造血干细胞研究以及应用PPT课件.ppt

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1、关于造血干细胞的研究及应用第一张，PPT共三十五页，创作于2022年6月一：造血干/祖细胞的研究 1.造血活动与造血假设 2.造血干细胞与造血祖细胞 3.造血干/祖细胞的性能测试 4.造血干/祖细胞的分离纯化 5.造血祖细胞的体外扩增与定向诱导分化二.造血干祖细胞的应用与前景内容第二张，PPT共三十五页，创作于2022年6月造血活动n血细胞的生成血细胞的生成 在胎儿，血细胞的生成开始于卵黄囊（02月），之后，在肝脏和脾脏（27月），骨髓（59月）为造血的主要场所。出生后，骨髓成为终身造血的大本营。第三张，PPT共三十五页，创作于2022年6月n血细胞类型与寿命血细胞类型与寿命 类型类型 1.淋

2、巴系细胞：B淋巴细胞,T淋巴细胞 2.髓系细胞:单核/巨噬细胞，粒细胞，巨核细胞，红细胞 3.血小板 寿命寿命 人类红细胞120d,中性粒细胞36 h,血小板9.6d第四张，PPT共三十五页，创作于2022年6月造血假设 以上事实都支持了这样的假设以上事实都支持了这样的假设：在造血细胞中存在着一类原始的造血干细胞，它们能自我更新，并向各系细胞分化，从而维持机体正常的造血功能，使人体有恒定的血细胞数量。第五张，PPT共三十五页，创作于2022年6月一 造血干细胞（HSC）n概念的提出：1.20世纪50年代，Lorentz等的骨髓移植实验成功，表明在造血细胞中存在一类原始的造血细胞即造血干细胞。第

3、六张，PPT共三十五页，创作于2022年6月n 2.1961年，Till和McCulloch发现将正常小鼠的骨髓细胞输注给受致死剂量X线照射小鼠，经911天后，受者小鼠脾脏表面生成了肉眼可见的由骨髓红系细胞，粒系细胞，巨核系细胞或三者混合组成的脾集落，又称脾结节。每一个脾集落称为一个脾集落生成单位（CFU-S)。第七张，PPT共三十五页，创作于2022年6月 应用染色体C带显色和单个脾集落移植技术证明，每个脾集落中的细胞都是起源于单一细胞，通过它的增殖和分化而形成集落。这类生成脾集落的原始细胞称为脾集落生成细胞，它具备了多能造血干细胞或淋巴系-髓系干细胞的基本特性。脾集落生成细胞是一类最早被认

4、识的造血干细胞，也是目前惟一能被测试的一类造血干细胞。然而，各个脾集落生成细胞的功能又是不均一的。第八张，PPT共三十五页，创作于2022年6月 造血干细胞（HSC）与造血祖细胞（HPC）HSC 主要区别：高度的自我更新和维持能力 不能扩增 在体内长期或永久地重建造血，永不消亡 HPC高度扩增能力部分早期HPC和全部的晚期HPC丧失自我更新和自我维持能力分化到终末必然调亡关系：HSC HSC 所有特征不变HPC 边增殖边分化来维持成熟血细胞的数量第九张，PPT共三十五页，创作于2022年6月造血干/祖细胞的性能测试 造血干细胞性能测试 1.经典方法-脾集落测试法 2.HSC的自我更新和造血重建

5、能力的测试 3.HSC的无限增殖和多向分化能力的测试 造血祖细胞性能测试 第十张，PPT共三十五页，创作于2022年6月nTill和McCulloch于1961年建立的脾集落技术到目前为止只能应用于小鼠等啮齿类动物，诸如兔，犬和人等均不能用这一方法检测。只能通过测定造血祖细胞的数量来相对说明造血干细胞的数量，至于性能则更难说明。n 一般利用一些具有细胞遗传标志的HSC来生成脾集落，根据脾集落遗传标志的情况来研究造血干细胞的性能，主要有两种细胞遗传标志：1.辐射诱发的畸变染色体：可能对细胞的正常增殖与分化有影响，因此很难评估造血干细胞的性能。2.吴祖泽等利用天然性染色体作为细胞遗传标志1.经典方

