不好。关于种子罐扩大（1）菌龄：是指适合于接种（接入发酵罐）的种子培养时间。一般以小时显示。常用菌龄都是以菌体处在生命活力极强的对数生长期的时间确定。菌龄取决于菌种的特性、接种量、培养基、培养条件。（2）种子罐培养基种子罐培养的目的是增殖菌体数量，工业上其培养基通常与发酵培养基不一致（因为发酵的目的可能是要代谢产物）。对于益生素而言，往往以活菌体为发酵目的物，所以菌种培养基可

28、能是与发酵培养基是一致的。对培养基的要求是，在保持菌种的优良性能前提下，满足快速繁殖的条件。所以其培养基往往是：合成菌体的营养成份充足、浓度适宜快速生长。（3）种子质量的判断：培养过程PH值的变化菌体形态在各阶段的变化发酵粘度、色泽等生长速度发酵目的物的生成量当然，仅仅靠上述判断不一定是科学的，但这些判断往往能从一个侧面反应出菌种代谢发生的变化。4.益生素的发酵生产益生素首先要获得优良的菌种，然后用适当的方法进行扩大培养和繁殖，且繁殖后的菌体和代谢产物应具有优良的微生态效应。这个过程有两点值得注意：（1） 要低成本的繁殖大量有微生态效应的的活菌，即繁殖的菌体必须具有原菌种所具有的微生态效应。（

29、2） 代谢产物不仅要无毒、无害，而且要具有有益功能。从微生物的代谢特点看，不同的培养基和工艺条件，其代谢产物会有明显的不同，这一点应该是肯定的。但不同培养条件可得的活菌体以及菌体的收集工艺是否会影响饲喂动物的微生态效应，我尚未见到任何研究报导。不同厂家其工艺流程、设备条件、培养方法各异，即使使用相同的菌种其产品可能会有不同的功效，这就要求生产者不能任意改动以证实有效的益生素的生产工艺，若改动，应重新对制剂进行鉴定（包括饲喂实验及安全生产）。4.1培养基培养基是指人工配制的适合微生物生长的营养物质，它对微生物的生长繁殖和代谢产物有直接影响。设计培养基组成时，应注意营养成份既要满足微生物的生长，又

30、要考虑有益代谢产物的分泌。不同类型的微生物所需的培养基成份并不完全相同，因而要通过实验选择有利于产物（菌体和代谢产物）的培养基。培养基的选择还应考虑组成简单、来源丰实、价格便宜，以及利于后工序处理等。虽然不同微生物对营养要求不完全相同，但所需的基本营养如碳源、氮源、无机盐、生长素、金属离子等则大体相同。4.1.1碳源碳素化合物是构成微生物细胞成份的主要物质，培养基的碳源是指能够向微生物提供组成细胞物质或代谢产物碳骨架的营养物质。碳源也是微生物的生命活动的能量来源，不同微生物要求的碳是不同的，这是由菌体自身酶量所决定的。可做为微生物碳源的物质很多，如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉及各种含淀粉的

31、农产品，如山芋粉、玉米粉、麸皮、米糠等。石油中的烷烃、甲烷和乙醇、乙酸等有机酸、有机醇也可成为某些微生物的碳源。在需氧代谢时，菌体可将底物中5055%的碳转化为细胞物质，而细胞干重中碳约占50%。因此，为了得到一定重量的菌体，可通过计算求出培养基中应提供的碳源。4.1.2氮源氮素是组成微生物细胞蛋白质和核酸的主要元素之一。通常提供氮素来源的营养物质称为氮源。氮源分为有机氮源和无机氮源。有机氮源包括各种蛋白质、蛋白胨、多肽、氨基酸，以及天然原料如鱼粉、酵母膏、豆饼粉、花生饼粉等的蛋白质物质；无机氮源包括含氮素的无机化合物，如硫铵、硝酸钾、氯化铵等。大多数微生物中氮约占细胞干重的10%，因而也可以

