微生物与制药幻灯片.ppt

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1、微生物与制药第1页，共31页，编辑于2022年，星期六药物的抗菌试验药物的体外抗菌试验包括用于区别药物是抑菌或杀药物的体外抗菌试验包括用于区别药物是抑菌或杀菌药物的菌药物的抑菌试验抑菌试验；测定药物杀菌活性的测定药物杀菌活性的杀菌试验杀菌试验；以及检查两种药物联；以及检查两种药物联合作用的合作用的联合抗菌试验联合抗菌试验等。等。一般抑菌药物只能抑制微生物生长，不能杀死微生物，一般抑菌药物只能抑制微生物生长，不能杀死微生物，抑菌药物被除去，微生物又可以恢复继续生长。杀菌药物抑菌药物被除去，微生物又可以恢复继续生长。杀菌药物能杀死微生物，杀菌药物除去后，微生物仍然不能生长。能杀死微生物，杀菌药物除

2、去后，微生物仍然不能生长。第2页，共31页，编辑于2022年，星期六药物的抑菌作用或杀菌作用是在一定条件下相对而言的。药物的抑菌作用或杀菌作用是在一定条件下相对而言的。在我们检测时，药物的作用受到用药时培养基的组成、温度、PH值及所用的菌种、菌量等各个因素有关。虽然说体外抗菌试验有很多优点，但是由于体外抗菌试验没有复杂的体内因素影响，因此药物体外抗菌试体外抗菌试验和体内抗菌验和体内抗菌试验可能会出现不一致的结果。所以，一般我们在体外体外对药物进行测试后，有效的药再要进行体内试验，如果体内试验再次证实此药有效的话，才能推荐应用到临床。第3页，共31页，编辑于2022年，星期六第一节第一节 药物的

3、体外抑菌试验药物的体外抑菌试验一、药物的体外抑菌试验一、药物的体外抑菌试验（一）体外抑菌试验（一）体外抑菌试验药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法，其中最常用的方法用系列稀释法和琼脂扩散法。第4页，共31页，编辑于2022年，星期六o 稀释法稀释法 稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种。稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种。这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MICMIC）：是指该药物）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用能抑制细菌生长的最低浓度，通常用gmlgml或或U/mlU/ml表示。表示。具

4、体的液体培养基连续稀释法见书本，固体培养基连续稀释法，又可具体的液体培养基连续稀释法见书本，固体培养基连续稀释法，又可分为分为平板法平板法和和斜面法。斜面法。第5页，共31页，编辑于2022年，星期六2.2.琼脂扩散法琼脂扩散法 利用药物在琼脂培养基中扩散，并在一定浓度范围内抑制细菌生长的原利用药物在琼脂培养基中扩散，并在一定浓度范围内抑制细菌生长的原理进行的。一般用于细菌和酵母菌的药敏试验理进行的。一般用于细菌和酵母菌的药敏试验。1.滤纸片法（纸碟法）滤纸片法（纸碟法）滤纸片法是最常用的方法，适用于新药的初筛试验（初步药物是否有抗菌作用）及临床的药敏试验（细菌药物第三性试验、以便选择用药）。

5、滤纸片分湿、干湿、干两种，可以在试验时用无菌纸片沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也以预先做成一定浓度的干燥纸片。一般来说预先做成的干燥纸片实用一些而且准确一些。第6页，共31页，编辑于2022年，星期六干燥纸片的制备方法干燥纸片的制备方法：选用吸水力强而且质地均匀的滤纸，用打选用吸水力强而且质地均匀的滤纸，用打洞机制成洞机制成6 6mmmm直径的圆纸片，直径的圆纸片，120120干燥灭菌干燥灭菌2 2小时。然后把配制好的小时。然后把配制好的各种适宜浓度的抗生素溶液，每各种适宜浓度的抗生素溶液，每100100张纸片加入张纸片加入0.50.5mlml药液，使它均匀药液，使它均匀浸润，放在无菌平皿中

