酵母双杂交系统技术介绍精选文档.ppt

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1、酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍本讲稿第一页，共四十页主要内容主要内容本讲稿第二页，共四十页背景介绍背景介绍:关注蛋白质关注蛋白质本讲稿第三页，共四十页背景介绍背景介绍:为什么要研究蛋白互作？为什么要研究蛋白互作？本讲稿第四页，共四十页背景介绍背景介绍:Clontech:Clontech 酵母双杂交系统的功能酵母双杂交系统的功能本讲稿第五页，共四十页背景介绍背景介绍:Clontech:Clontech分子生物学工具分子生物学工具ClontechMatchmakerMatchmaker本讲稿第六页，共四十页背景介绍背景介绍:Matchmaker Gold:Matchmaker Gol

2、d 系统系统本讲稿第七页，共四十页背景介绍背景介绍:Matchmaker:Matchmaker GoldGold系统原理系统原理Reporter GeneReporter GeneReporter Gene本讲稿第八页，共四十页主要内容主要内容本讲稿第九页，共四十页基本原理基本原理:酵母双杂交参考文献酵母双杂交参考文献NatureNature.1989 Jul 20;340(6230):245-6.1989 Jul 20;340(6230):245-6.A novel genetic system to detect protein-protein interactions.A novel g

3、enetic system to detect protein-protein interactions.Fields SFields S,Song OSong O.Department of Microbiology,State University of New York at Stony Brook,Department of Microbiology,State University of New York at Stony Brook,Stony Brook 11794.Stony Brook 11794.63000次引用本讲稿第十页，共四十页基本原理基本原理:GAL4:GAL4转录

4、因子的结构转录因子的结构ADADDNA-BDDNA-BDGAL4 GAL4 蛋白具有两个功能结构域蛋白具有两个功能结构域BDBD结合结构域结合结构域ADAD激活结构域激活结构域本讲稿第十一页，共四十页基本原理基本原理:GAL4:GAL4转录因子的分子机理转录因子的分子机理在在GAL4 basedGAL4 based双杂交系统中双杂交系统中:正常情况在酵母细胞内正常情况在酵母细胞内:Promotergal metabolic geneGAL UASTranscriptionADBDReporter GeneGAL4 AD本讲稿第十二页，共四十页基本原理基本原理:三个启动子，四个报告基因三个启动子

5、，四个报告基因获得阳性克隆子获得阳性克隆子获得阳性克隆子获得阳性克隆子报告基因表达报告基因表达AbAAbA抗性筛选抗性筛选AdeAde营养筛选营养筛选HisHis营养筛选营养筛选X-a-galX-a-gal蓝白筛选蓝白筛选M1G1G2降低假阳性！降低假阳性！本讲稿第十三页，共四十页主要内容主要内容本讲稿第十四页，共四十页Clontech MMClontech MM系统的优点系统的优点SMARTSMART方法与同源重组同源重组技术结合构建文库，聪明的酵母自己做克隆。AbAAbA抗性筛选的添加，有效抑制背景生长，大大降低假阳性。文库构建于型酵母菌株型Y187中，方便后续与a型菌株Y2H Gold进

6、行matingmating直接筛选。本讲稿第十五页，共四十页Clontech MMClontech MM系统系统:蛋白互作基本流程蛋白互作基本流程验证蛋白互作验证蛋白互作自己构建文库：自己构建文库：630490630490预制细菌文库：预制细菌文库：638802638802（传统型）（传统型）预制酵母菌文库：预制酵母菌文库：630480630480（均一化，通用型）（均一化，通用型）ClontechClontech蛋白互作相关试剂盒蛋白互作相关试剂盒文库筛选文库筛选文库构建文库构建酵母双杂交系统：酵母双杂交系统：630489630489酵母菌转化试剂盒：酵母菌转化试剂盒：63043963043