6、法-脾集落测试法第十一张，PPT共三十五页，创作于2022年6月2.HSC的自我更新和造血重建能力的测试n早期，根据存在于骨髓，脾脏及肝脏等造血组织和器官中，以及的形态类似于淋巴细胞等特点，通过分离单个核细胞，以此群体细胞的特性研究来推测的性能。n人类移植技术的成功，无疑是对人类HSC具有自我更新能力和长期造血重建能力的最有力证明。n随着现代化技术手段的迅猛发展，实验动物学的发展为HSC的研究提供了很好的模型，为性能研究提供了更为直接的证据。第十二张，PPT共三十五页，创作于2022年6月动物体内实验验证n1.HSC 羊胎内移植n2.重症联合免疫缺陷症(SCID)或人免疫缺陷（HID）小鼠体内

7、移植n3.SCID-Hu Thymus 动物模型体内移植n4.SCID-Hu Bone动物模型体内移植 第十三张，PPT共三十五页，创作于2022年6月n4.SCID-Hu Bone动物模型体内移植（1）先将一小段人胎肱骨埋于 SCID小鼠皮下，约8周后移植物的血管已基本长好。（2）小鼠经射线全身照射后，把HLA不相符合的人类HSC待测样品立即注射到移植物的骨髓腔内。（3）再过8周，取出移植物，一部分样品用作检测骨髓腔内细胞中的人类HSC和HPC，另一部分样品再一次注入第二个受射线照射的带有人肱骨移植物的SCID-HU Bone 动物模型体内。（4）再过8周，检测第2次移植物内是否有人类HSC

8、，早期HPC，髓系祖细胞，B细胞祖细胞及其前体细胞，便可证明注入第1个胎骨移植物的原始样品是否含有高度自我更新能力的人类造血干细胞。第十四张，PPT共三十五页，创作于2022年6月3.HSC的无限增殖和多向分化能力的测试n 早期研究还是以脾集落入手。1984年，吴祖泽等以天然性染色体作为标志物，研究了小鼠骨髓中HSC的增殖与分化特性。具体过程如下：（1）取与受体小鼠性别相反的正常小鼠骨髓的有核细胞输入到经致死剂量射线照射的受者小鼠，第13天后，受者小鼠生成脾集落。（2）之后将取自一个脾集落的细胞输入到经致死剂量射线照射的，与第一受者小鼠性别相同的第二受者小鼠体内，经过78周后，测试第二受者小鼠

9、脾，淋巴结的T 细胞，B细胞,骨髓中的细胞及脾集落的雄，雌核型分布，并将其骨髓细胞输注到经致死剂量照射的，与第一，二受者小鼠性别相同的第三受者 （3）经8周后再测试第三只受者小鼠脾，淋巴结的T细胞，B细胞，骨髓中的细胞及脾集落的雌，雄核型分析。第十五张，PPT共三十五页，创作于2022年6月 结果表明：1.通过最初一个脾集落生成细胞在第一受者小鼠脾脏内生成的一个脾集落，在第二，三受者小鼠中不断增殖，脾集落生成细胞在数量上以指数形式不断增加。每一个脾集落都是单一细胞增殖和分化的结果。2.脾集落生成细胞不仅在经射线照射的受者小鼠内具有重建髓细胞的能力，同时，也具有重建淋巴组织中T细胞，B细胞的能力

10、。第十六张，PPT共三十五页，创作于2022年6月随着各种实验技术手段的不断发展随着各种实验技术手段的不断发展 裴雪涛裴雪涛等利用FACS自动细胞分选系统分选出单个CD34+细胞亚群细胞CD34+CD38+及CD34+CD38-，在96孔板无血清体系中加入各种细胞因子（如SCF,IL,GM-CSF,G-CSF及EPO）刺激，进行培养。结果表明:CD34+CD38-单个细胞可形成原代集落，并可向红系，粒系，巨噬系，巨核系等细胞分化。并证明了它的性能接近于造血干细胞，同时也证明了HSC具有多向分化的能力。第十七张，PPT共三十五页，创作于2022年6月造血祖细胞性能测试n起始于1965年Pluzn

11、ik和Sachs建立的小鼠骨髓细胞体外琼脂培养技术。即在CSF 的作用下，造血细胞可在琼脂上形成集落，每一个集落称为一个集落生成单位。（CFU）.n 造血细胞在体外培养时，在不同刺激因子的作用下，可形成人们可以辨认的各系细胞。生成各系集落的细胞被称为各系的祖细胞，或各系的集落生成细胞（CFC）,如粒系-巨噬系祖细胞或称粒细胞-巨噬细胞集落生成细胞（CFC-GM）。第十八张，PPT共三十五页，创作于2022年6月培养体系如下：有核细胞+培养液 3.9ml 马血清 2.5ml GM-CSF 0.8ml(2U)5%琼脂 0.4ml第十九张，PPT共三十五页，创作于2022年6月n人们可以根据各系祖细

