第六章微生物的生长及控制PPT讲稿.ppt
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1、第六章微生物的生长及控制第1页,共134页,编辑于2022年,星期三生物个体由小到大的增长,即表现为细生物个体由小到大的增长,即表现为细胞组分与结构在量方面的增加胞组分与结构在量方面的增加生长生长指生物个体数目的增加指生物个体数目的增加繁殖繁殖在单细胞微生物中,生长繁殖的速度很快,而且两者始终交替进行,个体生长与繁殖的界限难以划清,因此实际上常群体生长群体生长作为衡量微生物生长的指标。第2页,共134页,编辑于2022年,星期三 个体生长个体生长个体繁殖个体繁殖群体生长群体生长 群体生长个体生长个体繁殖群体生长个体生长个体繁殖 在微生物的研究和应用中,只有群体的在微生物的研究和应用中,只有群体
2、的生长才有实际意义。生长才有实际意义。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因素相互作用下的综合反映。群体生长的实质是包含着个体细胞生长与繁殖交替进行的过程,称之为发育。第3页,共134页,编辑于2022年,星期三第一节第一节 测定生长繁殖的方法测定生长繁殖的方法微生物学中将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养。一、纯培养的分离方法(一)、稀释法l液体稀释法l固体稀释倒平板法第4页,共134页,编辑于2022年,星期三稀释倒平板法第5页,共134页,编辑于2022年,星期三(二)、平板划线分离法 用接种环以菌操作沾
3、取少许待分离的材料,在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线,如果划线适宜的话,微生物能一一分散,经培养后,可在平板表面得到单菌落。第6页,共134页,编辑于2022年,星期三(三)、单孢子或单细胞分离法 采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。在显微镜下使用在显微镜下使用单孢子分离器单孢子分离器进行机械操作,挑取进行机械操作,挑取单孢子或单细胞进行培养。也可以采用特制的毛细管在单孢子或单细胞进行培养。也可以采用特制的毛细管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来,然后移到载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来,然后移到合适的培养基进行培养。合
4、适的培养基进行培养。第7页,共134页,编辑于2022年,星期三(四)、选择性培养基分离法各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力,利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其它微生物生长的选择培养基,用它来培养微生物以获得纯培养。微生物纯培养分离方法的比较微生物纯培养分离方法的比较分离方法分离方法应用范围应用范围平皿划线法平皿划线法方法简便,多用于分离细菌方法简便,多用于分离细菌稀释倒平皿法稀释倒平皿法即可定性,又可定量,用途广泛即可定性,又可定量,用途广泛单细胞挑取法单细胞挑取法局限于高度专业化的科学研究局限于高度专业化的科学研究利用选择培养基法利用选择培养基法适适用用于于
5、分分离离某某些些生生理理类类型型较较特特殊殊的的第8页,共134页,编辑于2022年,星期三二、微生物生长繁殖的测定二、微生物生长繁殖的测定测定微生物生长的方法根据:生长意味着原生质含量的增加第9页,共134页,编辑于2022年,星期三(一)测生长量1、直接法l测体积 l称干重:1mg干菌体=5-10mg湿菌体 =5-10107个菌体2、间接法 l比浊法 l生理指标法 第10页,共134页,编辑于2022年,星期三比浊法第11页,共134页,编辑于2022年,星期三生理指标测定法常用于对微生物的快速鉴定与检测微生物的生理指标,如呼吸强度,耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。与微生物
6、生长量相平行的生理指标:含氮量含氮量、含碳量、几丁质含量、DNA、RNA等等蛋白质总量=含N量%6.25第12页,共134页,编辑于2022年,星期三(二)计繁殖数 即计算微生物的个体数目 计繁殖数只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子 第13页,共134页,编辑于2022年,星期三1、直接法 所得的结果是包括死细胞在内的总菌数 a、涂片染色法 原菌液含菌数/mL=视野中平均菌数视野个数/cm2 100 稀释倍数 b、比例计数法 c、血球计数板 第14页,共134页,编辑于2022年,星期三利用血球利用血球计数板,计数板,在显微镜在显微镜下计算一下计算一定容积里定容积里样品中微样品
