[人脐带间充质干细胞与蚕丝蛋白支架构建组织工程脂肪的研究] 脐带干细胞.docx

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1、人脐带间充质干细胞与蚕丝蛋白支架构建组织工程脂肪的研究 脐带干细胞 摘要目的：将体外以人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）与蚕丝蛋白支架初步构建的组织工程脂肪移植到大鼠体内，视察其演化过程。 方法：hUCMSCs与蚕丝蛋白支架复合培育10天后，进行成脂诱导；6周后将其移植到Wistar大鼠后肢肌肉内，同时，以同体积支架材料作为比照；分别于移植后4周和8周取材，行油红O染色、HE染色以及扫描电镜视察。结果：hUCMSCs与蚕丝蛋白支架复合培育及成脂诱导6周后，见大量成脂样细胞生成，并与支架坚固粘附。移植4周，移植物体积略小，质稍硬，表面有透亮薄膜形成，膜中分布新生血管网；油红O染色见支架内新生脂

2、肪组织及细胞呈橙红色；HE染色显示支架网眼内有新生脂肪组织，并可见少量炎性细胞浸润；扫描电镜见支架网眼内有球形、表面光滑的脂肪细胞。移植8周，移植物体积进一步缩小，质变软，表面薄膜内血管网丰富；油红O染色见支架中着橙红色组织较前明显增多，部分呈片状融合；HE染色显示新生脂肪明显增多，仍有少量炎性细胞浸润；扫描电镜显示脂肪细胞较前增生明显。比照组同样可见炎性细胞浸润，未见新生脂肪组织生成，支架材料8周时较4周时降解更加明显。结论：随着时间推移，蚕丝蛋白支架网眼内脂肪细胞渐渐增多，支架材料在体内呈现逐步降解趋势，说明体内环境有利于组织工程化脂肪的进一步形成。同时，也提示支架材料在组织相容性方面尚存

3、不足。 关键词人脐带间充质干细胞；蚕丝蛋白；支架材料；脂肪组织；组织工程学 中图分类号R318 文献标识码A 文章编号1008-6455（2011）05-0774-03 Study on reconstruction of tissue engineering adipose with human umbilical cord mesenchymal stem cells and silk fibroin scaffolds LIU Yi, XIAO Hong-tao （PLA Center of Burns and Plastic Surgery, Lanzhou General Hospi

4、tal of Lanzhou Command, Lanzhou 730050, Gansu, China） Abstract:ObjectiveTo transplant the tissue engineering adipose reconstructed with human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSCs)and silk fibroin scaffolds in vitro into Wistar rats, and dynamically observe their changing.MethodshUCMSCs and

5、 silk fibroin scaffolds were compoundly cultured ten days, theninduced them into adipose and continuely cultured. Six weeks later, those compound materials were transplanted into muscles in hind legs of Wistar rats, at the same time, the pure scaffolds in same volume were transplanted as control. Th

6、e samples were harvested at 4 and 8 weeks respectively. Oil Red-O stain, H.E. stain and scanning electron microscope were employed to observe their changes.ResultsA lot of adipose-like cells appearred and firmly adhered to scaffolds six weeks later after hUCMSCs and silk fibroin scaffolds were compo

7、undly cultured and induced into adipose. Four weeks later after transplantation, the volume of transplant became slightly smaller and the quality of it was a little hard. There was a layer of hyaline membrane on the surface of transplant, and neoformative vascular net appearred in it. In oil red-O s

8、tain, neogenetic adipose tissue and cells in scaffolds showed orange colour. There was neogenetic adipose tissue in scaffolds in H.E. stain, at the same time, a few inflammatory cells infiltration were observed. Under scanning electronmicroscope, globular adipose cell with smooth surface appearred i

9、n scaffolds. Eight weeks later, the volume of transplant became furtherly smaller and the quality of it became soft. A abundant vascular net appearred in surface membrane on the transplant. Orange colour tissue in scaffolds obviously increased, and part of them showed patchy fusion in oil red-O stai

10、n. There were more neogenetic adipose tissue appearred in scaffolds in H.E. stain, and a inflammatory cell infiltration was still observed. Obvious proliferative adipose cells were showed in scaffolds under scanning electron microscope.In control group, there was still a inflammatory cell infiltrati

11、on, and not any neogenetic adipose tissue was observed. Compared with 4 weeks, the scaffold materials degraded much more obviously than in 8 weeks.ConclusionWith the lapse of time, the adipose cells in silk fibroin scaffolds gradully increase,the scaffold materials show progressively degradation ten

12、densy. It suggests it might be beneficial to furtherly form tissue engineering adipose in vivo,but it still shows shortcoming in histocompatibility of scaffold materials. Key words: human umbilical cord mesenchymal stem cells; silk fibroin; scaffolds;adipose; tissue engineering 我们的前期工作已就蚕丝蛋白多孔支架作为人脐