32、如同碳源计算所需氮源量。4.1.3无机盐无机盐提供多种金属离子和非金属离子，它们是微生物生长不可缺少的营养物质。各种无机盐在微生物中起着不同作用，有的是参与细胞组成，有的是参与酶的组成，有的是参与能量代谢，有的调节培养基PH和渗透压。一些重要的无机元素有：磷、硫、钾、镁、钙、钠、，微量元素有：铁、锰、锌、铜、钴等元素。这些元素是某些酶的基团成份。这些元素需量极微，一般无需另外加入。4.1.4生长因子微生物还需微量的维生素一类物质才能正常生长繁殖，这类物质统称为生长因素。其中包括某些氨基酸、维生素、嘌呤碱、嘧啶碱等，这些物质大都是辅酶或辅基的组份。一般以酵母膏、玉米粉、麦芽汁、豆芽汁等提供，其它

33、如玉米、豆粕、麸皮、米糠中也含有。4.1.5其它物质（1） 促芽孢形成物质，如锰盐、腐土等。（2） 乳酸菌分离培养用的刺激剂和抑制剂等，如吐温、叠氮化钠等。4.2固体发酵培养根据菌种特点，固体发酵需采用不同的方法，对于厌氧菌的培养，可采用堆积法、密闭发酵法等。对于需氧菌的培养可采用通风池、曲箱、固体发酵罐等方法。益生素的厌氧菌主要是乳酸菌，需氧菌主要是芽孢杆菌和酵母菌。4.2.1厌氧固体发酵简易的方法是堆积法，其基本过程为：培养基灭菌后扬冷降温至适宜温度，接入菌种拌和均匀，迅速堆积于池内或地面上，压紧压实，任其自然发酵，若发酵物料温度过高，可通过翻拌扬冷的方法降温，但应快速重新堆积，以造成缺氧

34、条件利于厌氧菌的生长和代谢。为了创造厌氧和还原性培养条件，也可接种少量好氧有益菌进行培养前期夺氧，或在培养基组分中加入还原性物质。密闭发酵法是将接种后的培养基置于密闭的池子或容器内发酵培养，与堆积法基本相同。4.2.2好氧固体发酵培养（1）曲池法将灭菌后的培养基接种装入底部有筛孔的曲池中，通入调湿空气进行培养，曲池中培养基厚度依菌种特点和培养基成份而确定。当菌体呼吸产热使培养基温度升高时，可间歇通风散热，当培养基水份变化时，可通过空调装置控制。曲池装置如图41所示：曲池空气预过滤器发酵物料花板空调室调节阀空气过滤器鼓风机图41此系统中，空调室内装有水喷雾装置和加热装置，调节阀用于控制通风量的大

35、小，空气预过滤器用于除去较大尘埃粒子，空气过滤器起除菌作用。（2）曲箱法曲箱有多种型式，具体操作也不一致。有的将接种后培养基置曲箱内发酵，通过曲箱内的搅拌及箱外的空气调节等装置控制发酵，也有的在箱内灭菌，接种、控制发酵，不一一赘述。（3） 固体发酵罐培养法固体发酵罐目前有二种：卧式罐、竖式罐。卧式罐有二种形式：转筒式和内搅拌式。一般内搅拌式对设备精度和材料强度要求较高，大容积罐制造有困难，常见用于科研的多为小罐。转筒式能制成较大容积，但大规模生产鲜有使用，其缺点是：物料水份不易控制无法在位检测PH、水份等参数传热效果不佳等。固体发酵罐可使发酵过程的配料、灭菌、冷却、接种、培养等程序一体化。自动

