乌司他丁对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤caspase-3表达的影响-缺血性再灌注损伤机制.docx

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1、乌司他丁对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤caspase-3表达的影响:缺血性再灌注损伤机制 摘要：目的视察乌司他丁对脑缺血再灌注损伤的爱护作用，探讨其作用机制。方法健康雄性Wistar大鼠24只，随机分为4组，假手术组、生理盐水比照组、乌司他丁10 000 U/kg治疗组，乌司他丁50 000 U/kg治疗组。采纳线栓法制备大脑中动脉缺血再灌注模型，缺血1 h，再灌注24 h。HE染色视察大鼠脑组织的病理变更、免疫组织化学法检测脑组织caspase-3蛋白的表达、TUNEL法检测脑组织细胞凋亡数。结果乌司他丁可明显降低脑缺血再灌注中脑组织caspase-3蛋白的表达，削减脑细胞凋亡，与生理盐水比照

2、组相比差异有统计学意义（P1-3。本探讨采纳线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，视察乌司他丁对大鼠脑组织caspase-3表达及细胞凋亡的影响，探讨其脑爱护作用及可能的机制。 1材料与方法 1.1试验材料 1.1.1试验动物健康雄性Wistar大鼠（山西医科高校生理试验室供应）24只，体重200 g250 g。 1.1.2试剂与药物乌司他丁（广东天普生化医药股份有限公司，批号03091116），规格为每瓶100 000 U;caspase-3免疫组化试剂盒、TUNEL试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。 1.2试验方法 1.2.1分组及给药方法大鼠随机分为4组，每组6只。假手术组（A组）、

3、比照组（B组）、乌司他丁10 000 U/kg治疗组（C组）、乌司他丁50 000 U/kg治疗组（D组）。B组在制作模型后马上赐予生理盐水1 mL尾静脉注射；C组、D组制作模型后分别马上赐予乌司他丁10 000 U/kg、50 000 U/kg尾静脉注射，每次12 h，直至处死。 1.2.2模型制作用改良Longa 法建立大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注模型。大鼠造模前禁食12 h，不禁水，室温条件下称重，将大鼠用10%水合氯醛3 mL/ kg腹腔麻醉，颈正中旁开0.5 cm1 cm切口，钝性分别右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈外动脉、颈总动脉近心端，血管夹夹闭颈内动脉，在颈总动脉距离分

4、岔口大约5 cm处用眼科剪剪开一小口，将直径约0.23 mm0.26 mm的渔线插入，松开血管夹，以分岔口起先测量距离，插入1.8 cm2 cm后固定渔线，缝合。缺血1 h后将线栓拉出1 cm，形成再灌注。假手术组插入1.0 cm渔线，其余步骤同试验组。待动物醒悟评估神经功能后放回笼中，自由饮食。神经功能缺陷评分根据Longa的5级4分法标准。 1.2.3标本及病理切片制备B组、C组、D组在缺血1h再灌注24 h、A组在24 h后，赐予10%水合氯醛3 mL/kg麻醉，快速开胸暴露心脏，从左心室插管至主动脉根部，在右心耳剪开一小口作出口，用生理盐水200 mL经左心室到主动脉快速冲洗血液，后用

5、4%多聚甲醛200 mL快速灌注，断头取脑。取大鼠右侧脑组织4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水，石蜡包埋，从视交叉向后做冠状面连续切片，厚约5 m。 1.2.4HE染色切片常规脱蜡、梯度酒精脱水、苏木素及伊红染色，梯度酒精脱水、二甲苯透亮，中性树胶封片。显微镜下视察细胞形态。 1.2.5免疫组化测caspase-3蛋白表达切片常规脱蜡至水，3%H2O2浸泡10 min，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3 min3次，高压修复2 min，室温下自然冷却至常温，PBS缓冲液洗涤3 min3次，滴加5%BSA封闭液37 放置20 min，滴加一抗约100 L，4 过夜，PBS缓冲液洗涤3 min3次，滴加

6、二抗约100 L，37 30 min，PBS缓冲液洗涤3 min3次，滴加SABC试剂，37放置20 min，PBS洗涤3 min3次，滴加生物素过氧化物酶（DAB）显色，之后苏木素复染，脱水、透亮，中性树胶封片，显微镜下视察caspase-3显色状况，细胞核或浆棕染为阳性。每只大鼠选取5张切片，400倍光镜下随机选取5个不重复的视野，计数其中的阳性细胞，求均值。 1.2.6TUNEL法检测细胞凋亡切片常规脱蜡至水，严格根据试剂盒步骤操作，显微镜下视察细胞凋亡状况。胞核呈棕黄色颗粒为阳性细胞。每张切片在400倍下随机选取不重叠的5个视野，计数TUNEL阳性细胞数。 1.3统计学处理采纳SPSS

