蛋白质的结构精选文档.ppt

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1、蛋白质的结构本讲稿第一页，共二十七页化学组成法测定最低分子量化学组成法测定最低分子量SDS-PAGE法法凝胶过滤法凝胶过滤法渗透压法渗透压法扩散系数法扩散系数法沉降系数法和沉降平衡法沉降系数法和沉降平衡法2蛋白质的分子量大小测定蛋白质的分子量大小测定本讲稿第二页，共二十七页如肌红蛋白含如肌红蛋白含0.335%的铁，的铁，Fe分子量分子量55.8最小最小M10010016700Fe分子量分子量Fe(%)55.80.3351）根据分子组成测定）根据分子组成测定最低分子量最低分子量血红蛋白含血红蛋白含0.335%的铁，的铁，Fe分子量分子量55.8血红蛋白的实际分子量是血红蛋白的实际分子量是6680

2、0（167004）本讲稿第三页，共二十七页2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）带电物质在电场中迁移的带电物质在电场中迁移的速度受什么影响？速度受什么影响？电荷多少电荷多少分子大小分子大小形状形状加入加入SDS和巯基乙醇和巯基乙醇？本讲稿第四页，共二十七页SDS（十二烷基硫酸钠）（十二烷基硫酸钠）sodium dodecyl sulfate本讲稿第五页，共二十七页 使用去污剂十二烷基硫酸钠（使用去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）和还原）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸品进行处理（一般煮沸3

3、5分钟），通过加热和分钟），通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。离为单亚基。同时还原剂可以切断蛋白质中的任何一个二硫同时还原剂可以切断蛋白质中的任何一个二硫键（使二硫键还原）。键（使二硫键还原）。经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的，分离的状态。接的，分离的状态。本讲稿第六页，共二十七页 SDS 是一种阴离子去污剂，带有很多负电荷。与蛋白是一种阴离子去污剂，带有很多负电荷。与蛋白质结合以后，使蛋白质分子带有足够的负电荷，远远超过质结合以后，使蛋白质分子带有足够的负电荷，远

4、远超过了蛋白质分子原有的电荷，蛋白质分子原有的电荷就变得了蛋白质分子原有的电荷，蛋白质分子原有的电荷就变得无足轻重了。无足轻重了。SDS是一种变性剂，与蛋白质结合，改变了蛋白质单是一种变性剂，与蛋白质结合，改变了蛋白质单体分子的形状，均变成体分子的形状，均变成长椭圆棒状长椭圆棒状。所以在电场上。所以在电场上移动的移动的速度完全取决于蛋白质分子的大小速度完全取决于蛋白质分子的大小。本讲稿第七页，共二十七页本讲稿第八页，共二十七页注意：SDSPAGE是将蛋白质解离成亚基，所以测出的分子量是亚基的分子量。本讲稿第九页，共二十七页3）沉降分析法）沉降分析法沉降速度：指离心时，蛋白质分子在单位时间内下沉

5、的距沉降速度：指离心时，蛋白质分子在单位时间内下沉的距离。离。沉降常数（沉降系数）沉降常数（沉降系数）：当沉降界面以恒速移动时，单位：当沉降界面以恒速移动时，单位离心场中的沉降速度。离心场中的沉降速度。S：沉降常数：沉降常数 v：沉降速度（：沉降速度（cm/sec）w：离心机转头的角速度（弧度：离心机转头的角速度（弧度/sec）x：蛋白质界面中点离旋转中心的距离，：蛋白质界面中点离旋转中心的距离，以以cm计。计。本讲稿第十页，共二十七页沉降的速度与颗粒的重沉降的速度与颗粒的重量、密度和形状有关。量、密度和形状有关。离心后按其沉降的速度不离心后按其沉降的速度不同，彼此分开形成区带。同，彼此分开形

6、成区带。再进行光学定位，针刺或再进行光学定位，针刺或冰冻切片采样分析。冰冻切片采样分析。蔗糖密度梯度蔗糖密度梯度聚蔗糖密度梯度聚蔗糖密度梯度氯化铯密度剃度离心氯化铯密度剃度离心本讲稿第十一页，共二十七页沉降系数沉降系数:把把10-13秒作为一个单位，称为斯维得贝格单秒作为一个单位，称为斯维得贝格单位，或沉降系数单位，用位，或沉降系数单位，用S（大写）表示。（大写）表示。瑞典的蛋白质化学家瑞典的蛋白质化学家T.Svedberg 1S=10-13本讲稿第十二页，共二十七页M=RTSD（1V）R气体常数（气体常数（8.314107ergsmol-1 度度-1）T绝对温度绝对温度D扩散常数（蛋白质分子