13、带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）体外培育的自然支架的可行性，以及相宜于hUCMSCs体外培育的蚕丝蛋白多孔支架的最佳孔径进行了探讨，并获得了确定的结果1-2。本探讨皆在通过在体外将hUC MSCs与蚕丝蛋白多孔支架进行复合培育，并在成脂诱导条件下初步构建出组织工程脂肪的基础上，进行体内移植，视察其演化过程。 1材料和方法 1.1 主要材料与仪器：Wistar大鼠，体重20010g，雌雄不限（购自甘肃省中医学院试验动物中心）；蚕丝蛋白多孔支架（孔径5060m，浙江高校丝绸中心闵思佳教授惠赠）。 LG-DMEM

14、培育基(美国Gibco公司)，胎牛血清(FBS，北京鼎国生物技术责任有限公司)，二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶、地塞米松、吲哚美辛、胰岛素、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤（IBMX）（美国Sigma公司)，荧光素四乙酸甲酯（cellstain -calcein-AM）（日本DoJINDO公司）,倒置显微镜(日本Olympus公司)，扫描电镜(日本电子光学公司)，CO2孵箱(美国Shellab产品)。 1.2 hUCMSCs的体外分别、培育和鉴定：脐带取自兰州军区兰州总医院产科剖宫产健康足月儿，均经产妇本人及其家属授权同意，无菌采集后46h内处理。按本试验室方法进行hUCMSCs的分别、培育和鉴

15、定2。 1.3 蚕丝蛋白多孔支架制备：将蚕丝蛋白多孔支架材料制备成1.5cm（长轴）0.8cm（短轴）0.2cm（厚度）大小椭圆形。75%酒精浸泡30min，风干、紫外线照耀30min备用。 1.4 hUCMSCs与蚕丝蛋白多孔支架复合培育：将浓度为1.0106细胞/ml第2代hUCMSCs悬液, 滴在备好的蚕丝蛋白多孔支架上，分别放入24孔培育板中，在37气浴恒温振荡器中振荡4h，使细胞充分匀称吸附在支架上后补足含10%FBS的LG-DMEM培育液，使hUCMSCs-支架复合物完全浸没，每3天换液1次，培育10天。 1.5 体外构建组织工程脂肪：hUCMSCs与支架复合培育第10天时，加入成

16、脂诱导液（含10% FBS、10-6mol/ L地塞米松、0.5mmol/L IBMX、60mol/L吲哚美辛、5mg/L胰岛素的LG-DMEM培育基），每34天全量换成脂诱导液1次，复合培育4周、6周后行油红O染色，倒置显微镜下视察蚕丝蛋白多孔支架中hUCMSCs成脂状况。 1.6 体外构建的组织工程脂肪体内移植与视察：将体外经过成脂诱导6周的hUCMSCs与蚕丝蛋白多孔支架复合物（初步构建的组织工程脂肪）移植到Wistar大鼠后肢肌肉内，同时，移植同体积支架材料作为空白比照（图1）。移植后4周和8周（各10只）取出移植物，冰冻切片，行油红O染色、HE染色以及扫描电镜视察。 2结果 2.1

17、体外构建的组织工程脂肪中hUCMSCs的成脂状况：hUCMSCs与蚕丝蛋白多孔支架复合培育、并成脂诱导4周后，油红O染色显示，蚕丝蛋白多孔支架网眼内已可见成脂样细胞生成（图2），6周后见大量成脂样细胞生成，并与蚕丝蛋白多孔支架坚固粘附（图3）。 2.2 体外构建的组织工程脂肪体内移植后的大体视察：移植4周后可见试验组移植物较植入前体积略小，色微黄，质稍硬，表面有透亮薄膜形成，膜中分布有新生血管网；移植8周，移植物较移植4周时体积进一步缩小，色微黄，质变软，表面包袱一层薄膜，该膜内可见丰富的血管网（图4）。 2.3 体外构建的组织工程脂肪体内移植后的组织学视察：移植4周后油红O染色，可见试验组移

18、植物支架材料中新生脂肪组织及细胞呈橙红色，HE染色显示支架网眼内有新生脂肪组织，并可见少量炎性细胞浸润及渗出性浆液（图5）；移植8周，油红O染色见支架材料中着橙红色组织较前明显增多，部分呈片状融合，HE染色显示新生脂肪明显增多，仍有少量炎性细胞浸润（图6）。 2.4 体外构建的组织工程脂肪体内移植后的扫描电镜视察：移植4周时扫描电镜可见支架材料网眼内有球形、表面光滑的脂肪细胞（图7），8周后支架材料网眼内脂肪细胞较前增生明显（图8）。比照组同样可见炎性细胞浸润，伴有少量渗出性浆液，未见新生脂肪组织生成（图9），支架材料8周时较4周时降解更加明显（图10、11）。 3探讨 做为组织工程探讨志向的