7、9酵母培养基（套装）：酵母培养基（套装）：630495630495插入片段检测：插入片段检测：630497630497酵母质粒提取：酵母质粒提取：630467630467体内验证：体内验证：630489630489630305630305体外体外Co-IPCo-IP验证：验证：630458630458630459630459631723631723631604631604本讲稿第十六页，共四十页文库构建文库构建:Clontech MM:Clontech MM文库构建方法文库构建方法 SMART SMART合成合成cDNAcDNA共转化，涂板共转化，涂板 培养，收集菌液培养，收集菌液 文库分装，

8、冻存文库分装，冻存1ml mating1ml matingAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTCCCCCCAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTGGGGGGCCCCCCAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTGGGGGGLD-PCRLD-PCRCCCCCCAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTGGG本讲稿第十七页，共四十页 SMART SMART合成合成cDNAcDNA共转化，涂板共转化，涂板 培养，收集菌液培养，收集菌液 文库分装，冻存文库分装，冻存1ml mating1ml

9、mating自己自己做克隆做克隆SD/Leu-SD/Leu-Y187Y187同源重组同源重组SMART cDNA SMART cDNA 两两小小时时构构建建文文库库文库构建文库构建:Clontech MM:Clontech MM文库构建方法文库构建方法本讲稿第十八页，共四十页 SMART SMART合成合成cDNAcDNA共转化，涂板共转化，涂板 培养，收集菌液培养，收集菌液 文库分装，冻存文库分装，冻存1ml mating1ml matingSD/Leu-SD/Leu-文库构建文库构建:Clontech MM:Clontech MM文库构建方法文库构建方法本讲稿第十九页，共四十页文库构建文库

10、构建:Clontech MM:Clontech MM自制文库筛选自制文库筛选 SMART SMART合成合成cDNAcDNA共转化，涂板共转化，涂板 培养，收集菌液培养，收集菌液 文库分装，冻存文库分装，冻存1ml mating1ml matingY187Y187，AD AD 文库文库Y2Y2H GoldH Gold，BDBD诱饵培养液诱饵培养液DDO/X/ADDO/X/ADDO/X/ADDO/X/A混合混合混合混合QDO/X/AQDO/X/AQDO/X/AQDO/X/A本讲稿第二十页，共四十页文库筛选文库筛选:Clontech MM:Clontech MM文库筛选文库筛选630489 630

11、489 Matchmaker Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid SystemGold Yeast Two-Hybrid System630489630489Y187Y187Y2H GoldY2H Gold三个载体三个载体阳性对照，阳性对照，阴性对照。阴性对照。BD vectorBD vector：pGBKT7pGBKT7AD vector:pGADT7AD vector:pGADT7630439630439极大提高转化率极大提高转化率可以单独购买可以单独购买本讲稿第二十一页，共四十页文库筛选文库筛选:Clontech MM:Clontech MM 系统质粒系统质

12、粒诱饵载体诱饵载体In Y2H GoldIn Y2H Gold本讲稿第二十二页，共四十页文库筛选文库筛选:诱饵载体构建及其自激活检测诱饵载体构建及其自激活检测Y2Y2H GoldH Gold诱饵载体诱饵载体本讲稿第二十三页，共四十页文库筛选文库筛选:Mating:Mating方法筛选方法筛选Y187Y187Y187Y187 型型型型DDODDODDODDO筛选筛选筛选筛选二倍体二倍体二倍体二倍体Y2H GoldY2H GoldY2H GoldY2H Golda a a a 型型型型Mating Mating 接合反应接合反应 酵母的有性生殖过程，酵母的有性生殖过程，ClontechClonte