7、中微生物的数生物的数量。量。缺点:缺点:不能区分死菌与活菌;不能区分死菌与活菌;不适于对运动细菌的计数;不适于对运动细菌的计数;需要相对高的细菌浓度;需要相对高的细菌浓度;个体小的细菌在显微镜下难以观察。个体小的细菌在显微镜下难以观察。原菌液含菌数原菌液含菌数/mL=/mL=每小格每小格平均数平均数4001000040010000稀释倍稀释倍数数第15页,共134页,编辑于2022年,星期三2 2、间接法、间接法 原理是每个活细菌在适宜的培养基和良原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。好的生长条件下可以通过生长形成菌落。所测的菌落就是待测样品所含的活菌数。所测的
8、菌落就是待测样品所含的活菌数。第16页,共134页,编辑于2022年,星期三平板菌落计数法 第17页,共134页,编辑于2022年,星期三第18页,共134页,编辑于2022年,星期三优点:优点:u适用于多种材料;适用于多种材料;u菌数较少也能准确测定。菌数较少也能准确测定。缺点:缺点:u并非所有微生物在试验期间都能长出菌落;并非所有微生物在试验期间都能长出菌落;u意外的损伤可能导致菌落减少;意外的损伤可能导致菌落减少;u肉眼无法观察的菌落。肉眼无法观察的菌落。活菌指示剂:活菌指示剂:TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)氯化三苯基四氮唑)第19页,共134页,编辑于2022年,星期三厌氧的菌
9、落计数法l亨格特的预还原灭菌厌氧培养基的转管技术、气体喷射培养法 l厌氧手套箱培养法 用于要求严格的厌氧培养法的微生态学(正常菌群)的研究用于要求严格的厌氧培养法的微生态学(正常菌群)的研究工作工作 l厌氧罐(袋)法结合其它厌氧培养方法 不适用于对氧极其敏感的厌氧菌。但是在临床细菌的检不适用于对氧极其敏感的厌氧菌。但是在临床细菌的检验工作中,可以充分使用此法分离感染症中的厌氧病原菌。验工作中,可以充分使用此法分离感染症中的厌氧病原菌。第20页,共134页,编辑于2022年,星期三一、同步培养一、同步培养 概念:同步培养(synchronous culture)是一种培养方法,它能使群体中不同步
10、的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。同步生长:以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段,并同时进行分裂的生长方式同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子,它是一种理想的材料。第二节 微生物的生长规律第21页,共134页,编辑于2022年,星期三同步培养方法同步培养方法机械方法环境条件诱导法离心方法离心方法过滤分离法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法硝酸纤维素滤膜法温度温度培养基成份控制培养基成份控制最高稳定期的细胞接种最高稳定期的细胞接种第22页,共134页,编辑于2022年,星期三硝硝酸酸纤纤维维素素滤滤膜膜法法离离心心法法第23页,共134页,编辑于
11、2022年,星期三机械法:机械法:l优点:不影响细菌代谢;优点:不影响细菌代谢;l缺点:不能用于即使是相同发育阶段个体大小不一缺点:不能用于即使是相同发育阶段个体大小不一致的微生物。致的微生物。诱导法:诱导法:l优点:方法多、应用范围广;优点:方法多、应用范围广;l缺点:对细菌代谢有影响。缺点:对细菌代谢有影响。第24页,共134页,编辑于2022年,星期三 将少量单细胞的纯培养物接种将少量单细胞的纯培养物接种于一恒定容积的新鲜培养基中在合于一恒定容积的新鲜培养基中在合适条件下进行培养,在不补充营养适条件下进行培养,在不补充营养物质或移去培养物,保持整个培养物质或移去培养物,保持整个培养液体积
12、不变条件下,以时间为横坐液体积不变条件下,以时间为横坐标,以菌数为纵坐标,根据不同培标,以菌数为纵坐标,根据不同培养时间时细菌数量的变化,可以作养时间时细菌数量的变化,可以作出一条反映细菌在整个培养期间菌出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。数变化规律的曲线。生长曲线生长曲线二、单细胞微生物的典型生长曲线二、单细胞微生物的典型生长曲线 第25页,共134页,编辑于2022年,星期三生长曲线可分:生长曲线可分:延滞期延滞期对数期对数期衰亡期衰亡期稳定期稳定期第26页,共134页,编辑于2022年,星期三(一)延滞期(一)延滞期(lagphaselagphase)特点:特点:生长速率常数