7、量很大，离心机扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机转速很快，则忽略不计）转速很快，则忽略不计）V蛋白质的微分比容（蛋白质的微分比容（m3g-1）溶剂密度（溶剂密度（20，gml-1）S沉降系数沉降系数 蛋白质分子量（蛋白质分子量（M）与沉降系数（）与沉降系数（s）的关系）的关系本讲稿第十三页，共二十七页3 3等电点的测定等电点的测定 本讲稿第十四页，共二十七页4 4生物活性的测定生物活性的测定 不同的蛋白质有不同的生物功能，也不同的蛋白质有不同的生物功能，也就有不同的生物活性测定的方法。就有不同的生物活性测定的方法。本讲稿第十五页，共二十七页（六）含量测定（六）含量测定总蛋白含量分析：总蛋白含量

8、分析：凯氏定氮法、凯氏定氮法、Folin-酚法（酚法（Lowry法）、双缩法）、双缩脲法、考马斯亮蓝法、紫外吸收法。脲法、考马斯亮蓝法、紫外吸收法。特定蛋白组分的含量分析：特定蛋白组分的含量分析：酶和激素等：酶活性或激素活性表示酶和激素等：酶活性或激素活性表示其它蛋白：抗原抗体反应其它蛋白：抗原抗体反应(westernblot)本讲稿第十六页，共二十七页 说明双向电泳分离蛋白质的技术原理及其在蛋白说明双向电泳分离蛋白质的技术原理及其在蛋白质组学研究中的重要意义质组学研究中的重要意义 西北大学西北大学 05年年 双向电泳（双向电泳（two-dimensional electrophoresis）

9、如果将等电聚焦电泳与如果将等电聚焦电泳与SDS-PAGE结合起来，就是分辨结合起来，就是分辨率更高的一种双向电泳了。双向电泳后的凝胶经染色，蛋白呈率更高的一种双向电泳了。双向电泳后的凝胶经染色，蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在现二维分布图，水平方向反映出蛋白在pI上的差异，而垂直方上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。所以双向电泳可以将分子量向反映出它们在分子量上的差别。所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。白质分开。本讲稿第十七页，共二十七页某种溶液中含有三种三肽：某种溶

10、液中含有三种三肽：Tyr-Arg-Ser,Glu-Met-Phe 和和Asp-Pro-Lys,-COOH基团的基团的pKa 为为3.8;-NH3基团的基团的pKa为为8.5。在哪种。在哪种pH（2.0,6.0或或13.0）下，通）下，通过电泳分离这三种多肽的效果最好？过电泳分离这三种多肽的效果最好？本讲稿第十八页，共二十七页下列试剂和酶常用于蛋白质化学的研究中：下列试剂和酶常用于蛋白质化学的研究中：CNBr;异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯;丹黄酰氯；脲丹黄酰氯；脲;6mol/LHCl;-巯基乙醇巯基乙醇;水合茚三酮水合茚三酮;过甲酸过甲酸;胰蛋白酶胰蛋白酶;胰凝乳蛋白酶。胰凝乳蛋白酶。其中哪一个最适

11、合完成以下各项任务？其中哪一个最适合完成以下各项任务？（a）测定小肽的氨基酸序列。）测定小肽的氨基酸序列。（b）鉴定肽的氨基末端残基。）鉴定肽的氨基末端残基。（c）不含二硫键的蛋白质的可逆变性。若有二硫键存在时还需）不含二硫键的蛋白质的可逆变性。若有二硫键存在时还需加什么试剂？加什么试剂？（d）在芳香族氨基酸残基羧基侧水解肽键。）在芳香族氨基酸残基羧基侧水解肽键。（e）在蛋氨酸残基羧基侧水解肽键。）在蛋氨酸残基羧基侧水解肽键。（f）在赖氨酸和精氨酸残基侧水解肽键。）在赖氨酸和精氨酸残基侧水解肽键。本讲稿第十九页，共二十七页合成的多肽多聚谷氨酸（合成的多肽多聚谷氨酸（GluGlu）n n），当处

12、在），当处在pH3.0pH3.0以下时，以下时，在水溶液中形成在水溶液中形成螺旋，而在螺旋，而在pH5.0pH5.0以上时却为伸展的形态。以上时却为伸展的形态。a a）试解释该现象。）试解释该现象。b b）在哪种）在哪种pHpH条件下多聚赖氨酸（条件下多聚赖氨酸（LysLys）会形成）会形成-螺旋？螺旋？答：（答：（a）Glu侧链的侧链的pKa约为约为4.1，当，当pH值远远低于值远远低于4.1（大约（大约3左左右）时，几乎所有的多聚谷氨酸侧链为不带电荷的状态，多肽链能右）时，几乎所有的多聚谷氨酸侧链为不带电荷的状态，多肽链能够形成够形成-螺旋。在螺旋。在pH值为值为5或更高时，几乎所有的侧链