13、ch利用这个过程，实现了文库筛选。利用这个过程，实现了文库筛选。AD AD BD BD MixMixMixMixMatingMatingMatingMatingQDOQDOQDOQDO筛选筛选筛选筛选本讲稿第二十四页，共四十页文库筛选文库筛选:均一化通用文库筛选均一化通用文库筛选均一化通用型文库均一化通用型文库高丰度与低丰度均衡高丰度与低丰度均衡大大降低工作量大大降低工作量大大降低假阳性大大降低假阳性更高的基因代表性更高的基因代表性NormalizedUniversalPre.libraryY187Y187，AD AD 文库文库Y2Y2H GoldH Gold，BDBD诱饵培养液诱饵培养液DD

14、O/X/ADDO/X/ADDO/X/ADDO/X/A混合混合混合混合QDO/X/AQDO/X/AQDO/X/AQDO/X/A本讲稿第二十五页，共四十页文库筛选文库筛选:传统细菌文库筛选传统细菌文库筛选文库培养文库培养提取质粒提取质粒转化酵母菌转化酵母菌 取1ml菌液按照一定比例用LB稀释，150ul/板进行涂板，过夜培养。将提取的质粒转化Y187，获得酵母文库。MatingMating筛选筛选将文库与诱饵培养液混合，进行Mating。涂筛选板，挑取阳性克隆子。刮取平板上的菌落，提取质粒。本讲稿第二十六页，共四十页文库筛选文库筛选:验证阳性克隆子（验证阳性克隆子（PCRPCR确认）确认）25ul

15、 2mix30 PCR30 PCRcyclescycles25ul H2O630497 630497 Matchmaker Matchmaker Insert Check PCR Mix2Insert Check PCR Mix2本讲稿第二十七页，共四十页文库筛选文库筛选:酵母质粒提取酵母质粒提取630467 630467 E Easy yeast Plasmid Isolation Kit asy yeast Plasmid Isolation Kit 本讲稿第二十八页，共四十页验证互作验证互作:体内验证体内验证SEAPSEAP630305 630305 Mammalian Mammalia

16、n Matchmaker Two-Matchmaker Two-Hybrid Assay Kit 2Hybrid Assay Kit 2本讲稿第二十九页，共四十页验证互作验证互作:体外体外Co-IPCo-IP验证验证BaitAcGFP1AcGFP1PLPLPreyPreyProtein A/GAgarose beadsMatchmaker Chemiluminescent Co-IP Vector SetMatchmaker Chemiluminescent Co-IP Vector Set（630458630458）Matchmaker Chemiluminescent Co-IP KitM

17、atchmaker Chemiluminescent Co-IP Kit（630459630459）Prolabel Chemiluminescent Detection Kit Prolabel Chemiluminescent Detection Kit（631723631723）本讲稿第三十页，共四十页验证互作验证互作:体外体外Co-IPCo-IP验证实验流程验证实验流程PLPL检测检测本讲稿第三十一页，共四十页验证互作验证互作:FRET:FRET分析分析632466 632466 pDsRedpDsRed-Monomer-C1 Vector-Monomer-C1 Vector63247

18、0 632470 pAcGFP1pAcGFP1-C1-Vector-C1-Vector本讲稿第三十二页，共四十页Clontech MatchmakerClontech Matchmaker系统产品选择指南系统产品选择指南本讲稿第三十三页，共四十页1.1.The FRIGIDA Complex Activates Transcription of FLC,a Strong Flowering Repressor in Arabidopsis,by Recruiting Chromatin Modification FactorsThe FRIGIDA Complex Activates Tran

19、scription of FLC,a Strong Flowering Repressor in Arabidopsis,by Recruiting Chromatin Modification Factors K Choi,J Kim,HJ Hwang,S Kim-The Plant Cell,2011-Am Soc Plant Biol 2.2.Extracellular signal-regulated kinase 8(Erk8)controls estrogen-related receptor Extracellular signal-regulated kinase 8(Erk8

20、)controls estrogen-related receptor (ERRERR)cellular localization and inhibits its transcriptional activitycellular localization and inhibits its transcriptional activity M Rossi,D Colecchia,C Iavarone,A Strambi-Journal of Biological,2011 ASBMB3.3.WSB-1,a novel IL-21 receptor binding molecule,enhanc