7、 13.0统计软件进行分析，计量资料以均数标准差(xs) 表示，采纳单因素方差分析进行统计，组间比较采纳Bonferroni法。 2结果 2.1HE染色结果A组神经元形态正常，胞体呈圆形，胞浆丰富，核仁清晰，无变形、水肿；B组脑组织结构疏松，有不同程度的神经细胞变性、坏死，胞体肿胀、变形，细胞四周间隙增宽，胞核深染、固缩。C组、D组神经细胞病理变更稍微，胞体轻度肿胀，偶有神经细胞变性、坏死。 2.2脑组织caspase-3蛋白表达状况Caspase-3阳性细胞呈棕黄色，显色部位为胞浆，A组caspase-3阳性细胞表达少，B组阳性细胞数较假手术组显著增加，C组、D组caspase-3阳性细胞数

8、较生理盐水比照组明显削减（P4。半胱天冬氨酸蛋白酶也称ICE样蛋白酶，是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶。它可干脆导致细胞凋亡，它的活化是细胞凋亡通路的中心环节5。其中caspase-3是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶，是caspase级联反应中的最终效应因子和最关键的凋亡执行蛋白酶，在各种因素启动的凋亡程序中起最终的枢纽作用6。caspase-3与细胞凋亡关系亲密。 乌司他丁可通过抑制NO和TNF-的释放，对肠组织缺血再灌注损伤产生爱护作用7。Jiang等8 发觉乌司他丁能抑制失血性休克大鼠回肠组织caspase-3蛋白的表达，抑制组织细胞凋亡，产生细胞爱护作用。通过抑制TNF-、纤溶酶等的活性对

9、活体肺缺血再灌注损伤产生爱护作用9。同时可稳定细胞膜，抑制蛋白质分解代谢亢进，抑制IL-6、IL-8的过度生成及ICAM-1的表达。通过抑制NOS活性，削减NO的生成，爱护血脑屏障，减轻脑水肿。 本试验中，建立大鼠脑缺血再灌注模型，结果显示生理盐水比照组caspase-3阳性细胞数及凋亡细胞数显著高于假手术组，是由于在生理盐水比照组中因缺血及再灌注损伤，线粒体受损，线粒体膜通透性变更，细胞色素C释放，激活半胱天冬氨酸蛋白酶，最终激活caspase-3，导致神经细胞凋亡。而在治疗组中，caspase-3及凋亡阳性表达细胞数较生理盐水比照组显著降低，可能与乌司他丁抑制caspase-3的激活有关，

10、减轻缺血再灌注损伤，产生脑爱护作用。 乌司他丁对脑缺血再灌注损伤具有爱护作用，它可削减神经细胞的凋亡，其机制可能与抑制caspase-3的表达有关。乌司他丁源于人体，无免疫原性，不良反应少，平安性高，临床上已广泛应用于胰腺炎、休克、全身炎症反应的治疗，且有较好的效果。 参考文献： 1薛继红，余唯琪.乌司他丁对缺氧缺血性新生鼠的脑爱护作用.中国新生儿科杂志，2007，22（1）：24-26. 2Koga Y,Fujita M,Tsuruta R,et al.Urinary trypsin inhibitor suppresses excessive superoxide anion radica

11、l generation in blood,oxidative stress,early inflammation,and endothelial injury in forebrain ischemia/reperfusion rats.JNeurol Res,2010,48(3):256-265. 3Yaw T,Anraku S,Nakayama R,et al.Neuroprotive effet of orinary trypoin inhibitor against facal cerebral ischemia-reperfusion in rats.Anestheiology,2

12、003,98(2):465-473. 4An S,Hishikawa Y,Koji T.Induction of cell death in rat small intestine by ischemia reperfusion:Differential roles of Fas/Fas ligand and Bcl-2/Bax systems depending upon cell types.Histochem Cell Biol，2005，123(3):249-261. 5Faubel S,Edelstein CL.Caspase as drug targets in ischemic

13、organ injury.Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol,2005,5(3):269-287. 6Yang Y,Zhang S,Fang Sy,et al.Induction of caspase-3 gene in neuronal apoptosis after transient focal cerebral ischemia.Chin Clin Neurosci,2004,12(1)：1-4. 7Liu ML,Zhang J,et al.Protective effect of urinary trypsin inhibitor on i

14、njury after intestinal ischemia-reperfusion:Experiment with rats.Chin Med J,2008,88(4):225-229. 8Jiang LY,Yang LH,Zhong W,et al.Effect of ulinastatin on apoptosis in ileal mucosa of rats with hemorrhagic shock.Chin Crit Care Med,2006,18(9):542-545. 9谷力加,黄邵洪,吴一龙，等.乌司他丁对兔在体肺缺血再灌注损伤的爱护作用.中华试验外科杂志，2002，19（6）：585-586. 作者简介：吴倩佳(1984)，女，现为山西医科高校2008级在读硕士探讨生（邮编：030001）；李光来（通讯作者），工作于山西医科高校其次医院（邮编：030001）。 (收稿日期：2010-12-06） (本文编辑王雅洁）