第三部分微生物生长精选文档.ppt
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1、第三部分微生物生长本讲稿第一页,共四十一页第一节第一节 微生物纯培养分离及生长测定方法微生物纯培养分离及生长测定方法本讲稿第二页,共四十一页一、一、获得纯培养的方法获得纯培养的方法纯培养纯培养(pure culture)(pure culture)微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代殖而得到的后代,称纯培养称纯培养.(1 1)液体稀释法液体稀释法(2 2)平板划线分离法(平板划线分离法(Streak Plate)(3 3)平板涂布分离法(平板涂布分离法(Spread Plate)(4 4)选择性培养分离法选择性培养分离法
2、(5 5)单细胞(单孢子)分离法)单细胞(单孢子)分离法本讲稿第三页,共四十一页首先将待分离的样品进行连续稀释首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的目的是得到高度稀释的效果效果,使一支试管中分配不到一个微生物使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物养物.这种方法适合于细胞较大的微生物这种方法适合于细胞较大的微生物.(1 1)液体稀释法液体稀释法本讲稿第四页,
3、共四十一页(2 2)平板划线分离法(平板划线分离法(Streak Plate)特点:快速、方便。特点:快速、方便。分区划线(适用于分区划线(适用于浓度较大浓度较大的样品)的样品)连续划线(适用于连续划线(适用于浓度较小浓度较小的样品)的样品)An inoculating loop is used to thin out organisms on the surface of the agar.本讲稿第五页,共四十一页(3 3)平板涂布分离法(平板涂布分离法(Spread Plate)简单易行,但易造成机械损伤简单易行,但易造成机械损伤Liquid specimen is spread on t
4、he surface of solid agar with a sterile bent glass rod.本讲稿第六页,共四十一页(4 4)选择性培养分离法选择性培养分离法为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物,为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物,可以根据该微生物的特点,包括营养、生理、生可以根据该微生物的特点,包括营养、生理、生长条件等,采用选择培养的方法进行分离。长条件等,采用选择培养的方法进行分离。本讲稿第七页,共四十一页(5 5)单细胞(单孢子)分离法)单细胞(单孢子)分离法采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个
5、个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。毛细管法:毛细管法:用毛细管提取微生物个体,适合于较大微生用毛细管提取微生物个体,适合于较大微生物。物。显微操作仪:显微操作仪:用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。获得纯培养。小液滴法:小液滴法:将经过适当稀释后的样品制成小液滴,在显微将经过适当稀释后的样品制成小液滴,在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。本讲稿第八页,共四十一页二、微生物生长量的测定方法二、微生物生长量的
6、测定方法(一)微生物细胞数目的检测法(一)微生物细胞数目的检测法1 1。总菌数的测定总菌数的测定(计数器直接计数,染色涂(计数器直接计数,染色涂片计数,比浊法)片计数,比浊法)2 2。活菌数的测定活菌数的测定(平板计数法、(平板计数法、液体稀释法、膜液体稀释法、膜过滤法过滤法)本讲稿第九页,共四十一页(二)微生物生长量的测定(二)微生物生长量的测定1 1。直接法直接法(干重法,体积法干重法,体积法)2 2。间接法间接法(比浊法,碳、氮含量法,(比浊法,碳、氮含量法,DNADNA测测定法等)定法等)本讲稿第十页,共四十一页1.1.血球计数板法血球计数板法本讲稿第十一页,共四十一页原理:原理:将将
7、1mm20.02mm的薄层空间划分为的薄层空间划分为400小格,从小格,从中均匀分布地选取中均匀分布地选取80小格,计数其中的细胞数目,换小格,计数其中的细胞数目,换算成单位体积中的细胞数。算成单位体积中的细胞数。适用范围:适用范围:个体较大细胞或颗粒,如血球、酵母菌等。个体较大细胞或颗粒,如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞,因为(不适用于细菌等个体较小的细胞,因为(1)细菌细)细菌细胞太小,不易沉降;(胞太小,不易沉降;(2)在油镜下看不清网格线,)在油镜下看不清网格线,超出油镜工作距离。超出油镜工作距离。特点:特点:快速,准确,对酵母菌可同时测定出芽率,或在菌快速,准确,对酵母
8、菌可同时测定出芽率,或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。本讲稿第十二页,共四十一页2.2.涂片染色法涂片染色法应用:应用:可同时计数不同微生物的菌数,适于土壤、可同时计数不同微生物的菌数,适于土壤、牛奶中细菌计数。牛奶中细菌计数。方法:方法:用镜台测微尺计算出视野面积;取用镜台测微尺计算出视野面积;取 0.1ml菌菌液涂于液涂于1cm2面积上,计数后代入公式:面积上,计数后代入公式:每每ml原菌液含菌数原菌液含菌数=视野中平均菌数视野中平均菌数涂布面积涂布面积/视野面积视野面积10稀释稀释倍数倍数本讲稿第十三页,共四十一页3.平板菌落计数法平板菌落计数
9、法本讲稿第十四页,共四十一页技术要求技术要求:样品充分混匀,操作熟练快速(:样品充分混匀,操作熟练快速(1520min完成操作),完成操作),严格无菌操作;严格无菌操作;注意事项:注意事项:每一支吸管只能用于一个稀释度,样品混匀处理,倾每一支吸管只能用于一个稀释度,样品混匀处理,倾注平板时的培养基温度;注平板时的培养基温度;适用范围:适用范围:中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物,生物,误差:误差:多次稀释造成的误差是主要来源,其次还有由于样多次稀释造成的误差是主要来源,其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作品内菌体分布不均匀、以
