省卫生厅科研基金.docx

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1、省卫生厅科研基金省卫生厅科研基金课题申请书(合同书)上 册课题名称:毒 乙型肝炎病毒 PreS2 IL- -2 2 树突状细胞疫苗及效果探讨申请单位: 课题负责人 联系电话: 申请日期: 安排周期: 省卫生厅制 一、 数据库信息课题申请号 课题合同号课 题 名称 （25 字内）乙 乙 型 肝 炎 病 毒 PreS2-IL-2 树 突 状 细 胞 疫 疫 苗 及 效 果 研 究所属学科 病原生物学、免疫学课题性质课题类别申请单位课题负责人诞生年月 1965 年 9 月 民族 汉族 技术专长 分子病毒学学位职称 政治面貌2 1-基础探讨2-应用探讨3-试验发展4-软科学探讨 1 1-重点 2-一般

2、3-指导4-青年基金 1-男性 2-女性 邮政编码性别2 2 1-博士2-硕士 3-学士4-其它1 1-正高2-副高 3-中级4-初级 01 01-中共党员 02-中共预备党员03-共青团员 04-民革会员05-民盟盟员06-民建会员 07-民进会员 08-农工党党员09-致公党党员 10-九三学社社员 11-台盟盟员12-无党派民主子士 13-群众文化程度人员分类安排周期2 006年01 月 至 2007 年 年 12 月 月申请经费 5.000 万元 拨款类型1-A2-B3-C内容提要 : 用重组pcDNA3.1-HBV PreS2 IL-2 转染的鼠树突状细胞(Dendritic cee

3、l， ，DC) 免疫 C57BL/6 小鼠，2 周后分别用 CTL 反应、MLR 反应及 及 ELISA 法，讨 从细胞及体液免疫两方面探讨 HBVPreS2-IL-2 融合基因修饰的 DC 疫苗的免 用 疫效果。利用 HBV PreS2 IL-2 基因负载的 DC ，探讨该 DC 诱导的 CTL 对 达 表达 HbsAg 靶细胞的杀伤作用。为后续的 HBV DC 疫苗在临床治疗慢性乙肝 及肝硬化、肝细胞癌中的应用探讨奠定试验基础课题申请号 合同号 评审结果批准资助经费万元 偿还经费万元0 200-探讨生02-探讨生毕业09-探讨生肄业 10-高校本科11-高校毕业12-高校肄业 20-大专2

4、1-专科毕业29-专科肄业 30-中专 31-中专毕业32-中技毕业 40-技工学校 41 技校毕业49-技校肄业 50-中学 51-中学毕业59-职业中学毕业 60-初中 61-初中毕业69-职业初中毕业 70-小学 71-小学毕业79-小学肄业 8 1-中医人员2-西医人员 3-西学中人员 4-中药人员5-西药人员 6-医技人员 7-护理人员8-其他人员1-批准列入安排 2-批准列入安排，但科研方案需做修改 3-不批准列入安排二、课题申请单位、合作单位及分工 三、课题主要探讨人员状况（请从课题负责人起先依次填写）序号 姓名 性别 年龄 学位 职称 技术专长 单位 1女 女 40分子病毒学2

5、男 男 50医学微生物学 学3男 男 37医学微生物学 学4女 女 医学微生物学 学5男 男 医学微生物学 学6男 男 医学微生物学试验技术7女 女 医学微生物学 学8男 男 33医学微生物学 学9男 男 医学微生物学 学10女 女 医学微生物学试验 四、申请单位看法：对申请书的真实性及能否供应基本工作条件等签署看法 单位负责人（签字）： 申请单位（盖章）年 月日 五、主管部门审核看法：所在市、州卫生局或省直单位审核看法主管部门负责人（签名）：主管部门（盖章）年 月 日 （申请青年基金课题必填）六、专家举荐看法：（两名专家举荐看法）举荐专家（签名）： 年 月 日 举荐专家（签名）：年 月日 七

6、、专家评审看法：专家组负责人（签名）： 年月 日八、省卫生厅审批看法： 主管领导（签章）（公章）年月日 九、合同条款 订立合同单位：省卫生厅（甲方）课题担当单位（乙方）课题保证单位（丙方）为了保证医学科学探讨工作的顺当实施，依据中华人民共和国技术合同法及省医药卫生科学技术探讨项目管理方法的有关规定，商定如下共同条款：第一条 本合同一经签定，即具有法律效力。签约各方应履行本合同规定的义务，不得擅自变更或解除合同。任何一方提出变更合同原定内容、指标或解除合同，需与签定合同各方共同协商，就变更或解除达成书面协议后，方可执行。其次条甲方按合同下拨资助经费，检查课题安排执行状况，监督资助经费的运用。丙方