21、es the maturation of IL-21 receptorWSB-1,a novel IL-21 receptor binding molecule,enhances the maturation of IL-21 receptor H Nara,T Onoda,M Rahman,A Araki-Cellular,2011 Elsevier4.4.FHL1 interacts with oestrogen receptors and regulates breast cancer cell growthFHL1 interacts with oestrogen receptors

22、and regulates breast cancer cell growth L Ding,C Niu,Y Zheng,Z Xiong-Journal of Cellular,2011-Wiley Online Library5.5.Rab4 interacts with the human Pglycoprotein and modulates its surface expression in multidrug resistant K562Rab4 interacts with the human Pglycoprotein and modulates its surface expr

23、ession in multidrug resistant K562 cells cells C FerrndizHuertas-Journal of Cancer,2011-Wiley Online Library6.Duplicated C-class MADS-box genes reveal distinct roles in gynostemium development in Cymbidium ensifolium(Orchidaceae)6.Duplicated C-class MADS-box genes reveal distinct roles in gynostemiu

24、m development in Cymbidium ensifolium(Orchidaceae)SY Wang,PF Lee,YI Lee,YY Hsiao-Plant and Cell,2011-Jpn Soc Plant Physiol7.7.Protein Interaction Domain Mapping of Human Kinetochore Protein Blinkin Reveals a Consensus Motif for Binding of Spindle Assembly Checkpoint Proteins Bub1 and BubR1Protein In

25、teraction Domain Mapping of Human Kinetochore Protein Blinkin Reveals a Consensus Motif for Binding of Spindle Assembly Checkpoint Proteins Bub1 and BubR1 T Kiyomitsu,H Murakami-Molecular and Cellular,2011-Am Soc Microbiol Clontech MatchmakerClontech Matchmaker系统近期参考文献系统近期参考文献本讲稿第三十四页，共四十页主要内容主要内容本讲

26、稿第三十五页，共四十页常见问题分析常见问题分析:酵母双杂交文库如何获得？酵母双杂交文库如何获得？购买购买ClontechClontech公司公司预制文库预制文库用用630490630490自己自己构建文库构建文库请请TakaraTakara公司公司提供提供文库构建服务文库构建服务如何获得酵母双杂交文库如何获得酵母双杂交文库本讲稿第三十六页，共四十页常见问题分析常见问题分析:一定要做自激活检测吗？一定要做自激活检测吗？必须滴！自激活检测必须做：自激活检测必须做：1.需要在Y2H GoldY2H Gold菌株中进行。2.如果出现自激活现象需要调整AbAAbA浓度或者调整序列序列。3.如果菌落生长过

27、慢，可能是表达有毒性，需要用低拷贝质粒pGBT9pGBT9(630490提供)。本讲稿第三十七页，共四十页常见问题分析常见问题分析:诱饵的大小有限制吗？诱饵的大小有限制吗？我们有文献报道的我们有文献报道的8-7508-750个氨基酸都有成功的案例。个氨基酸都有成功的案例。1.Heery,D.M.et al.(1997)Nature 387387(6634):733736.2.Schaefer B.C.,Ed.(1997)Gene Cloningand Analysis:Current Innovations,(Horizon Scientific Press),pp 1128.本讲稿第三十八页，共四十页常见问题分析常见问题分析:培养基较软或发黑？培养基较软或发黑？灭菌条件灭菌条件灭菌条件灭菌条件控制控制控制控制调整调整调整调整pHpHpHpH购买购买购买购买方便包装方便包装方便包装方便包装让培养基正常起来让培养基正常起来本讲稿第三十九页，共四十页：800-810-6261800-810-6261；010-80720985010-80720985 /8686： ： 我们就在这里等您我们就在这里等您本讲稿第四十页，共四十页