6、，浸润，放在无菌平皿中，3737，使它干燥，分装小瓶中，封口，使它干燥，分装小瓶中，封口，44保存保存.一般药敏试验常采用滤纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，一般药敏试验常采用滤纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药。来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药。第7页，共31页，编辑于2022年，星期六世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈大小来判断，比如条件下根据抑菌圈大小来判断，比如：抗生素或化疗药物 抑菌圈直径（mm）耐药 中敏 敏感氯霉素 12 1

7、3-17 18红霉素 13 14-17 18四环素 14 15-18 19卡那霉素 13 14-17 18第8页，共31页，编辑于2022年，星期六2.2.打洞法打洞法 含菌琼脂平板上打洞,所以说微量法适于药物血浓度的监测。优点是微量（血清用量少）敏感，操作简便。除此之外还有管碟法、直接滴加法和挖沟法管碟法、直接滴加法和挖沟法：适用于测试一种药物对几种细菌的抗菌作用。方法是先制备普通琼脂平板，并在平板上挖直沟，在沟内滴加药液，在沟侧接种细菌。经过培养以后观察加细菌生长的情况。我们可以根据沟和细菌间的抑菌距离的长短，来判断该药物对这些细菌的抗菌能力。第9页，共31页，编辑于2022年，星期六(二

8、）、二）、体外体外杀菌试验杀菌试验是用来评价药物对微生物的致死活性的。1.1.最低杀菌浓度（最低杀菌浓度（MBCMBC）（）（最小致死浓度最小致死浓度MLCMLC）的测定按液体培养基稀释法的操作方法测了药物的MIC。然后把未长出菌的各个试管培养液分别移种到无菌平板上，培养后凡是平板上无菌生长的药物最低浓度就是最小致死浓度（MLC）。如果是细菌的话可以称为最小杀菌浓度（MBC）。第10页，共31页，编辑于2022年，星期六2.活菌计数法活菌计数法将定量的试验菌加入到一定浓度的定量药物中，作用一定时间后，取样进行活菌数计数，从存活的微生物数量计算出药物对试验菌的致死率，从而判断药物的杀菌能力。活菌

9、计数一般是活菌计数一般是将定量的药物与试验菌作用后混合液稀释后，混入琼脂培养基做成平板，培养后数平板上形成的菌落数，由于一个菌落是由一个细菌繁殖而来的，所以可以用菌数乘以稀释倍数，计算出混合液中存活的细菌数。或者也可以用微孔滤膜过滤药物与试验菌的混合液，洗净药液，将滤膜放在平板上培养后数菌落数（CFU)。第11页，共31页，编辑于2022年，星期六3.酚系数测定（石炭酸系数测定）酚系数测定（石炭酸系数测定）酚系数是以酚为标准，将待测的化学消毒剂与杀菌效力相比较化学消毒剂与杀菌效力相比较，所得的就是杀菌效力的比值。苯酚系数=消毒剂的杀菌稀释度/苯酚的杀菌稀释度（苯酚系数大于2或等于2才合格）由于

10、各种化学消毒剂杀菌原理各不相同，因而这种方法仅仅适用于酚类消毒剂杀菌效力的测定。具体的测定方法:是分别将酚及待测化学消毒剂按不同比例稀释，各取5ml放到试管中，再加入经24小时培养后的菌悬液各0.5ml，混匀后放入 20水浴中，5、10、15分钟分别取一接种环混合液移种到另一支5 ml的肉汤培养基中，37培养24小时记录生长情况。第12页，共31页，编辑于2022年，星期六（三）、（三）、联合抗菌试验联合抗菌试验1 1、联合抗菌试验主要用于测定两种抗菌药物联合应用时的相互影响。、联合抗菌试验主要用于测定两种抗菌药物联合应用时的相互影响。无关无关作用小，两种药物联合作用的活性作用小，两种药物联合