19、种子细胞，应具备简单获得、简单体外培育增殖、长期传代不变更生物学特征、抗原性小、组织修复实力强等特性。hUCMSCs来源于分娩后废弃的脐带，来源广泛，取材便利，易于收集、保存、冷冻，不存在伦理、道德和法律方面的争辩与限制；它相对纯净，与干细胞输注相关的病毒与病原微生物感染率远低于骨髓移植；hUCMSCs形态呈现成纤维细胞样，在体外培育 体系中能快速增殖，传代后35天，能增殖45倍，传代10代以上细胞可增殖510倍，且增殖速度无明显降低，传代稳定。OCT-4是胚胎干细胞特异性基因，对维持干细胞未分化状态具有重要意义，RT-PCR检测结果显示，hUCMSCs阳性表达OCT-4mRNA3-4；hUC

20、MSCs具有跨胚层向多组织细胞分化的潜能和自我更新的高增殖实力，在不同诱导条件下，能够向脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、心肌细胞等分化；hUCMSCs不表达或低表达移植排斥相关标记，免疫原性低，属免役缺陷细胞5。有鉴于此，说明hUCMSCs是一种志向的用于组织工程探讨的种子细胞。 以hUCMSCs为种子细胞构建组织工程脂肪的基础是找寻一种具有良好生物相容性和可降解性的三维支架材料，因此选择相宜于hUCMSCs立体培育的支架是脂肪组织工程的基本条件之一。探讨表明，蚕丝蛋白主要由3/4丝素和1/4丝胶两种蛋白组成，具有良好的机械强度和松软性，丝素具有良好的生物相容性及生物降解性，其来源丰富，价格便宜6

21、-7。所以，本探讨选择蚕丝蛋白做为hUCMSCs的自然支架材料，将其制备成孔径5060m的支架1，在体外将hUCMSCs接种于支架材料上, 通过荧光倒置相差显微镜和扫描电镜视察细胞伸展、黏附和生长过程。结果显示, hUCMSCs生长状态良好, 在常规培育条件下，可以正常生长增殖、迁移并分泌细胞外基质，表明蚕丝蛋白支架有利蚕丝蛋白的正常生长2。 前期试验探讨的基础上，采纳将hUCMSCs与蚕丝蛋白支架材料复合培育10天的方法，可使hUCMSCs在支架材料上进一步扩增，成脂诱导6周后，在体外可初步构建出组织工程脂肪样组织。进一步将这种体外构建出的组织进行体内移植，视察其演化过程。结果表明：随着时间

22、的推移，蚕丝蛋白多孔支架网眼内脂肪细胞渐渐增多，而且，蚕丝蛋白多孔支架在体内呈现逐步降解趋势，说明体内环境有利于组织工程化脂肪的进一步形成，该材料具有良好的可汲取性。但是，组织学视察显示，移植大鼠体内4周与8周后均可见到少量炎性细胞浸润，提示该支架材料在组织相容性方面尚存在不足。这可能与制备过程中添加交联剂的种类和剂量有关，下一步我们将对蚕丝蛋白支架进行必要的改良，以弥补前述缺陷，争取早日构建出令人满足的、相宜于临床应用的组织工程脂肪。 参考文献 1刘毅,肖洪涛, 薛美思.相宜于构建组织工程化脂肪的蚕丝蛋白支架:最佳孔径筛选J.中国组织工程探讨与临床康复,2010,14(8):1361-136

23、4. 2刘毅, 肖洪涛.人脐带间充质干细胞与蚕丝素多孔支架的体外复合培育J.中华医学美学美容杂志, 2010,16(1):45-48. 3薛美思, 刘毅. 脐带间充质干细胞在细胞治疗中的探讨进展J. 中国美容医学,2008,17(9):1405-1407. 4肖洪涛, 牛希华, 刘毅. 人脐带间充质干细胞的体外分别、培育及诱导分化J.郑州高校学报(医学版),2010,45(2):213-216. 5刘毅,薛美思.携带人胰岛素基因慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞的试验探讨J. 中国修复重建外科杂志, 2010, 24(7):822-827. 6Li M, Ogiso M, Minoura N. Enzymatic degradation behavior of porous silk fibroin sheets.Biomaterials,2003,24(2):357-365. 7Altman GH, Diaz F, Jakuba C, et al. Silk-based biomaterials. Biomaterials, 2003,24(3):401-416. 收稿日期2011-01-26 修回日期2011-03-24 编辑/张惠娟 注：“本文中所涉及到的图表、公式、注解等请以PDF格式阅读”