实验四酸性磷酸酶及值测定幻灯片.ppt

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1、实验四酸性磷酸酶及值测定第1页，共19页，编辑于2022年，星期五 酸性磷酸酶：酸性磷酸酶：催化磷酸单酯的水解反应催化磷酸单酯的水解反应 存在于人的肝脏，前列腺等处存在于人的肝脏，前列腺等处 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。植物中以发芽的种子中含量最为丰富。是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病的检测指标。是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病的检测指标。一、概述一、概述第2页，共19页，编辑于2022年，星期五 酶液酶液 磷酸苯二钠磷酸苯二钠 苯酚苯酚 磷酸氢二钠磷酸氢二钠 folin-酚测定酚的浓度酚测定酚的浓度 计算出反应速度（用产物生成量计算出反应速度（用产物生成量/min来表示）来表示

2、）根据双倒数法计算出根据双倒数法计算出Km及及Vmax 二、实验原理第3页，共19页，编辑于2022年，星期五第4页，共19页，编辑于2022年，星期五 V=VmaxSSKm+第5页，共19页，编辑于2022年，星期五三、实验步骤：三、实验步骤：1 1、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取2 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线3 3、制作酚标准曲线、制作酚标准曲线 4 4、SS与与V V0 0关系实验关系实验 5 5、双倒数作图法计算、双倒数作图法计算VmaxVmax和和KmKm 第6页，共19页，编辑于2022年，星期五buffe

3、rsubstrateenzymeCertain TimeblankStop the reactionColor developed第7页，共19页，编辑于2022年，星期五生化实验课老师：于晓虹实验报告请交到讲台上来酶液稀释取上清液微升，稀释倍，用大试管装科代表李博恒第8页，共19页，编辑于2022年，星期五 1、磷酸酶原液的制备：磷酸酶原液的制备：称取称取5g5g绿豆芽茎（去头去根），加入绿豆芽茎（去头去根），加入pH5.6pH5.6的的HACHAC缓冲缓冲液液2ml2ml研磨成浆并静置研磨成浆并静置3030分钟。纱布过滤，取分钟。纱布过滤，取1.8ml1.8ml滤液滤液,以以6000rpm

4、6000rpm，离心，离心20min20min，取上清。，取上清。上清液用上清液用pH 5.6pH 5.6的的HACHAC缓冲液稀释缓冲液稀释3030倍，用于实验。倍，用于实验。第9页，共19页，编辑于2022年，星期五2 2、制作酶、制作酶反应时间反应时间与产物生成量的关系曲线与产物生成量的关系曲线（目的：选取合适的反应时间）（目的：选取合适的反应时间）第10页，共19页，编辑于2022年，星期五 加加 液液 程程 序序 表表管号管号 1 2 3 4 5 6 01 2 3 4 5 6 0磷酸苯二钠磷酸苯二钠 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.50.5 0.5 0.5 0.5

5、 0.5 0.5 0.5酶液酶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.50.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5精确反应时间精确反应时间 3 5 10 15 20 25 3 5 10 15 20 25 碳酸钠溶液碳酸钠溶液 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 酶液酶液 0.50.5FolinFolin酚溶液酚溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 FolinFolin酚溶液已稀释好！酚溶液已稀释好！注：注：进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始进行酶促反应时，注意预热

6、，使所有的反应在同等条件下开始35保温保温10分钟分钟第11页，共19页，编辑于2022年，星期五0123456反反应时间应时间03510152025吸光度吸光度结果：结果：以反应时间为横坐标，以反应时间为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制反应进程为纵坐标，绘制反应进程曲线，并从该曲线上求出酸性磷酸酶反应初速率的时间曲线，并从该曲线上求出酸性磷酸酶反应初速率的时间范围。范围。第12页，共19页，编辑于2022年，星期五3 3、制作酚标准曲线、制作酚标准曲线（目的：可从酚标准曲线上查出（目的：可从酚标准曲线上查出A A680680nmnm所相所相当的酚含量当的酚含量,并计算出反应速度（用每分钟并

7、计算出反应速度（用每分钟产物生成量来表示）产物生成量来表示）第13页，共19页，编辑于2022年，星期五0123456780.4mM phenol standard solution00.10.20.30.40.50.60.70.8H2O10.90.80.70.60.50.40.30.21M Na2CO3222222222Folin-phenol reagent0.50.50.50.50.50.50.50.50.5加加 液液 程程 序序 表表35保温保温10分钟分钟第14页，共19页，编辑于2022年，星期五012345678酚含量酚含量/mol00.040.080.120.160.200.2

8、40.280.32吸光度吸光度结果：结果：以酚含量（以酚含量（mol）为横坐标，）为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制标准曲线为纵坐标，绘制标准曲线。以以0号管作空白，在可见光分光光度计号管作空白，在可见光分光光度计680 nm波长处读取各管的吸光度波长处读取各管的吸光度（A680nm）。）。第15页，共19页，编辑于2022年，星期五4 4、SS与与V V0 0关系实验关系实验第16页，共19页，编辑于2022年，星期五 实实 验验 加加 液液 程程 序序 表表管号管号 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 0磷酸苯二钠磷酸苯二钠 0.10 0.15 0.20 0.25 0.3

9、0 0.50 0.50 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.50 0.50 醋酸缓冲液醋酸缓冲液 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 -0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 -酶液酶液 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 -0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 -精精 确确 反反 应应 15 15 分分 钟钟 35 35度度碳酸钠溶液碳酸钠溶液 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 FolinFolin酚溶液酚溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

10、0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 酶液酶液 0.5 0.5 3535保温保温1010分钟分钟测测680nm680nm处吸光度处吸光度 注：注：进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始第17页，共19页，编辑于2022年，星期五 实验中需注意事项：实验中需注意事项：酶反应作用时间精确控制酶反应作用时间精确控制 第18页，共19页，编辑于2022年，星期五Tube number123456S(mM)0.50.7511.251.52.51/SA680phenol content（酚含量）V0(mole phenol per min)1/V0实验结果1、酚含量从酚标准曲线上查得、酚含量从酚标准曲线上查得2 2、V V0 0 反应初速率（反应初速率（mol/minmol/min）为酚含量除以酶反应时间（）为酚含量除以酶反应时间（1515分钟）。分钟）。3 3、双倒数作图法计算、双倒数作图法计算VmaxVmax和和KmKm第19页，共19页，编辑于2022年，星期五