第六章蛋白质的分离纯化PPT讲稿.ppt

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1、第六章蛋白质的分离纯化第1页，共109页，编辑于2022年，星期三一、蛋白质的酸碱性质蛋白质中的功能团末端NH2末端COOH侧链基团所以，蛋白质的化学物理性质AA第2页，共109页，编辑于2022年，星期三 A蛋白质是两性电解质，能和酸或碱发生作用。B蛋白质分子的可解离基团来自侧链上的功能团。C结合蛋白质 辅基成分包含可解离蛋白质D末端-COOH,-NH2E蛋白质分子中可解离基团的pK和游离AA中相应基团的pK值完全不相同。在蛋白质分子中受到邻近电荷的影响F蛋白质可看作一个多价离子第3页，共109页，编辑于2022年，星期三蛋白质等电点-在某一pH值，蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷

2、为零。这一pH称为蛋白质等电点第4页，共109页，编辑于2022年，星期三等离子点-没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团界离出来的质子数与质子 受体基团结合的质子数相等时的pH称等离子点。特征常数。第5页，共109页，编辑于2022年，星期三二蛋白质分子的大小与形状 利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量第6页，共109页，编辑于2022年，星期三利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量蛋白质在各种介质中（PAGE）电泳时，它的迁移率第7页，共109页，编辑于2022年，星期三这样造成两个后果：SDS为阴离子，多肽链覆盖上相同密度的负电荷超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原

3、有的电荷差别。因此，所有SDS-蛋白质复合物，电泳时均以同样的电荷/蛋白质比向正极移动。改变了蛋白质单体分子的构象。第8页，共109页，编辑于2022年，星期三SDS-蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴直径均为1.8nm,长轴长度则随蛋白质的分子量而成正比例地变化。电泳迁移率与多肽链分子量的对数有下列关系第9页，共109页，编辑于2022年，星期三第10页，共109页，编辑于2022年，星期三第11页，共109页，编辑于2022年，星期三(七七)毛细管电泳测定蛋白质的分子质量毛细管电泳测定蛋白质的分子质量 毛细管电泳（毛细管电泳（CECE）则可以在很大程度上克服常规方）则可以在很大程度上克服常规方

4、法时间长、灵敏芽低不利情况。用毛细管电泳测定蛋法时间长、灵敏芽低不利情况。用毛细管电泳测定蛋白质分子量仅需要纳克量蛋白质，而且还可以用积分白质分子量仅需要纳克量蛋白质，而且还可以用积分仪或电脑联机精确定量。仪或电脑联机精确定量。第12页，共109页，编辑于2022年，星期三(八八)质谱测定蛋白质分子量质谱测定蛋白质分子量 质质谱谱测测定定蛋蛋白白质质分分子子量量是是近近年年来来发发展展的的一一项项新新技技术术，其其分分辨辨率率和和精精确确度度都都较较前前几几项项技技术术高高。尤尤其其近近几几年年发发展展起起来来的的磁磁质质谱谱可可精精确确测测定定分分子子质质量量2000Da2000Da以以下下

5、的的多多肽肽；而而电电喷喷雾雾质质谱谱（ESIESI）可可以以测测5 5万万DaDa的的蛋蛋白白质质，而而且且只只需需要皮摩尔（要皮摩尔（pmolpmol）量的蛋白质，精确度为）量的蛋白质，精确度为0.01%0.01%。第13页，共109页，编辑于2022年，星期三三蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀1蛋白质的胶体性质蛋白质溶液是分散系统：分散相是蛋白质分子颗粒，分散介质是水。分散程度-胶体系统分散相质点-真溶液（质点是分子，均相系统）第14页，共109页，编辑于2022年，星期三分散程度-以分散相质点的直径来衡量 根据分散程度：第15页，共109页，编辑于2022年，星期三分散相质点在胶体系统中保