12、胞的体外培养，对其性能加以研究。近年来HSC/HPC表面标志（即CD抗原）研究的发展大大促进他们的分离，纯化，鉴定及性能等研究。CD34抗原表达一直持续到晚期HPC。用CD33,CD38,HLA-DR及系特异性单克隆抗体（Lin）可进一步精选HSC和HPC。第二十张，PPT共三十五页，创作于2022年6月n近年来，对造血干细胞的深入研究表明，HSC除了具有自我更新和多向分化的基本特性外，还具有以下特点:1.绝大多数干细胞处于Go期 2.高度表达CD34和CDw90抗原 3.缺乏 CD33，CD71等系相关抗原 4.具有 HLA,CD45RA高相对分子质量形式 5.低表达或不表达HLA-DR 6

13、.罗丹明123 低吸收率Rh123可选择性的结合在各种活细胞的线粒体上，增殖的细胞都含有更多更大更活跃的线粒体，故可吸收RH123，显示明亮的荧光第二十一张，PPT共三十五页，创作于2022年6月n目前认为，高增殖潜能集落生成细胞（HPP-CFC）和长期培养启动细胞（LTC-IC）为早期的造血祖细胞。HPP-CFC的性能：研究表明：可以在体外形成较大的集落，自我更新能力比 CFU-Mix 更强，细胞多处于静止状态，很少进入增殖周期，对细胞周期S期毒剂有耐受性。在较晚时期形成集落的细胞则为更为早期的细胞。有如下特性：1.具有体内外抗细胞毒药物5-Fu的作用 2.可重建受致死剂量射线照射小鼠的骨髓

14、造血 3.具有向巨噬系，红系，粒系以及巨核系等多向分化的潜能 4.应答各种细胞因子第二十二张，PPT共三十五页，创作于2022年6月n长期培养启动细胞（LTC-IC)是指在长期培养体系中培养5周后所测得的集落细胞，到目前为止，长期培养体系是模仿人体内造血微环境的最佳体外模式。LTC-IC在有基质细胞层的培养中可以维持造血达几个月。n最近又发现了较LTC-IC更为原始的造血祖细胞群延长长期培养启动细胞（ELTC-IC），增殖期出现晚，生成更多的子细胞。第二十三张，PPT共三十五页，创作于2022年6月4.造血干/祖细胞的分离纯化方法:造血干/祖细胞在增殖，分化过程中表面抗原的变化是其分离纯化的标

15、志，而高亲和力单克隆抗体的制备和相关分离纯化技术的完善是其基础。其中，CD34抗原是HSC/HPC分离纯化的主要标志。第二十四张，PPT共三十五页，创作于2022年6月CD34细胞及其亚群的分离纯化与性能n细胞表面 CD34抗原是高度糖基化型膜蛋白，主要存在于幼稚造血干/祖细胞，部分骨髓基质细胞和少量的内皮细胞表面，其表达的水平与细胞的分化密切相关。n目前用于CD34细胞纯化的方法主要有：1.荧光激活细胞分选（FACS）2.免疫吸附分离 （1）单克隆抗体铺展贴壁 （2）生物素-抗生物素免疫亲和层析吸附 （3）免疫磁珠细胞分选 3.利用细胞物理学特性分离 （1）密度梯度离心 （2）淘洗离心第二十

16、五张，PPT共三十五页，创作于2022年6月一：CD34+细胞的阴性富集n定义：利用各种方法去除成熟的血细胞和免疫活性细胞，从而达到HSC/HPC 的富集。n方法：1.使用不同密度梯度的Ficoll，Percoll淋巴细胞分离液富集单个核细胞（MNC），会得到明显的富集。2.淘洗离心技术 3.利用花生凝集素和大豆凝集素富集。由于这几种富集方法均属非特异性分离，分选细胞的纯度和产率均较低。故目前极少用于CD34+细胞的富集。第二十六张，PPT共三十五页，创作于2022年6月CD34+细胞的阳性富集n定义：直接利用 HSC/HPC在增殖，分化过程中表面抗原的变化，通过其特异性单克隆抗体将其分离纯化

