TSPOTTB技术用于辅助诊断结核临床病例报道.docx

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1、编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第5页 共5页T SPOT TB技术用于辅助诊断结核临床病例报道莫凌，孟成艳，张舒，金嘉琳，张文宏作者单位：200040 上海，复旦大学附属华山医院感染科通讯作者：张文宏，Email：zhangwenhong退修稿：0074基金项目：国家重点基础研究发展计划（2005CB523102）近年来，我国结核病的发病率有上升趋势，临床上经常会遇到一些症状不典型的结核病和肺外结核病，而目前可用于诊断结核病的方法有限，同时又缺乏快速敏感的实验室技术，为结核病的早期诊断与治疗带来困难。ELISPOT（enzyme-linked immunos

2、pot assay, 酶联免疫斑点法）技术是一种新型的免疫酶技术，它是从单细胞水平检测分泌抗体细胞或分泌细胞因子细胞1。由ELISPOT发展来的T SPOT TB（结核感染T细胞斑点试验）技术就是通过检测结核感染后T淋巴细胞分泌的特异性的细胞因子IFN-来诊断是否存在结核感染。1ELISPOT技术原理该方法源于Mahairas等在1996年发现的一段存在结核分枝杆菌中名为“RD1”的基因序列2，而在卡介苗菌株和大部分环境中的分枝杆菌基因中则缺乏RD1序列。RD1编码产生两种蛋白：ESAT-6和CFP-10（culture filtrate protein），ESAT-6和CFP-10作为特异性

3、抗原刺激机体T淋巴细胞产生特异性的细胞因子IFN-。 根据这一原理，T SPOT技术利用结核杆菌感染者外周血单核细胞中存在结核特异的活化T淋巴细胞，这些淋巴细胞在受到结核杆菌特异抗原刺激后分泌干扰素而设计的T细胞免疫斑点试验。外周血单核细胞，结核特异的混合抗原A和混合抗原B（分别为ESAT-6和CFP-10的部分多肽片断），对照试剂一起加入预先包被抗干扰素抗体的微孔培养板进行培养。当外周血单核细胞中存在针对结核杆菌的效应T淋巴细胞时，培养液中加入的结核杆菌特异混合抗原多肽A和B将刺激这些效应T淋巴细胞分泌干扰素。分泌的干扰素被微孔板上的抗体捕获，再次加入的碱性磷酸酶标记并针对干扰素不同表位的抗

4、体与被捕获的干扰素结合，滞留在微孔板表面。显色底物溶液在反应部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑点。每一个斑点代表一个干扰素分泌细胞（结核特异的效应T细胞）。通过对斑点进行计数可以推测体内是否存在对结核杆菌反应的效应T细胞，从而对结核杆菌感染进行辅助诊断。2ELISPOT操作方法采集8ml患者的血液加入含柠檬酸钠的CPT采血管，分离外周血单个核细胞（PBMC），加入细胞培养液，轻轻重悬细胞。在已包被抗IFN-抗体的微量板的4个孔中，分别加入细胞培养液作为阴性对照，植物血凝素PHA作为阳性对照，结核分枝杆菌特异混合多肽A和B，分别含ESAT-6与CFP-10（Oxford Immunote Ltd.

5、, Oxford, UK）。然后在每个孔中加入含250000个细胞的上述悬液。把微量板放在37培养16-20小时后，用PBS液洗板4次，加入碱性磷酸酶标记的小鼠抗人IFN-单抗，在2-8下孵育1小时。孵育后再用PBS液洗板4次。最后每孔加入显色底物液BCIP/NBTPLUS，室温中静置7分钟后观察结果，并用计算机辅助成像分析系统进行斑点阅读与统计（ELISPOT试剂盒由上海复星科技有限公司提供）。第一孔为阴性对照孔，第二孔为阳性对照孔，如出现斑点，说明试验成功。第三，四孔为实验孔，当测试孔A或B达到以下标准则判定为阳性结果：（1） 如果阴性对照孔斑点数为0-5个，测试孔斑点数减去阴性对照孔斑点

6、数6。（2） 如果阴性对照孔斑点数6个，测试孔斑点数必须2倍的阴性对照孔斑点数。3ELISPOT的临床应用我院传染科首次将T SPOT TB技术用于临床，辅助诊断疑似结核患者，为结核病的诊断提供了一项新的技术，并取得一定成效。现将一例经T SPOT TB 技术鉴别诊断后得到有效治疗反应的病例报道如下。31病例报道患者，男，62岁。入院前3月无诱因下出现颈部疼痛,一月前出现左上肢麻木,进行性乏力，伴发热，体温在38度左右，无畏寒，寒战，无咳嗽，咳痰，无消瘦，盗汗等。入院查体，精神较萎，左侧颈部可扪及肿大淋巴结，质软，无压痛。心肺无特殊，腹软，肝脾肋下未及。颈软，克氏征（-），布氏征（-），余病理

7、征均阴性。左上肢肌力3级，肌张力可，余肢体肌力，肌张力正常。辅助检查，血常规：白细胞9.42109/L,中性粒细胞72%。脑脊液：白细胞 2106/L，总蛋白 983mg/L,葡萄糖3.9mmol/L,氯化物 120mmol/L。脑脊液抗酸染色，细菌涂片培养，真菌涂片培养均阴性。颈椎MRI：多发椎体异常信号伴硬膜增厚（图1）。头颅MRI示：双侧额叶、侧脑室旁多发斑点状异常信号（图2）。高度怀疑颈部与颅内异常信号为转移性肿瘤可能大，但骨髓穿刺，腹部B超，腹部CT，颈部淋巴结活检均未发现异常。PPD（-）。图1：A图为该患者治疗前颈椎MRI：在颈2-4椎体之间有异常信号，并有硬脊膜增厚。B图为治疗