6、持稳定需三个条件：a 分散相质点1-100nmb 分散相质点带有同种电荷，互相排斥不聚成颗粒而沉淀c 分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层第16页，共109页，编辑于2022年，星期三蛋白质：a.胶体质点的范围 c 丁达尔效应d 布朗运动e 不能透过半透膜第17页，共109页，编辑于2022年，星期三2蛋白质的沉淀第18页，共109页，编辑于2022年，星期三沉淀蛋白质的方法：盐析法：中性盐（NH4SO4，NaSO4，Nacl等）蛋白质脱去水化层优点：不引起蛋白质变性 有机溶剂沉淀法：极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用 条件：低温操作 缩短时间第1

7、9页，共109页，编辑于2022年，星期三 重金属盐沉淀法当溶液pHpI,蛋白质颗粒带负电荷,易与重金属离子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+.Ag+等)生成沉淀用途：抢救误服重金属盐的病人第20页，共109页，编辑于2022年，星期三生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂能引起生物碱沉淀的一类试剂 当溶液pHpI 蛋白质带电，溶解度较大pHpI 第53页，共109页，编辑于2022年，星期三第54页，共109页，编辑于2022年，星期三第55页，共109页，编辑于2022年，星期三 1不同蛋白质等电点不同 pI时溶解度最低将蛋白质彼此分开第56页，共109页，编辑于2022年，星期三2蛋白质的盐

8、溶和盐析 中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著影响低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度 盐溶作用机理：蛋白质吸附盐类离子，带电表层使蛋白质分子被此排斥，蛋白质与水分子的作用加强，溶解度提高。同样浓度（摩尔数/升）的两价离子的中性外，如MgCl2（NH4）2SO4对蛋白质溶解度的影响效果，要比单价离子的中性盐如NaCl,NH4Cl大得多。第57页，共109页，编辑于2022年，星期三盐析当离子强度增加到足够高时，eg.饱和或半饱和程度，很多蛋白质从水溶液中沉淀出来，这种现象叫盐析。原理大量中性盐的加入，使水的活度降低，原来的溶液中的大部分自由水转变为盐离子的水化水。降低蛋白质极性基团与水分子间的相

9、互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。盐析法分离、提纯常用方法。保持蛋白质的天然构象。（NH4）2SO4第58页，共109页，编辑于2022年，星期三3.有机溶剂分级法第59页，共109页，编辑于2022年，星期三作用原理：.有机溶剂的加入改变了介质的介电常数，增加了两个相反电荷之间的吸引力，。蛋白质的表面可离解基团的离子化程度减弱，水化程度降低，蛋白质分子聚集沉淀。.有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质聚集体的形成并沉淀。第60页，共109页，编辑于2022年，星期三聚乙二醇（水溶性非离子聚合物）可致使蛋白质沉淀。原理：脱去蛋白质的水化层；聚乙二醇与蛋白质亲水基团发生相互作用，并在空间上阻碍

10、蛋白质与水相接近。蛋白质在聚乙二醇中的溶解度与盐浓度，pH，及绝对溶解度无关。其溶解度依赖于聚乙二醇的分子量。第61页，共109页，编辑于2022年，星期三4温度对蛋白质溶解度的影响。0-40摄氏度 大部分球状蛋白质溶解度随温度升高而增大40-50摄氏度 大部分蛋白质变得不稳定,开始变性大多数蛋白质在低温下比较稳定,蛋白质的操作在0摄氏度或更低温度下进行.第62页，共109页，编辑于2022年，星期三糜蛋白酶糜蛋白酶,胰蛋白酶及其前体的制备胰蛋白酶及其前体的制备 第63页，共109页，编辑于2022年，星期三(三)根据电荷不同的分离方法 根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白根据蛋白质的电

