[针刺对实验性快速性心律失常大鼠延髓Ｇｉ－ｍＲＮＡ表达的影响] 心律失常射频消融术.docx

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1、针刺对实验性快速性心律失常大鼠延髓表达的影响 心律失常射频消融术 摘要：目的：探讨针刺内关穴调整快速性心律失常的效应机理。方法：电针乌头碱所致的快速性心律失常模型大鼠双侧“内关”穴，视察针刺前后心律(率)改变；用半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法测定延髓中抑制性G蛋白(Gi)mRNA的相对含量。结果：针刺治疗组与模型组相比有显著改变(P0.05)。结论：快速性心律失常可能和延髓中G蛋白基因表达障碍有关；G蛋白在针刺内关穴对心律失常的调整中有重要作用。 关键词：针刺；内关；心律失常；延髓；抑制性C蛋白；RTPCR 中图分类号：R33文献标识码：A文章编号：16737717(2007)09

2、182803 心律失常是临床常见病证，发病机制困难。临床和试验资料表明针刺“内关”穴对其疗效准确。G蛋白是生物信息转导过程关键的中介体，可以耦联多种受体和效应器，引起一系列细胞“瀑布”效应。笔者在以往试验中发觉，针刺“内关”穴对快速性及缓慢性心律失常大鼠心肌组织中c蛋白基因表达均有调整作用。本试验通过对针刺“内关”穴调整心血管神经中枢一延髓的Gi(Gi2、Gi3)mRNA表达的视察，探讨快速性心律失常可能和延髓中G蛋白基因表达障碍有关，为临床针灸治疗心律失常供应理论依据。 1 材料与方法 11试验动物与分组健康成年Wistar大鼠40只，由沈阳药科高校试验动物中心供应(级，批号：0001315

3、)，体重(20050)g。在本校试验动物中心饲养1周，以适应环境。 随机分为4组，每组10只。即正常组(A)；乌头碱造模组(B)(乌头碱造模不针刺)；乌头碱“内关”穴组(C)(乌头碱造模加针刺“内关”穴)；乌头碱“非经非穴”组(D)(乌头碱造模加针刺“非经非穴”)。 12试剂与仪器乌头碱(批号：110720200410，购于中国药品生物制品检定所)。组织总RNA试剂盒、RTPCR试剂盒、Gi2mRNA和Gi3mRNA引物、甘油醛3磷酸脱氢酶(GAPDH)引物(均由大连宝生物工程有限公司合成供应)；蛋白核酸分析仪(DU600)；PCR仪(PE9600)；电泳仪(EPS300)；凝胶成像分析系统(

4、GIS120D)；电针仪(6805A)等。 13动物模型的制备20氨基甲酸乙酯(5mL/kg)腹腔注射麻醉，于舌下静脉注射0.002的乌头碱(1mL/kg)。以心电图出现室性早搏二联律、室性心动过速等心律失常波形为造模胜利标记。 14电针方法及取材依据试验针灸学大鼠针灸穴位取“内关”穴，非经非穴点取大鼠肩三角肌隆起处。用0.5寸毫针(中0.25mm)直刺23mm，加电针(疏密波，频率220Hz，强度23mA；或以大鼠前肢微颤为宜)，行针10min，记录心电图，然后马上从腹主动脉抽血35mL(削减体循环血量，防止脑组织中血液过多影响试验结果)，快速开颅，依据试验动物解剖图谱取出延髓，置于0冰盐水

5、中，剪取含延髓腹外侧区(VLM)(参考猫VLM范围：从延髓外侧网状核尾端向头端延长至上橄榄核水平；其背侧分界在尾端为延髓中心腹侧亚核的腹面，头端为巨细胞核、小细胞核及三叉脊束核头部的腹面，腹侧缘为延髓的腹侧表面；内、外侧分界分别为中缝核群的外侧和脊髓小脑束的内侧)在内的50mg标本放入经DEPC(焦碳酸二乙酯)水处理过的EP管中，70冷冻备用。取材时间均在尚未复原正常心律时。 15心率测定方法大鼠麻醉后，仰卧固定于自制鼠台上，用MS2000多媒体化生物信号记录分析系统，按人体标准导联的方法连接，将针状电极插入四肢末端及剑突皮下，分别记录A组、B组给药后和C、D两组针刺后心电图，取连续10个心电

6、周期计算平均值做为试验大鼠的心率。 16逆转录聚合酶链反应组织总RNA提取：取组织标本，按试剂盒说明书用Trizol提取总RNA，用蛋白核酸分析仪分析其纯度OD260/280，各样本均在1.92.0之间。逆转录：取lugRNA按逆转录试剂盒说明书进行逆转录合成eDNA，经30次循环后将产物保存在70冰箱中备用。PCR扩增反应：PCR反应体系：逆转录产物20L，上下游引物各1L，MgSO 46L，5Buffer 16L，TaqDNA聚合酶0.5L，dH2O 55.5L，总反应体系100L。根据以下步骤进行扩增：9430s，5630s，721min，循环35次，最终72延长5min。选择GAPDH