8、后同一部位的MRI：可见原先的异常信号降低，硬脊膜增厚略有减轻。图2：该患者头颅MRI。可见侧脑室旁有圆形异常信号。32结 果用T SPOT TB检测该患者血液标本，结果阳性（图3）。于是对该患者行诊断性抗痨治疗，方案为四联（异烟肼，利福平，吡嗪酰胺，乙胺丁醇），同时加用甲强龙30mg。治疗3天后，患者体温平，治疗一周后，患者颈部疼痛好转，左上肢肌力逐渐恢复，两周后，患者左上肢肌力基本恢复正常。复查颈部MRI示：原先异常信号减弱，硬脊膜增厚减轻（图1-B）。患者出院时仍维持四联抗痨治疗，激素减为强的松20mg ，嘱患者随访。从该病人的治疗反应诊断该患者为结核性脑脊髓膜炎和椎体结核。图3：该病例

9、的ELISPOT结果。其中第一行为阴性对照孔，第二行为阳性对照孔，第三，四行为实验孔。图中可见第3孔中出现大量斑点，为阳性结果。每个斑点代表一个分泌INF- 的T细胞。用计算机辅助成像技术进行斑点计数得到4个孔的斑点数分别为2，832，401，0。33讨 论该患者是肺外结核感染，缺乏典型的结核中毒症状，如消瘦，盗汗等，影像学检查发现颈椎，头颅有异常信号，从形态学上倾向于转移性肿瘤，但对常见肿瘤的筛查未发现原发肿瘤的迹象，脑脊液检查只有蛋白较高，细胞数无明显升高。常见的结核检查，如PPD试验，脑脊液抗酸染色，涂片均为阴性，淋巴结活检也未发现结核感染病灶。在这种情况下，我们用ELISPOT技术对其

10、血液进行检测，结果提示阳性。当然，ELISPOT不是诊断结核的金标准，所以我们不能就此确诊为结核。于是对病人行诊断性抗痨治疗，从抗痨治疗的反应来看，患者症状明显好转，由此判断治疗有效，证实该患者为结核感染诊断成立。目前，临床诊断结核的方法有限。结核菌素试验（TST）是临床常用筛查结核的免疫学方法，虽然操作简单，观察结果方便，但由于其有较高的假阳性和假阴性，对临床结核病的诊断意义不大。细菌学是诊断结核的金标准，但培养需要两个月的时间，而且阳性率取决于采集标本中细菌的数量，不利于早期诊断与治疗。影像学作为辅助诊断方法，对活动性肺结核诊断有一定价值，但对肺外结核诊断存在困难。ELISOPT法作为一种

11、新的酶免疫检测方法在国外（主要是英国与美国）新近刚开始用于结核杆菌感染的检测，它不仅灵敏度高，特异性强3，而且操作简单，需时少，一般两天就能看到结果。在国内也已经进入试验性的诊断阶段，但尚缺乏大规模的临床实验及评价。Susan等在一项前瞻性、双盲队列研究中得到ELISPOT的敏感性为83%，显著高于皮试的敏感性63%，同时，非结核病人不会产生假阳性。在小于3岁，合并HIV感染及营养不良的儿童中，皮试的敏感性显著下降，而ELISPOT的敏感性没有显著性改变4。另有研究得到ELISPOT在普通人群中的敏感性为96%，在健康人群中的特异性为100%，在HIV阳性患者中的特异性为92%5。目前该技术已

12、在国外广泛用于活动性结核病和结核潜伏感染者的诊断，HIV合并结核感染的检测，用于区别结核感染者与BCG接种以及耐药结核菌感染的快速检测。4总结综上所述，ELISPOT作为一种新的检测结核感染的酶免疫学方法,其敏感性与特异性显著高于传统的TST,而且所需时间少，有利于结核病的早期诊断与治疗意义重大，对隐性结核感染也有诊断价值。但由于价格昂贵,不如TST操作简便易行,限制了该方法在临床的推广与应用。我院首次将该方法试验性的用于辅助临床诊断，并取得一定成效，在临床症状不典型，PPD诊断不明确，涂片及培养均为阴性的疑似结核病患者中，辅以ELISPOT方法，可以帮助确诊结核感染。参考文献1侯世芳，许贤豪

13、，刘广志等，酶联免疫斑点（ELISPOT）技术的应用. 中国神经免疫学和神经病学杂志，2002;10（9）:200-202.2 Lalbani A. Spotting latent infection: the path to better tuberculosis control.Thorax 2003;58:916-9183 Philip C, Roger H, Annette F, et al. Large-scale evaluation of enzyme-linked immunospot assay and skin test for diagnosis of Mycobacte

14、rium tuberculosis infectection against a gradient of exposure in the Gambia.Clin Infect Dis.2004;38:966-973.4Liebeschuetz S, Bamber S, Ewer K, et al. Diagnosis of tuberculosis in South African children with a T-cell-based assay: a prospective cohort study. Lancet. 2004;364(9452):2196-2203.5Chapman AL, Munkanta M, Wilkinson KA, et al. Rapid detection of active and latent tuberculosis infection in HIV-positive individuals by enumeration of Mycobaterium tuberculosis-specific T cells.AIDS. 2002,16:2285-2293.第 5 页 共 5 页