11、荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法有质混合物的方法有电泳和离子交换层析电泳和离子交换层析两类。两类。1 1电泳电泳 在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态的蛋白质分子，将向着与其电性相反于等电状态的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称电泳的电极移动，这种现象称电泳(elecctropHoresis)(elecctropHoresis)或离子泳或离子泳(ionpHoresis)(ionpHoresis)。第64页，共109页，编辑于2022年，星期三 或从方法学的角度给电泳下定义，电泳是在外电场存在下，利用分子携带的净电荷不同分

12、离分子混合物的一种实验技术。电泳技术可用于氨基酸、肽、蛋曰质、核苷酸和核酸等生物分子的分离分析和制备。第65页，共109页，编辑于2022年，星期三 带电颗粒在电场中的泳动速度主要决定于它所带的净电荷量以及颗粒的大小和形状。颗粒在电场中发生泳动时，将受到两种方向相反的力的作用：F(电场力)=qE(=qU/s)Ff(摩擦力)=fv第66页，共109页，编辑于2022年，星期三这里，q颗粒所带的电量E电场强度或电势梯度U/qU两电极间的电势差(以伏特表示)S=两电板之间距离(以厘米表示)f摩擦系数(与颗粒的形状，大小和介质的粘度有关)v颗粒泳动速度(以厘米秒表示第67页，共109页，编辑于2022

13、年，星期三当颗粒以恒稳速度移动时，则F-Ff=0，因此，qE=Fv，即，v/E=q/f 在一定的介质中对其一种蛋白质禾说，q/F是一个定值，因而v/E月也是定值，它被称为迁移率或泳动度：u=v/E第68页，共109页，编辑于2022年，星期三u值可以通过实验测得，蛋白质的u值为0.1*10-4-1.0*10-4 厘米2伏特-1秒-1。蛋白质的泳动度以及pH和离子强度对泳动度的影响都反映某一特定蛋白质的特性。因此电泳不仅是分离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯厦的重要手段而且也是研究蛋白质性质很有用的一种物理化学方法。第69页，共109页，编辑于2022年，星期三电泳基础：自由电泳（移动界面电泳）a.先

14、在u-形管内使蛋白质溶液和缓冲液之间形成清晰的界面b.加电场c.由于界面处存在浓度梯度，因而产生折射率梯度。利用光学系统可以观察到界面的移动。每个移动界面相当于一个特定蛋白质。第70页，共109页，编辑于2022年，星期三区带电泳 是由于在支持物上电泳时各组分因迁移数度不同分布成区带而得名。按支持物介质的物理性状：四类区带电泳：1.滤纸电泳.薄膜电泳(醋酸纤维薄膜电泳,薄膜电泳)2.粉末电泳:淀粉.纤维层.硅胶粉3.细丝电泳:尼龙丝,人造丝4.凝胶电泳:聚丙烯酰胺.琼脂糖凝胶第71页，共109页，编辑于2022年，星期三第72页，共109页，编辑于2022年，星期三第73页，共109页，编辑于

15、2022年，星期三盘状电泳在区带电泳基础上发展起来的。支 持 物聚丙烯酰胺凝胶第74页，共109页，编辑于2022年，星期三三种物理效应：1。样品的浓缩效应2。凝胶对分子的筛选效应3。电泳分离的电荷效应样品分离效果好、分辨率等。第75页，共109页，编辑于2022年，星期三 等电聚焦（电聚焦）蛋白质混合物的分离是在具有pH梯度的介质中进行的。用聚丙烯酰胺代替蔗糖溶液介质固体化、操作方便、分离快蛋白质聚焦在等于其等电点的pH点处，形成一个很窄的区带。第76页，共109页，编辑于2022年，星期三双向电泳-AA混合物一次电泳不能完全分开,将第一次电泳分开的斑点通过支持介质间的接触吸印转移到第二个支