13、都带负电荷，或更高时，几乎所有的侧链都带负电荷，邻近电荷之间的静电排斥力阻止螺旋的形成，因此使同聚物呈现出邻近电荷之间的静电排斥力阻止螺旋的形成，因此使同聚物呈现出一种伸展的构象。一种伸展的构象。（b）Lys侧链的侧链的pK为为10.5，当，当pH值远远高于值远远高于10.5时，多聚赖氨酸时，多聚赖氨酸大多数侧链为不带电荷的状态，该多肽可能形成一种大多数侧链为不带电荷的状态，该多肽可能形成一种-螺旋构象，螺旋构象，在较低的在较低的pH值时带有许多正电荷的分子可能会呈现出一种伸展的构值时带有许多正电荷的分子可能会呈现出一种伸展的构象。象。本讲稿第二十页，共二十七页氨基酸的定量分析表明牛血清白蛋白

14、含有氨基酸的定量分析表明牛血清白蛋白含有0.58的色氨酸（色氨的色氨酸（色氨酸的分子量为酸的分子量为204）。）。（a）试计算牛血清白蛋白的最小分子量（假设每个蛋白分子只）试计算牛血清白蛋白的最小分子量（假设每个蛋白分子只含有一个色氨酸残基）。含有一个色氨酸残基）。（b）凝胶过滤测得的牛血清白蛋白的分子量为）凝胶过滤测得的牛血清白蛋白的分子量为70，000，试问，试问血清白蛋白分子含有几个色氨酸残基？血清白蛋白分子含有几个色氨酸残基？本讲稿第二十一页，共二十七页1、在寡聚蛋白质中，亚基间的立体排布、相互作用以及接触部位、在寡聚蛋白质中，亚基间的立体排布、相互作用以及接触部位间的空间结构称之谓间

15、的空间结构称之谓()A、三级结构、三级结构B、缔合现象、缔合现象C、四级结构、四级结构D、变构现象、变构现象2、形成稳定的肽链空间结构，非常重要的一点是肽键中的四个原、形成稳定的肽链空间结构，非常重要的一点是肽键中的四个原子以及和它相邻的两个子以及和它相邻的两个-碳原子处于碳原子处于()A、不断绕动状态、不断绕动状态B、可以相对自由旋转、可以相对自由旋转C、同一平面、同一平面D、随、随不同外界环境而变化的状态不同外界环境而变化的状态3、肽链中的肽键是：、肽链中的肽键是：()A、顺式结构、顺式结构B、顺式和反式共存、顺式和反式共存C、反式结构、反式结构4、维持蛋白质二级结构稳定的主要因素是：、维

16、持蛋白质二级结构稳定的主要因素是：()A、静电作用力、静电作用力B、氢键、氢键C、疏水键、疏水键D、范德华作用、范德华作用力力本讲稿第二十二页，共二十七页5、蛋白质变性是由于（、蛋白质变性是由于（）A、一级结构改变、一级结构改变B、空间构象破坏、空间构象破坏C、辅基脱落、辅基脱落D、蛋白质水解蛋白质水解6、必需氨基酸是对（、必需氨基酸是对（）而言的。）而言的。A、植物、植物B、动物、动物C、动物和植物、动物和植物D、人和动物、人和动物7、在下列所有氨基酸溶液中，不引起偏振光旋转的氨基、在下列所有氨基酸溶液中，不引起偏振光旋转的氨基酸是（酸是（）A、丙氨酸、丙氨酸B、亮氨酸、亮氨酸C、甘氨酸、甘

17、氨酸D、丝氨酸、丝氨酸8、天然蛋白质中含有的、天然蛋白质中含有的20种氨基酸的结构（种氨基酸的结构（）A、全部是、全部是L型型B、全部是、全部是D型型C、部分是、部分是L型，型，部分是部分是D型型D、除甘氨酸外都是、除甘氨酸外都是L型型本讲稿第二十三页，共二十七页9、在生理、在生理pH情况下，下列氨基酸中哪个带净负电荷？（情况下，下列氨基酸中哪个带净负电荷？（）A、ProB、LysC、HisD、Glu10、天然蛋白质中不存在的氨基酸是（、天然蛋白质中不存在的氨基酸是（）A、半胱氨酸、半胱氨酸B、瓜氨酸、瓜氨酸C、丝氨酸、丝氨酸D、蛋氨酸、蛋氨酸11、破坏、破坏螺旋结构的氨基酸残基之一是：（螺旋