7、(528bp)作为内参加上述反应体系相同。产物分析：取12.5LPCR产物在1.2琼脂糖凝胶电泳1h，EB染色，紫外透射仪视察，应用凝胶图象处理系统扫描摄像各条带的光密度，以GAPDH产物的光密度值作为内参，计算不同条件下Gi2(Gi3)mRNA/GAPDH扩增量的比值进行半定量分析。此比值为Gi2mRNA、Gi3mRNA的相对表达量。 17统计学方法试验数据用均值标准差(以xs)表示，用SPSS10.0软件进行统计学分析，采纳单因素方差分析F检验。 2 结果 21Gi2Gi3的序列测定结果所测得的Gi2Gi3PCR产物核苷酸序列与文献报道完全一样。 22对快速性心律失常模型大鼠的视察经舌下静

8、脉注射乌头碱后数秒至4min内出现室性早搏、室性心动过速等快速性心律失常波形，持续时间90min左右。与文献报道一样。 23针刺对快速性心律失常大鼠心率(律)及延髓GimRNA表达的影响结果。心率改变：B组心率比A组明显加快，有显著差异(P0.05)，C组比B组减慢，有显著差异(P0.05)，而D组与B组相比元显著差异(P0.05)。心律改变：经舌下静脉注射乌头碱，出现快速性心律失常波形后，赐予电针针刺双侧“内关”穴，10min后转律，基本复原为正常窦性心律。电针非经非穴10min后心律无明显改变。GimRNA表达的改变：B组与A组比，延髓Gi2、Gi3mRNA表达明显下降(P0.05)；C组

9、(针刺“内关”穴后)Gi2、Gi3mRNA表达上升，与B组比差异显著(P0.05)，而D组与B组相比元显著差异(P0.05)。 注：与A组比较，P0.05；#与B组比较，P0.05；#与D组 比较，P0.05；D组与B组比较，P0.05。 3讨论 G蛋白是连接多种细胞膜受体与选择性效应器之间信号转导的重要的膜蛋白，其表达水平及活性的改变相应地调整细胞生理、生化及其相关基因的表达。其中Gi含量改变可以通过腺苷酸环化酶(AC)引起环磷酸腺苷(cAMP)的变更。cAMP是细胞内重要的其次信使，参加调整细胞的生理生化过程，产生一系列生理效应。 延髓是心血管活动的基本调整中枢，其中延髓腹外侧区(VLM)

10、对心血管功能起着重要的调控和整合作用。G蛋白在脑干中有表达，李炜等在脑干中检测出Gs、Gi。孙国杰等试验视察到急性心肌缺血家兔延髓脑组织中cAMP、cGMP含量和cAMP/eGMP值均异样显著上升，而针刺双侧“内关”穴可使之降低并趋于正常。据此推断G蛋白可能参加了延髓对心血管功能的调整。 Gi蛋白分为Gi1、Gi2和Gi3种亚型，本试验只视察了后两者，结果显示，乌头碱造模(快速性心律失常)组大鼠延髓Gi2、Gi3mRNA表达与正常组比明显下降，提示快速性心律失常可能和延髓G蛋白基因表达障碍有关。 心律失常表现为心跳过快、过慢或不规则的心跳，乏力、胸闷气短等症状。属于祖国医学心悸、怔忡等范畴。灵

11、枢邪客：“诸邪之在于心者，皆在于心之包络，包络者，心主之脉也”；灵枢经脉：“心主手厥阴心包络之脉，起于胸中，出属心包络，是主脉所生病者，烦心、伤心”；类经注解记载“凡治病者，但治包络之输即所以治心也”；又有“心包络是心之外围，代心受邪”之言。表明心包经与心关系亲密，因而治疗心脏病取手厥阴经穴，疗效显著。在选穴上，针灸甲乙经载：“心澹澹而善惊恐，心悲，内关主之”。内关穴是手厥阴心包经之络穴，又是八脉交会穴，通阴维脉；心包经和手少阳三焦经相表里，故针刺内关可以通三焦，调诸脏，心居上焦，亦受其调整，所以针刺内关穴对心律失常有调整作用。 本次试验在验证“内关”穴疗效的同时，又进一步表明针刺“内关”可使快速性心律失常大鼠延髓组织内降低的Gi2、Gi3mRNA的表达上升，使心律及心率趋于正常，提示针刺内关穴对快速性心律失常的调整作用可能是通过G蛋白的信号转导通路实现的。但因G蛋白亚型繁多，本试验只从GimRNA表达水平进行探讨，还有待于对其它亚型及其在蛋白水平做进一步视察分析。