16、持介质上,旋转90进行第二次电泳,称双向电泳.优点:设备简单.操作方便,样品用量少第77页，共109页，编辑于2022年，星期三第78页，共109页，编辑于2022年，星期三 19751975年年，OFarrell OFarrell 首首先先运运用用双双向向电电泳泳技技术术将将大大肠肠杆杆菌菌总总蛋蛋白白分分离离出出11001100多多个个蛋蛋白白点点。后后来来此此技技术术一一直直用用于于原原核核生生物物和和真真核核生生物物总总蛋蛋白白的的分分离离。目目前前，随随着着蛋蛋白白组组工工程程的的发发展展，双向电泳技术越来越广泛的用于发现未知蛋白。双向电泳技术越来越广泛的用于发现未知蛋白。双双向向电

17、电泳泳由由第第一一向向等等电电聚聚焦焦(IEF)(IEF)电电泳泳和和第第二二向向SDS-SDS-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)组组成成，第第一一向向使使等等电电点点不不同同的的蛋蛋白白得得到到分分离离，第第二二向向使使分分子子量量不不同同的的蛋蛋白白得得到到分分离离，两两向向结结合合便便得得到到高高分分辨率的蛋白图谱。辨率的蛋白图谱。第79页，共109页，编辑于2022年，星期三2 离子交换层析原理：原理：根据蛋白质等电点的差异将不同蛋白质分开。根据蛋白质等电点的差异将不同蛋白质分开。离子交换介质：离子交换介质：(1)(1)离子交换树脂离子交换树

18、脂 (2)(2)离子交换纤维素离子交换纤维素 (3)Sepharose Fast Flow:(3)Sepharose Fast Flow:(4)Sepharose High Performance (4)Sepharose High Performance：分辨率较：分辨率较F.F.F.F.高高 (5)Mono:HPLC (5)Mono:HPLC第80页，共109页，编辑于2022年，星期三I I 分类：分类：阴离子交换阴离子交换 强度强度 功能基团功能基团 +DEAE DEAE 中等中等 OCHOCH2 2CHCH2 2NH(CHNH(CH2 2CHCH3 3)2 2 +QAE QAE 强强

19、 OCHOCH2 2CHCH2 2NH(CHNH(CH2 2CHCH3 3)2 2CHCH2 2CHCH3 3 阳离子交换阳离子交换 强度强度 功能基团功能基团 CM CM 弱弱 OCHOCH2 2COOCOO-SP SP 强强 CHCH2 2CHCH2 2CHCH2 2SOSO3 3-II II 选择：选择：i i 根据蛋白质的等电点选择介质根据蛋白质的等电点选择介质 ii ii 根据分离目的选择介质根据分离目的选择介质第81页，共109页，编辑于2022年，星期三例如：例如：离子交换纤维素纤维素为交换基质原理：具有松散的亲水性网状结构，吸较大的表面积，大分子可以自由通过优点：交换容量大洗脱

20、条件温和回收率高品种多，选择范围广第82页，共109页，编辑于2022年，星期三离子交换葡聚糖基质：交联葡聚糖优点：交换容量比离子交换纤维素大34倍。能根据净电荷分子大小分离第83页，共109页，编辑于2022年，星期三第84页，共109页，编辑于2022年，星期三第85页，共109页，编辑于2022年，星期三蛋白质混合物的分离由 溶液中的盐离子强度pH 来完成结合力小蛋白质先由层析柱中洗脱出来洗脱时保持洗脱剂成分不改变改变洗脱剂的盐浓度、PH值 第86页，共109页，编辑于2022年，星期三跳跃式分段改变（分段洗脱）渐进式连续改变（梯度洗脱）梯度洗脱优点：分离效果好分辨率高适合：交换容量小，

21、对盐敏感的离子交换剂第87页，共109页，编辑于2022年，星期三两种混合器:简单型混合器 复合型混合器第88页，共109页，编辑于2022年，星期三第89页，共109页，编辑于2022年，星期三 注意的问题：注意的问题：(1)(1)缓冲液的选择缓冲液的选择：阳离子：Tris 阴离子：磷酸盐，柠檬酸盐 (2)(2)介质处理：介质处理：阳离子：Na+型 阴离子：Cl-型 (3)(3)洗脱：洗脱：原理：i改变盐浓度 ii改变pH值方式：i分步洗脱 ii梯度洗脱 (4)(4)介质再生介质再生第90页，共109页，编辑于2022年，星期三第91页，共109页，编辑于2022年，星期三（四）蛋白质的选择