18、结构的氨基酸残基之一是：（）A、亮氨酸、亮氨酸B、丙氨酸、丙氨酸C、脯氨酸、脯氨酸D、谷氨酸、谷氨酸12、当蛋白质处于等电点时，可使蛋白质分子的（、当蛋白质处于等电点时，可使蛋白质分子的（）A、稳定性增加、稳定性增加B、表面净电荷不变、表面净电荷不变C、表面净电荷增、表面净电荷增加加D、溶解度最小、溶解度最小13、蛋白质分子中、蛋白质分子中-S-S-断裂的方法是（断裂的方法是（）A、加尿素、加尿素B、透析法、透析法C、加过甲酸、加过甲酸D、加重金属盐、加重金属盐本讲稿第二十四页，共二十七页1、一氨基一羧基氨基酸的、一氨基一羧基氨基酸的pI为中性，因为为中性，因为-COOH和和-NH3+的解的解

19、离度相等。（离度相等。（）2、构型的改变必须有旧的共价健的破坏和新的共价键的形成，、构型的改变必须有旧的共价健的破坏和新的共价键的形成，而构象的改变则不发生此变化。（而构象的改变则不发生此变化。（）3、生物体内只有蛋白质才含有氨基酸。（、生物体内只有蛋白质才含有氨基酸。（）4、所有的蛋白质都具有一、二、三、四级结构。（、所有的蛋白质都具有一、二、三、四级结构。（）5、用羧肽酶、用羧肽酶A水解一个肽，发现释放最快的是水解一个肽，发现释放最快的是Leu，其次是，其次是Gly，据此可断定，此肽的，据此可断定，此肽的C端序列是端序列是Gly-Leu。（。（）6、蛋白质分子中个别氨基酸的取代未必会引起蛋

20、白质活性的改、蛋白质分子中个别氨基酸的取代未必会引起蛋白质活性的改变。变。（）7、镰刀型红细胞贫血病是一种先天遗传性的分子病，其病因是、镰刀型红细胞贫血病是一种先天遗传性的分子病，其病因是由于正常血红蛋白分子中的一个谷氨酸残基被缬氨酸残基所置由于正常血红蛋白分子中的一个谷氨酸残基被缬氨酸残基所置换。换。（）本讲稿第二十五页，共二十七页8、镰刀型红细胞贫血病是一种先天性遗传病，其病因是由于、镰刀型红细胞贫血病是一种先天性遗传病，其病因是由于血红蛋白的代谢发生障碍。（血红蛋白的代谢发生障碍。（）9、在蛋白质和多肽中，只有一种连接氨基酸残基的共价键，、在蛋白质和多肽中，只有一种连接氨基酸残基的共价键

21、，即肽键。（即肽键。（）10、从热力学上讲蛋白质分子最稳定的构象是自由能最低时的、从热力学上讲蛋白质分子最稳定的构象是自由能最低时的构象。（构象。（）11、天然氨基酸都有一个不对称、天然氨基酸都有一个不对称-碳原子。（碳原子。（）12、变性后的蛋白质其分子量也发生改变。（、变性后的蛋白质其分子量也发生改变。（）13、蛋白质在等电点时净电荷为零，溶解度最小。（、蛋白质在等电点时净电荷为零，溶解度最小。（）本讲稿第二十六页，共二十七页1、试比较较、试比较较Gly、Pro与其它常见氨基酸结构的异同，它们对与其它常见氨基酸结构的异同，它们对多肽链二级结构的形成有何影响？多肽链二级结构的形成有何影响？2

22、、为什么说蛋白质水溶液是一种稳定的亲水胶体？、为什么说蛋白质水溶液是一种稳定的亲水胶体？3、试举例说明蛋白质结构与功能的关系（包括一级结构、高级、试举例说明蛋白质结构与功能的关系（包括一级结构、高级结构与功能的关系）。结构与功能的关系）。4、聚赖氨酸（、聚赖氨酸（polyLys）在）在pH7时呈无规则线团，在时呈无规则线团，在pH10时时则呈则呈-螺旋；聚谷氨酸（螺旋；聚谷氨酸（polyGlu）在）在pH7时呈无规则线团，时呈无规则线团，在在pH3时则呈时则呈-螺旋，为什么？螺旋，为什么？5、已知某蛋白质的多肽链的一些节段是、已知某蛋白质的多肽链的一些节段是a-螺旋，而另一些节螺旋，而另一些节段是段是-折叠。该蛋白质的分子量为折叠。该蛋白质的分子量为240000，其分子长，其分子长5.0610-5厘米厘米,求分子中求分子中a-螺旋和螺旋和-折叠的百分率。折叠的百分率。(蛋白蛋白质中一个氨基酸的平均分子量为质中一个氨基酸的平均分子量为120,每个氨基酸残基在每个氨基酸残基在a-螺螺旋中的长度旋中的长度0.15nm，在，在-折叠中的长度为折叠中的长度为0.35nm)。本讲稿第二十七页，共二十七页