10、及不当操作本讲稿第十五页,共四十一页4。薄膜过滤计数法薄膜过滤计数法常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。生物数目。将定量的样品通过薄膜(硝化纤维素薄膜、将定量的样品通过薄膜(硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜)过滤,菌体被阻留在滤膜醋酸纤维薄膜)过滤,菌体被阻留在滤膜上,取下滤膜进行培养,然后计算菌落数,上,取下滤膜进行培养,然后计算菌落数,可求出样品中所含菌数。可求出样品中所含菌数。本讲稿第十六页,共四十一页5.干重法干重法将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干然后烘干(干燥温度可采用干燥
11、温度可采用105105、100100或或80)80)、称重。一般干重为湿重的称重。一般干重为湿重的10%20%10%20%,而一个细菌细,而一个细菌细胞一般重约胞一般重约1010-12-121010-13-13g g。该法适合菌浓度较高的样品。该法适合菌浓度较高的样品。举例:大肠杆菌一个细胞一般重约10121013g,液体培养物中细胞浓度达到2109个/ml时,100ml培养物可得1090mg干重的细胞。本讲稿第十七页,共四十一页6.比浊法比浊法原理:原理:是在一定范围内,菌悬液中的细胞浓度与混浊度成是在一定范围内,菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比,即与光密度成正比,菌数越多,光密度越大。因此
12、,正比,即与光密度成正比,菌数越多,光密度越大。因此,借助于分光光度计,在一定波长下测定菌悬液的光密度,借助于分光光度计,在一定波长下测定菌悬液的光密度,就可反应出菌液的浓度。就可反应出菌液的浓度。特点:快速、简便;但易受干扰。特点:快速、简便;但易受干扰。本讲稿第十八页,共四十一页7.生理指标法生理指标法测含氮量测含氮量蛋白质是细胞的主要物质,含量稳定,而氮是蛋白质的主要成蛋白质是细胞的主要物质,含量稳定,而氮是蛋白质的主要成分,通过测含氮量就可推知微生物的浓度。分,通过测含氮量就可推知微生物的浓度。一般细菌含氮量为干重的一般细菌含氮量为干重的12.5%12.5%,酵母菌为,酵母菌为7.5%
13、7.5%,霉菌为,霉菌为6.0%6.0%,根据一定体积培养液中的含氮量再乘以,根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.256.25,就可测,就可测得粗蛋白的含量。得粗蛋白的含量。其他方法其他方法含碳、磷、含碳、磷、DNADNA、RNARNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等,都可用于生长量的测定。产热、粘度等,都可用于生长量的测定。本讲稿第十九页,共四十一页第二节第二节 微生物的生长曲线微生物的生长曲线一、微生物培养一、微生物培养:研究群体生长规律,首先应对微生物进行研究群体生长规律,首先应对微生物进行培养。培养的方法有:培养。培养的方法有
14、:分批培养分批培养和和连续培养连续培养 这两种方法既可用于纯种培养,也可用于混合这两种方法既可用于纯种培养,也可用于混合 本讲稿第二十页,共四十一页1 分批培养分批培养(batch culture):分批培养分批培养(batch culture):将微生物置于一定容积:将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养,培养基一次性加入。不再补的定量的培养基中培养,培养基一次性加入。不再补充和更换,最后一次性收获充和更换,最后一次性收获本讲稿第二十一页,共四十一页2 连续培养连续培养(continuous culture)连续培养连续培养(continuous culture):在微生物培养的过:在微生
15、物培养的过程中,不断地供给新鲜的营养物质,同时排除含菌体及程中,不断地供给新鲜的营养物质,同时排除含菌体及代谢产物的发酵液,让培养的微生物长时间地处于对数代谢产物的发酵液,让培养的微生物长时间地处于对数生长期,以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种生长期,以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。稳定状态。类型:类型:恒浊连续培养和恒化连续培养恒浊连续培养和恒化连续培养本讲稿第二十二页,共四十一页原理:当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时,一方面以原理:当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时,一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌,另一方面以溢流方式流出培养液,一定的速
16、度流进新鲜培养基并搅拌,另一方面以溢流方式流出培养液,使培养物达到动态平衡,其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长使培养物达到动态平衡,其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。状态和稳定的生长速率。(1)连续培养原理)连续培养原理本讲稿第二十三页,共四十一页恒化连续培养恒化连续培养概念概念:以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生:以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。长速率恒定的方法。原理:原理:通过控制某一种营养物浓度通过控制某一种营养物浓度(如碳、氮源、生长(如碳、氮源、生长因子等)因子等),使其始终成为生长限制因子,而达到控制,使其始终成为生
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