7、按合同督促乙方按安排实施，并保证乙方按规定运用资助经费，按合同规定偿还经费。第三条乙方按合同实施课题安排，并于每年十一月底前填报执行状况报告表一式二份，向甲、丙方汇报课题执行状况和经费运用状况。第四条确因客观缘由须要调整探讨安排或课题负责人者，乙方必需书面报请丙方审查并呈甲方批准后方可调整。第五条乙方在撰写本课题探讨报告、发表论文、申报嘉奖时，需注明湖南省卫生厅科研基金资助字样，重要文件抄报甲方、丙方，课题探讨成果的转让须经签约各方协商进行。第六条本课题属偿资助课题，其偿还经费万元，乙方必需按资助经费偿还安排按期偿还给甲方，逾期不还者，甲方有权追回全部资助经费，并拒绝受理乙方申报的其他课题和成

8、果，扣除或停拨乙方担当课题的资助经费 第七条本合同一式四份，甲方、丙方各一份，乙方二份。本合同自甲、乙、丙三方签字、盖章之日起生效。合同签署各方：省卫生厅（甲方） 部门科技主管：（签章） （公章）年 月 日 课题担当单位（乙方）单位科技主管：课题负责人：财务负责人：开户银行：（公章）帐号：年 月 日 保证单位（丙方）：（系指各附属医院及地市所属单位的主管部门）主管部门负责人（签章） （公章） 年 月日课题申报号课题合同号 金 省 卫 生 厅 科 研 基 金 课题申请书（合同书） 下册课题名称：乙型肝炎病毒 PreS2 IL- -2 2 树突状细胞疫苗及效果探讨申请日期：5 2005 年 年 3

9、 3 月 月 2 22 日 日 省卫生厅制 一题探讨的科学依据：包括国内探讨现状、水平、发展趋势、存在问题、本课题特色、创新之处及立题依据等。乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）属嗜肝 DNA 病毒，其传染源主要是乙肝患者及无症状 HBsAg 携带者，病毒可通过血液、血液制品及母婴间垂直传播而感染机体。HBV 进入血液后，通过表达 PreS1 及 PreS2 抗原而与宿主肝细胞相应受体表位结合并进入肝细胞，可引起无症状病毒携带者、急性肝炎、慢性肝炎、重症肝炎，并有可能演化成肝硬化、肝细胞癌，严峻威逼着人类的生命健康。据统计，全世界约有 3.5 亿人为慢性 HBV 感染者

10、1 ，其中大约 20-30死于 HBV 相关的肝衰竭和肝细胞癌；另一统计数据表明，全球每年约有 100 万人死于急性或慢性 HBV 感染所引起的相关疾病 2 。引起 HBV 慢性持续感染的详细机制仍不甚清晰。但探讨发觉，T 细胞介导的细胞免疫应答在机体的抗病毒与抗肿瘤免疫中起主导作用，其反应的强弱对病毒及肿瘤细胞的清除起确定性作用。HBV 清除机制是细胞毒性 T 淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte，CTL）通过杀伤感染的肝细胞和释放抗病毒性细胞因子（Cytokine，CK）来清除病毒。在 HBV 急性感染时，由于产生剧烈的 CTL反应而清除病毒。然而，慢性持续 HBV 感染

11、时，HBV 特异性 CTL 应答较弱或根本无应答，机体处于免疫耐受或免疫紊乱状态 3 ，其机理可能与树突状细胞（Dendritic cell，DC）功能低下或异样有关。很多探讨发觉，慢性 HBV 感染者体内 DC 表面多种刺激信号分子（如 CD40、CD80、CD86 等）及 MHC-I 、II 类分子表达低下和/或多种细胞因子（CK）生成削减，导致 DC 表型与功能缺陷或异样 4-7 ，因而不能产生有效的 CTL 反应 8 ，以至病毒在体内长期存在而引起慢性持续性感染。因此，要想清除患者体内的病毒，应从抗病毒和提高机体免疫应答两方面着手。目前对慢性 HBV 感染的治疗，主要应用抗 HBV 药

12、物及免疫调整剂来抑杀 HBV，但二者效果仍不志向；而传统的重组乙肝疫苗也只能预防HBV 的感染，对慢性 HBV 感染无治疗作用。因此，探讨一种既能预防又能清除HBV 的治疗性疫苗意义特别重大。DC 是目前已知的功能最强、也是惟一能激活初始型 T 细胞（Naïve T cell）的专职性抗原递呈细胞（Antigen presenting cell，APC），在抗原递呈及刺激效应T 细胞增殖方面具有重要作用 9 。近年来，国内外很多学者尝试用转基因技术，将肿瘤特异性抗原或抗原基因导入 DC 以构建肿瘤疫苗，这已成为近年抗肿瘤免疫治疗的热点之一 10,11 。探讨表明，转入 DC 后的肿瘤