13、等于零;生长速率常数等于零;细胞形态变大或增长;细胞形态变大或增长;细胞内细胞内RNARNA尤其是尤其是rRNArRNA含量增高,原生质呈嗜碱性;含量增高,原生质呈嗜碱性;合成代谢活跃;合成代谢活跃;对外界不良条件反应敏感。对外界不良条件反应敏感。将少量菌种接入新鲜培养基后,在开始一段时间内菌数将少量菌种接入新鲜培养基后,在开始一段时间内菌数不立即增加,或增加很少,生长速度接近于零。也称延迟期、不立即增加,或增加很少,生长速度接近于零。也称延迟期、适应期、调整期。适应期、调整期。第27页,共134页,编辑于2022年,星期三 延滞期的出现,可能是因为在接种到新鲜培养液的细胞中,一时还缺乏分解或
14、催化有关底物的酶、辅酶或是缺乏充足的中间代谢物。为产生诱导酶或合成有关的中间代谢物,就需要有一段适应期,于是出现了生长的延滞期。出现延滞期的原因?出现延滞期的原因?第28页,共134页,编辑于2022年,星期三影响延滞期长短的因素影响延滞期长短的因素 菌种菌种接种龄接种龄 接种量接种量 培养基成分培养基成分 第29页,共134页,编辑于2022年,星期三 在工业发酵和科研中通常采取一定的措在工业发酵和科研中通常采取一定的措施缩短延滞期:施缩短延滞期:l通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短;通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短;l利用对数生长期的细胞作为利用对数生长期的细胞作为“种子
15、种子”;l尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大;尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大;l适当扩大接种量等方式缩短迟缓期,克服不良的影响。适当扩大接种量等方式缩短迟缓期,克服不良的影响。第30页,共134页,编辑于2022年,星期三(二)指数期(二)指数期(exponentialphaseexponentialphase)又称为对数期,是指生长曲线中紧接延滞期的一个细又称为对数期,是指生长曲线中紧接延滞期的一个细胞以几何级数速度分裂的一段时期。胞以几何级数速度分裂的一段时期。特点:特点:生长速率常数生长速率常数R R最大,因而细胞每分裂一次所需的代时最大,因而细胞每分裂一次所需的
16、代时G G或原生质增加一倍所需的倍增时间最短;或原生质增加一倍所需的倍增时间最短;细胞进行平衡生长,菌体内各种成分最为均匀;细胞进行平衡生长,菌体内各种成分最为均匀;酶系活跃,代谢旺盛。酶系活跃,代谢旺盛。第31页,共134页,编辑于2022年,星期三繁殖代数(繁殖代数(n n)繁殖代数繁殖代数 n=3.322(lgx2lgx1)12=2124=2248=23816=2416=1 24.2nx2=x1 2nlgx2=lgx1+nlg2n=(lgx2 lgx1)/lg2=3.322(lgx2 lgx1)第32页,共134页,编辑于2022年,星期三生长速率常数(生长速率常数(R R)代时(代时(
17、G G)第33页,共134页,编辑于2022年,星期三例:设大肠杆菌在接种时的细胞浓度为100个/mL,经过400min的培养细胞浓度增至10亿个/mL,求该菌的繁殖代数和世代时间。解:n=3.322(lg x 2 lg x1)=3.322(lg 109 lg102)=23.2 G=1/R=(t1 t2)/3.322(lg x 2 lg x1)=17.3第34页,共134页,编辑于2022年,星期三影响指数期微生物代时的因素影响指数期微生物代时的因素 菌种菌种 营养成分营养成分 营养物浓度营养物浓度 培养温度培养温度 凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和菌体产量的某营养物称为生长因子。第35页
18、,共134页,编辑于2022年,星期三大肠杆菌:12.5-17min枯草芽孢杆菌:26-32min嗜热乳杆菌:66-87min结核分枝杆菌:792-932min梅毒密螺旋体:1980min第36页,共134页,编辑于2022年,星期三大肠杆菌:牛奶 12.5min 肉汤 17min产气肠杆菌:肉汤或牛奶 16-18min 组合 29-44min乳酸链球菌:牛奶 26min 乳糖肉汤 48min第37页,共134页,编辑于2022年,星期三对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致,代谢旺盛、生长迅速、代时稳定,所以是研究微生物基本代谢的良好材料,也是增殖噬菌体的最适宿主。对数生长期
19、的细菌常在生产上用作种子,使微生物发酵的迟缓期缩短,提高经济效益。第38页,共134页,编辑于2022年,星期三(三)稳定期(三)稳定期(stationaryphasestationaryphase)特点特点生长速率常数生长速率常数R R等于等于0 0菌体产量达到了最高点菌体产量达到了最高点 菌体产量与营养物质的消耗间呈现出一定的比例菌体产量与营养物质的消耗间呈现出一定的比例 关系,即,生长产量常数关系,即,生长产量常数Y Y 又称为恒定期或者最高生长期。又称为恒定期或者最高生长期。第39页,共134页,编辑于2022年,星期三稳定期到来的原因稳定期到来的原因营养物尤其是生长限制因子的耗尽;营