17、出来，从而达到的富集，即为阳性富集。n方法：1.FACS分选可获得高纯度的CD34+细胞，并可对其他方法分选的靶细胞进行纯度检测和25个参数同时标志的亚群细胞进行分选。但该仪器价格昂贵，分选速率较慢，因此主要用于CD34+细胞亚群（如CD34+CD38-,CD34+HLA-DR-等）的分选。2.广泛应用于CD34+细胞纯化的方法是抗CD34单克隆抗体介导的免疫吸附，这类方法具有分离速度快，纯度高，分离细胞量大以及经济和操作简便等优点。第二十七张，PPT共三十五页，创作于2022年6月例如：利用FACS对不同来源的造血细胞进行CD34和CD38双标志参数分析和分选。得到CD34+CD38+和CD

18、34+CD38-两个亚群在骨髓，脐带血和外周血MNC中所占的比例明显不同。结果表明：CD34+CD38+细胞大多处于造血祖细胞阶段，可形成大量的各系造血细胞集落，但不能维持长期造血；而CD34+CD38-细胞则更幼稚或更接近于造血干细胞。第二十八张，PPT共三十五页，创作于2022年6月造血祖细胞体外扩增与定向诱导分化n造血祖细胞体外扩增 不同的造血因子组合，SCF加IL-1,IL-3,IL-6,EPO 等可刺激造血细胞扩增。但是，这些细胞因子的组合在扩增造血细胞的同时也明显地加速了造血干/祖细胞的分化，到21天时绝大部分细胞已分化成为较成熟的血细胞。因此，如何在扩增造血细胞的同时，又尽可能地

19、保留造血干细胞，并扩增早期造血祖细胞，使其在数量上和功能上满足临床治疗的需要，这就成为体外扩增研究的重点。第二十九张，PPT共三十五页，创作于2022年6月n今年来，经过各国学者的不断努力，这方面的研究已取得了明显的进展。1.造血生长因子的合理组合。早期造血细胞的细胞因子（SCF，IL-3，GM-SCF）抑制细胞凋亡的存活因子（SCF，IL-1，IL-6）晚期系特异性细胞因子（G-CSF，EPO，TPO）2.CD34+CD38-亚群造血祖细胞的扩增 3.造血负调控因子的应用 例如：利用TGF-，TNF-，白血病抑制因子阻止细胞分化的作用。4.基质细胞支持的体外扩增 5.持续灌注培养体系第三十张

20、，PPT共三十五页，创作于2022年6月造血祖细胞定向诱导分化n利用造血干/祖细胞具有多向分化的潜能，通过细胞因子的不同组合，定向地诱导其分化，产生大量所需的功能细胞（如红细胞，粒细胞，血小板，树突状细胞），以满足基础研究及临床应用的需要，这在新一代的细胞免疫治疗中将具有十分重要的意义。例如：粒系细胞的定向诱导分化 利用SCF加IL-3，G-CSF，GM-CSF或TPO的组合诱导CD34+细胞向粒系细胞分化。第三十一张，PPT共三十五页，创作于2022年6月造血祖细胞体外扩增及定向诱导分化的应用前景n1.造血祖细胞的体外扩增 （1）外周血干细胞移植时减少动员次数和分离时间。（2）自体造血干细胞

21、移植时的肿瘤进化。（3）脐带血造血干细胞移植 （4）造血干细胞作为靶细胞的基因治疗 （5）异基因骨髓移植 第三十二张，PPT共三十五页，创作于2022年6月2.功能细胞的定向诱导分化 （1）肿瘤化疗与放疗所致的中性粒细胞和血小板减少 （2）造血干细胞移植相关的血小板减少症 （3）免疫治疗时NK细胞及淋巴细胞的体外扩增与激活 （4）树突状细胞的生成，扩增与激活，肿瘤抗原的呈递及其在肿瘤特异性生物免疫治疗中的应用。(5)造血基质细胞等的诱导生成及其在其他领域的应用。第三十三张，PPT共三十五页，创作于2022年6月造血干细胞的应用与前景n造血干细胞移植研究（白血病，再障，免疫缺陷病）n基因治疗研究（SCID）n造血细胞的可塑性（向肝脏细胞，骨骼肌细胞，心肌细胞，血管内皮细胞，神经细胞等多种功能的细胞）第三十四张，PPT共三十五页，创作于2022年6月感感谢谢大大家家观观看看第三十五张，PPT共三十五页，创作于2022年6月