36、化程度较上述方法高。转筒固体发酵罐基本结构如图42所示：图42各部位名称：1排气口2接种口3进料、出料4排气龙头5测温口6取样口7进气管8进蒸汽口9进水口10支架11进气阀12进水阀13挡板14排污口15止转法兰16取样阀固体发酵罐的操作过程：将干物料拌均加入发酵罐内，开启转筒，大量加水，使物料均匀润湿。排尽蒸汽的冷凝水，通蒸汽入罐内灭菌。开夹层冷却水和冷灭菌空气对物料进行降温。加入菌种液。控制罐压、通风量、温度等进行培养。培养结束后放料。清洗并空消。（4）简易池法如研究中心一楼（略）固体发酵有投资少、操作简单等优点，但其有劳动强度大、发酵参数难控制、易染菌等缺点，对乳酸菌和芽孢杆菌的生产，一

37、般不宜采用。4.3液体深层发酵液体深层发酵是最广泛使用的发酵方法，其根据发酵的连续性可分为分机发酵和连续发酵。液体深层发酵有多种设备形式。应用最广泛的是通风搅拌式发酵罐，如图43所示： 主视图俯视图液体深层发酵的操作过程是：将培养基原料加水调浆（或在罐内调浆），投入发酵罐，经蒸汽灭菌，保压冷却到预定温度，接入培养好的种子，可根据菌种生长要求，通入空气或N2、CO2等。发酵温度通过夹套用冷却水或蒸汽调节，发酵过程中温度、PH、溶氧等都可以控制，所以发酵可取得较好的结果。发酵的培养及过程控制，取决于发酵目的。对益生素生产而言，发酵目的有二种可能：培养大量的活的菌体（或芽孢）。培养需要的代谢产物（如

38、抗菌肽、营养物）。而上述两个目的往往在一次发酵中不能兼得（也可能兼得），这需要从实际出发确定一个最佳工艺。当然也可能是这批发酵是以活菌数为目的，而另一批发酵是以代谢产物为目的。然后通过后工序的处理复配使得产品具有双重功效。4.3.1液体深层发酵设备液体发酵设备有多种多样，某种微生物适于哪类发酵罐，完全取决于菌种特性于心不忍酵目的。益生素生产用菌主要有需氧芽杆菌、乳酸菌、酵母菌，其中芽孢菌、酵母菌在增殖过程都是需氧的，而乳酸功利厌氧和兼性厌氧的，所以它们对设备的要求是不同的。以下仅介绍几种适于上述三类微生物培养的发酵设备。4.3.1.1机械搅拌通风发酵罐该发酵罐是生物工程应用最广泛的发酵设备，约

39、占发酵罐总数的7080%，故常称之为通用发酵罐。其据有较好的混合、溶氧、传热传质性能。其也可用于厌氧菌发酵。1.发酵罐的结构该主、类设备主要部件有罐体、搅拌器、挡板、轴封、空气分布器、传动系统装置、冷却管（或夹套）、消泡装置、人孔、视镜等。其示意图如图下面就其主要部分说明如下：（1）罐体罐体由椭圆封头和圆柱体焊接而成，材料可用碳中不锈钢，罐体一般能承受130和0.25Mpa的压力。在罐体上部一装有人孔、视镜、进料管、补料管、排气管、接种管、压力表（一般装于排气管上），罐身上装有冷却水进出管、取样管、温度及PH和溶氧接口。原则上说罐体上管路、接口越少越好，可避免死角。（2）搅拌和挡板其作用是混合

40、、传质传热。使通入空气分散成气泡与发酵液混合，增大气液接触面积进提高溶氧速率。使细胞均匀分散于发酵液中，增强气液固三相的混合与传质。加强传热过程。搅拌器的设计要使发酵足够的径向和适度的轴向运动。搅拌器通常采用平叶、弯叶、剪式圆盘蜗轮，叶片为6个，叶直径与罐径之比0.30.5。挡板的作用是：防止液面形成漩涡。增强液何不湍流状态。挡板通常设置46块，宽度为罐径的0.10.12倍。对于大型罐，罐内竖式列管或蛇管也可起到挡板的作用。（3）轴封轴封的作用是密封转动轴与罐体，避免泄漏。现绝大多酵罐采用双端机械密封。动环与静环材料要具有良好的耐磨性和导热性，动环硬度要大于静环。动环一般由碳化钨钢制成，静环用