20、养物尤其是生长限制因子的耗尽;营养物的比例失调,例如营养物的比例失调,例如C CN N比值不合适等;比值不合适等;酸、醇、毒素或酸、醇、毒素或H H2 2O O2 2等有害代谢产物的累积;等有害代谢产物的累积;pHpH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜。、氧化还原势等物化条件越来越不适宜。第40页,共134页,编辑于2022年,星期三稳定期的细胞行为稳定期的细胞行为细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物;细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物;多数芽孢杆菌在这时开始形成芽孢;多数芽孢杆菌在这时开始形成芽孢;有的微生物在稳定期时还开始合成抗生素等次生代谢有的微生物在稳定期时还开始合成抗生素等
21、次生代谢产物;产物;是乳酸等发酵生产的最佳收获期。是乳酸等发酵生产的最佳收获期。第41页,共134页,编辑于2022年,星期三获得更多的菌体物质或代谢产物采取措施:获得更多的菌体物质或代谢产物采取措施:补充营养物质或取走代谢产物或改善培养条件补充营养物质或取走代谢产物或改善培养条件,如对好氧菌进行通气、搅拌或振荡等。,如对好氧菌进行通气、搅拌或振荡等。第42页,共134页,编辑于2022年,星期三(四)衰亡期(四)衰亡期(declinephasedeclinephase或或deathphasedeathphase)个体死亡的速度超过新生的速度,因此,个体死亡的速度超过新生的速度,因此,整个群体
22、就呈现出负生长(整个群体就呈现出负生长(R R为负值)为负值)现象:现象:细菌代谢活性降低,细菌衰老并出现自溶,产生或细菌代谢活性降低,细菌衰老并出现自溶,产生或释放出一些产物,如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素释放出一些产物,如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态,有时产生畸形,细胞大小悬殊,等。细胞呈现多种形态,有时产生畸形,细胞大小悬殊,有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。第43页,共134页,编辑于2022年,星期三特点:特点:l细胞形态多样,例如会产生很多膨大、不规则的细胞形态多样,例如会产生很多膨大、不规则的 退化形态;退化形
23、态;l有的微生物因蛋白水解酶活力的增强就发生自溶有的微生物因蛋白水解酶活力的增强就发生自溶 (autolysisautolysis););l有的微生物在这时产生或释放对人类有用的抗生有的微生物在这时产生或释放对人类有用的抗生 素等次生代谢产物;素等次生代谢产物;l在芽孢杆菌中,芽孢释放往往也发生在这一时期在芽孢杆菌中,芽孢释放往往也发生在这一时期第44页,共134页,编辑于2022年,星期三三、微生物的连续培养三、微生物的连续培养 连续培养:连续培养:又称开放培养,当微生物以单批培养的方式培养到指又称开放培养,当微生物以单批培养的方式培养到指数期的后期时,一方面以一定速度连续流入新鲜培养基和通
24、入无数期的后期时,一方面以一定速度连续流入新鲜培养基和通入无菌空气,并立即搅拌均匀;另一方面,利用溢流的方式,以同样菌空气,并立即搅拌均匀;另一方面,利用溢流的方式,以同样的流速不断流出培养物。于是容器内的培养物就可达到动态平衡,的流速不断流出培养物。于是容器内的培养物就可达到动态平衡,其中的微生物可长期保持在指数期的平衡生长状态和衡定的生长其中的微生物可长期保持在指数期的平衡生长状态和衡定的生长速率上,就形成了连续生长。速率上,就形成了连续生长。第45页,共134页,编辑于2022年,星期三连续培养器连续培养器 连续培养的基本原则:连续培养的基本原则:微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同
25、微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物。样的速率移出培养物。第46页,共134页,编辑于2022年,星期三恒浊器(恒浊器(turbidostatturbidostat)控制培养液流速控制培养液流速,以取得菌体密度高、生长速,以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器,可达到度恒定的微生物细胞的连续培养器,可达到恒密度恒密度的目的,使微生物在最高生长速率下生长。的目的,使微生物在最高生长速率下生长。为了获得大量菌体或与菌体生长相平行的某些为了获得大量菌体或与菌体生长相平行的某些代谢产物如乳酸、乙醇时,都可以利用恒浊器。代谢产物如乳酸、乙醇时,都可以利用恒浊器。第4
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