22、吸附分离吸附层析-利用吸附力的强弱不同而达到分离的目的。吸附剂-结晶磷酸钙及羟基磷灰石蛋白质分子中带负电荷的基团，与羟基磷灰石的钙离子结合。用磷酸缓冲液羟基磷灰石-分离核酸：病毒。活性C 硅酸 AL2O3磷酸钙-吸附层析第92页，共109页，编辑于2022年，星期三（五）根据对配基的生物学特异性的分离方法-亲和层析基础：基于蛋白质所具有的生物学特异性。（它与另一种称配基的分子能特异而非共价的结合）配基：能被生物大分子所识别并于之结合的原子，原子团，和分子：酶-底物;激素-受体；抗原：抗体。第93页，共109页，编辑于2022年，星期三原理先把待提纯的某一蛋白质的特异配基，通过适当的化学反应共价

23、的连接到像琼脂糖凝胶一类的载体表面的功能基上，在配基与多糖基质间迁入一个连接臂使配基于凝胶之间保持足够的距离，不改变载体表面的空间位阻妨碍等待分离的大分子与其配基的结合。第94页，共109页，编辑于2022年，星期三第95页，共109页，编辑于2022年，星期三 待提纯的蛋白质样品+多糖材料待提纯的蛋白质样品与配体结合，吸附，在琼质糖颗粒上结合在柱上的蛋白其它蛋白可以用自由配体的分子溶液脱下来第96页，共109页，编辑于2022年，星期三1 原理：利用蛋白质特异性进行分离。利用蛋白质特异性进行分离。2 介质准备：载体选择：Sepharose 4BSepharose 4BSepharose CL

24、4B,Sepharose CL4B,Sepharose Fast Flow,Sepharose Fast Flow,Sepharose High PerformanceSepharose High Performance 空间臂：偶偶联联小小分分子子时时需需要要空空间间臂臂，常常为为双双功功能能基基团团，如如己己二二氨氨或或氨基己酸。氨基己酸。第97页，共109页，编辑于2022年，星期三3 3 配基选择：配基选择：抗抗原原抗抗体体，酶酶抑抑制制剂剂，酶酶底底物物，激激素素受受体体，金金属属结结合合蛋蛋白白螯螯和和剂剂，含含巯巯基基蛋蛋白白HgHg或含巯基分子，凝集素或含巯基分子，凝集素糖蛋白

25、糖蛋白4 4 偶联：偶联：I I 溴化氰法溴化氰法：与：与氨基或氨基或氨基偶联。氨基偶联。效率高，反应时间短，条件温和，适于多种蛋白。效率高，反应时间短，条件温和，适于多种蛋白。II II 环氧氯丙烷法：环氧氯丙烷法：与与NHNH2 2,OH,SH,OH,SH 偶联偶联 偶偶联联时时需需强强烈烈条条件件，如如pH11pH11，40405050，适适于于特特别别稳稳定的蛋白定的蛋白第98页，共109页，编辑于2022年，星期三第99页，共109页，编辑于2022年，星期三六蛋白质含量的测定与纯度的鉴定六蛋白质含量的测定与纯度的鉴定 分析工作：（一）测定蛋白质的总量；（一）测定蛋白质的总量；（二）