41、石墨或聚四氟乙烯制成。（4）空气分布器空气分布器有环形这式和单管式，环式管内易滞留培养基，而造成染菌，但环形管空气分布效果好一些，分布管内空气流速一般取20m/s。（5）消泡装置简单实用的消泡装置为耗式消泡浆，其它还有涡轮消泡器、旋风离心消泡器、叶轮离心消泡器、碟片式消泡器、刮板式消泡器等。（6）发酵罐的热传递装置换热夹套：小型罐往往采用该装置，优点是结构简单、加工方便、但换热系数低，一般用于5立方米以下的小罐。竖式蛇管：优点是有管内冷却水流速大，传热系数高。竖式列管：优点是有利于提高传热推动力的温度，加工方便，但用水量大。2.发酵罐的通风与溶氧溶氧效果是判断发酵罐性能的重要因素，对于通风与溶

42、氧，将在“溶氧”一节专门讨论。3.发酵罐的比例尺寸（略）4.3.1.2气升式发酵罐气升式发酵罐也是广泛使用的生物反应设备，这类反应的特点是：结构简单、不易染菌、溶氧效率高、能耗低等优点。但其适应范围不如通用发酵罐。益生素的生产用菌（酵母、芽孢杆菌、乳酸菌）可以采用该设备。气升式反应器有多种类型，常见的有气升环流式、鼓泡式、空气喷射式等。其作用原理是把灭空气通过喷嘴喷射酵液中，通过气液混合物的湍流作用使空气泡分割细碎，同时由于形成的气混合物密度的降低而向上运用，而气含率低的发酵早下沉，形成循环流动，实现混合与溶氧。已在发酵工业中大量使用的气升内环流发酵罐、气液双喷气升环流发酵罐，设有多层分布塔式

43、气升发酵罐的结构分别如图：气生环流式 多层空气分布板式 气液双喷射气生环流式 气升环式反应器的特点：（1）反应溶液分布均匀（2）较高的溶氧速度和溶氧效率。气升式反应器有较同的含气率和比气液接触介面，因高传质速率和溶氧效率，体积溶氧效率通常比机械搅拌罐高，Ka可达2000h-1，且溶氧功耗相对低。（3）剪切力小，对生物细胞损伤小。由于其没有叶轮，故对细胞的剪切损伤可降至最低。（4）传热良好气升式反应器液体综合循环速率高，同时做一日和尚撞一天钟于在外循环管路上加装换热器，以保证发酵液换热。（5）结构简单、易于加工制造。（6）操作和维修方便。因其无搅拌系统，故结构较简单，能耗低，操作方便，特别是不产

44、生轴封渗漏染菌问题。4.3.2发酵过程的控制发酵过程的控制对发酵成果致关重要。除培养基外，发酵过程参数有：温度、PH、通气、搅拌、消泡、溶氧等。4.3.2.1发酵过程PH的变化与控制发酵过程的PH对微生物的生长繁殖的代谢产物积累有很大影响。不同的微生物对PH要求不同，大多数细菌的最适PH为6.57.6，霉菌和酵母菌的最适PH为36，放线菌为78，当然也有特殊情况，这取决于微生物自身的特性。微生物在没的发酵阶段其最适PH不同，在不同PH培养基中，代谢产物不同。PH值能影响微生物的生理机能，调节培养基PH范围，在不防碍生产菌的生长和代谢下可抑制微生物的生长，从而易于控制其它微生物的污染。PH对微生物生长繁殖和代谢产物的积累的影响，主要由以下原因造成：（1）PH值影响酶的活性。当PH值抑制或激活菌体某些酶的活性时，菌体的代谢途径发生改变。（2）PH值影响菌体细胞膜带电荷的状况。菌体可带电