13、抗原基因可在 DC 胞浆内翻译表达出肿瘤抗原，通过 MHC-I 类途径递呈给 T 淋巴细胞，诱导抗原特异性CTL 而杀灭癌细胞。同样地，在抗病毒治疗方面，基因疫苗可以同时诱导针对病原体的体液和细胞免疫反应 12 。有报导证明，用 HBV S 基因负载 DC，再与 T细胞混合培育后诱导出的特异性 CTL 对表达 HBsAg 靶细胞的杀伤效率高达85.1 13 ，这说明用病毒抗原基因负载的 DC 诱导的 CTL 对相应病毒具有高效杀灭作用。HBV 前 S2 基因（PreS2 基因）的编码产物为 HBV 衣壳蛋白的组成成分之一，即 PreS2 蛋白。探讨表明：PreS2 蛋白具有强的 T、B 细胞识

14、别确定簇和吸附于肝细胞膜受体的表位，其免疫原性比 HBsAg 更强，抗 PreS2 抗体能通过阻断 HBV 与肝细胞的结合而起抗病毒作用 14， 15 。细胞因子具有免疫调整活性，能不同程度地调整体液和细胞免疫应答，白介素 2（IL-2）是人自然的 T 细胞生长因子，具有较强的免疫佐剂作用，可促进 T 细胞增殖，增加 NK、CTL 细胞对靶细胞的杀伤作用。探讨表明，经 IL-2 基因修饰的 DC 能分泌高浓度的 IL-2，并能增加 DC 对引流淋巴结内 NK 和 CTL 细胞的活化作用 16 。另有报道，IL-2 可以增加由 HCV 的 DNA 疫苗诱发的细胞免疫反应，IL-2 基因与 Pre

15、S2 基因进行融合表达时，特异性的免疫反应至少可以增加 100 倍 17 。本项目拟通过构建 HBVPreS2-IL-2 融合基因真核表达载体，将其转染小鼠骨髓来源的 DC 后制成 DC 疫苗，将其免疫小鼠后，从细胞免疫及体液免疫两方面探讨 HBVPreS2-IL-2 修饰的 DC 疫苗的免疫效果。利用 HBVPreS2-IL-2基因负载的人 DC 诱导的 CTL 对表达 HBsAg 靶细胞的杀伤作用，为后续的 HBV DC疫苗在临床治疗慢性乙肝及肝硬化、肝细胞癌中的应用探讨奠定试验基础。参考文献Zuckerman A. More than one third of world’s

16、 population has been infected with hepatitis B virus. Br Med J,1999;318:1213Maddrey WC. Hepatitis B:An important public health issue . Med Virol, 2000;61:362Reherman B , Fowler P , Sidney J , et al . The cytotoxic T lymphocyte response to multiple hepatitis B virus polymerase epitopes during and aft

17、er acute virus hepatitis. J Exp Med, 1995;181(3):1047-1058于建武，王贵强，吕淑兰。慢性乙型肝炎患者外周血 DC 功能的探讨。中华传染病杂志，2001，19（3）：144147刑利和，王福生，刘明旭等。慢性乙型肝炎患者 DC 的培育鉴定和功能特点。中华传染病杂志，2001，19（6）：348351Arima S , Akbar SM , Michitaka K , et al . Impaired function of antigen-presenting dendritic cells in patients with chronic

18、 hepatitis B: localization of HBV DNA and RNA in blood DC by in situ hybridization . Intervirology, 2001; 44(4):199-208Akbar SM ,Horiike N , Onji M ,et al . Dedritic cells and chronic hepatitis virus carries . Carr Top Microbiol Immunol, 2003;276:103-123Akber SM , Abe M , Masumto T , et al . Mechani

19、sm of action of vaccine therapy in murine hepatitis B virus carriers:vaccine-induced activiation of antigen presenting dendritic cells . J Hepatol, 1999;30:755-764Lipscomb MF , Masten BJ. Dendritic cells: immune regulators in health and disease . Physiol Rev, 2002; 82:97Schnurr M , Galambos P , Scho

20、lz C , et al . Tumor cell lysate-pulsed human dedrtic cells induce a T-cell response against pancreatic carcinoma cells: an in vitro model for the assessment of tumor vaccines . Cancer Res, 2001;61(17):6445Kugler A , Stuhler G , Walden P , et al . Regression of human metastatic renal cell carcinoma after vaccination with tumor cell-dendritic cell hybrids . Nat Med, 2000;6(3):332McDomell WM , Askari FK . DNA vaccines . N Engl J Med, 1996;334:42-45李用国，罗云萍，兰英华等。树突状细胞 HbsAg 疫苗抗乙型肝炎病毒免疫的体外探讨。中华传染病杂志，2002；20（6）：333336周建勋，刑来田，韩金祥等。重组腺病毒载体乙肝疫苗的免疫学探讨。中国微生态学杂志，2004；16（6）：336337周正.