26、测定蛋白质混合物中某一特定蛋白质的含（二）测定蛋白质混合物中某一特定蛋白质的含量；量；（三）鉴定最后制品的纯度。（三）鉴定最后制品的纯度。（四）活性测定（四）活性测定第100页，共109页，编辑于2022年，星期三（一）浓度（一）浓度/含量测定含量测定 1 1 紫紫外外法法：蛋白质的芳香族氨基酸在280nm 有吸收。2 2 LowryLowry法法：蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合物，此复合物及芳香族氨基酸还原磷钼酸磷钨酸试剂产生蓝色。3 3 BradfordBradford法法：蛋白质与考马斯亮蓝染料的结合量。4 4 凯氏定氮法凯氏定氮法 5 5 双缩脲法双缩脲法第101页，共109页，编辑于

27、2022年，星期三（二）测定蛋白质混合物中某一特定蛋白（二）测定蛋白质混合物中某一特定蛋白质的含量质的含量-具有高度特异性的生物学方法酶活性激素活性抗原-抗体第102页，共109页，编辑于2022年，星期三（三）蛋白质制品纯度的鉴定 1 1 电泳法：电泳法：SDS SDSPAGEPAGE，IEF IEF 2 2 化学法：化学法：N N端测定，端测定，C C端测定端测定 3 3 仪器法：仪器法：HPLC HPLC，质谱，氨基酸组成分析，质谱，氨基酸组成分析 4 4 物理方法：物理方法：沉降分析沉降分析 扩散分析扩散分析 第103页，共109页，编辑于2022年，星期三（四）活性测定（四）活性测定

28、 1 激酶：标记ATP 2 磷酸化酶：定磷 3 利用靶酶活性 4 氧化还原酶 5 ELISA第104页，共109页，编辑于2022年，星期三溶菌酶：溶菌酶：分分子子量量为为14KD14KD，等等电电点点为为1111，耐耐热热，能能够够水水解解革革兰兰氏氏阳阳性性细细菌菌的的细细胞胞壁壁，鸡鸡蛋蛋清清中中含含量丰富。量丰富。举例：从鸡蛋壳膜中制备溶菌酶举例：从鸡蛋壳膜中制备溶菌酶 第105页，共109页，编辑于2022年，星期三纯化步骤：纯化步骤：150150克鸡蛋壳，克鸡蛋壳，1 1 NaCl0.05 N HCl,40 NaCl0.05 N HCl,40抽提抽提2020醋酸调醋酸调pH4.6p

29、H4.6，7575处理处理3 3分钟，离心取上清分钟，离心取上清加聚丙烯酸，收集沉淀，在沉淀中加入少量加聚丙烯酸，收集沉淀，在沉淀中加入少量5050的的CaClCaCl2 2，离心取上，离心取上清清在上清中加在上清中加NaClNaCl至终浓度至终浓度5 5，将样品加到，将样品加到Sephadex G-50Sephadex G-50层析柱中层析柱中(5X25cm)(5X25cm)，0.6%NaCl0.6%NaCl洗脱，流速洗脱，流速4040毫升毫升/小时，收集洗脱液小时，收集洗脱液5ml/5ml/管管测活，合并含溶菌酶部分测活，合并含溶菌酶部分聚乙二醇浓缩聚乙二醇浓缩结晶结晶第106页，共109

30、页，编辑于2022年，星期三蛋白质的分离纯化小结1 材料获得：材料获得：天然获得新鲜，含量丰富，易于提取，价格便宜。新鲜，含量丰富，易于提取，价格便宜。；基因工程手段获得对对于于天天然然不不易易得得到到的的蛋蛋白白，通通过过工程菌或工程细胞表达而获得工程菌或工程细胞表达而获得。2 粗分离：粗分离：除去大量杂质和杂蛋白，初步浓缩目的蛋白。第107页，共109页，编辑于2022年，星期三3 细分离：细分离：常压柱层析（1）分子筛层析（2）离子交换层析（3）疏水层析（4）亲和层析第108页，共109页，编辑于2022年，星期三4 电泳：电泳：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，等电聚焦电泳，双向电泳。5 蛋白质鉴定蛋白质鉴定（1）蛋白质纯度鉴定（2）蛋白质浓度测定（3）蛋白质活性测定第109页，共109页，编辑于2022年，星期三