11、作用的活性等于其单独活性；等于其单独活性；拮抗拮抗作用，两种药物联合作用显著低于作用，两种药物联合作用显著低于单独抗菌活性；单独抗菌活性；累加累加作用，两种药物联合作用时的活性作用，两种药物联合作用时的活性等于两种单独抗菌活性之和；等于两种单独抗菌活性之和；协同协同作用，两种药物联合作用显著大于作用，两种药物联合作用显著大于其单独作用的总和。其单独作用的总和。第13页，共31页，编辑于2022年，星期六常用方法常用方法1.1.棋盘格法棋盘格法 棋盘稀释法是常用的定量方法，首先分别测定拟联合的抗菌药物对检测菌棋盘稀释法是常用的定量方法，首先分别测定拟联合的抗菌药物对检测菌的的MICMIC。药物的

12、稀释分别在方阵的纵列和横列进行，这样在每管（孔）中可得到不同浓度药物的稀释分别在方阵的纵列和横列进行，这样在每管（孔）中可得到不同浓度组合的两种药物混合液。组合的两种药物混合液。接种菌量为接种菌量为5105CUF5105CUFmlml，3535孵育孵育18h18h后观察结果。计算后观察结果。计算部分抑菌浓度部分抑菌浓度（FICFIC）指数）指数05为协同作用；为协同作用；0 05 51 1为相加作用；为相加作用；1 12 2为无关作用；为无关作用；2 2为拮抗作用。为拮抗作用。第14页，共31页，编辑于2022年，星期六 棋盘棋盘法的设计法的设计 棋盘棋盘法的主要优点在于甲、乙两药的每个药物浓

13、度都有单独的法的主要优点在于甲、乙两药的每个药物浓度都有单独的和与另一个药物不同浓度的联合，因此能精确测定两种抗菌药和与另一个药物不同浓度的联合，因此能精确测定两种抗菌药物在适当浓度的比例下所产生的相互作用。物在适当浓度的比例下所产生的相互作用。在进行在进行棋盘棋盘法之前应先测定两种抗菌药物单独对受试菌的法之前应先测定两种抗菌药物单独对受试菌的MICMIC，然后以两药然后以两药MICMIC的的8 8倍、倍、4 4倍、倍、2 2倍、倍、1 1倍以及倍以及MICMIC的的1/21/2、1/41/4、1/81/8浓度（或浓度（或4 4倍、倍、2 2倍、倍、1 1倍、倍、1/21/2、1/41/4浓度

14、）分别浓度）分别进行联合。可见举例，如表进行联合。可见举例，如表11的青霉素的青霉素G G与链霉素联合与链霉素联合药敏实验和表药敏实验和表2 2的的TMP+SMZTMP+SMZ的联合作用。的联合作用。第15页，共31页，编辑于2022年，星期六药物及浓度药物及浓度青霉素青霉素G(IUm1)链霉素单药对照链霉素单药对照4210.50.25链霉素链霉素（gml）64-32-16-8-+4-+青霉素青霉素G单药对照单药对照-+细菌对照细菌对照-：无细菌生长无细菌生长+：有细菌生长：有细菌生长FIC指数指数=11+1616=2无关无关第16页，共31页，编辑于2022年，星期六2.纸条试验 在含菌平板

15、上垂直放两条浸有不同药液的滤纸条，培养后观察两药在含菌平板上垂直放两条浸有不同药液的滤纸条，培养后观察两药形成的抑菌区的图形来判断两药联合应用时，是无关、协同还是拮抗作形成的抑菌区的图形来判断两药联合应用时，是无关、协同还是拮抗作用。用。第17页，共31页，编辑于2022年，星期六3.3.纸条梯度平板试验纸条梯度平板试验 将琼脂培养基倒入平皿，平皿斜放凝固后制成斜面培养基。将琼脂培养基倒入平皿，平皿斜放凝固后制成斜面培养基。将平皿放平加入含抗菌药物的琼脂培养基，这样在制成的双层琼将平皿放平加入含抗菌药物的琼脂培养基，这样在制成的双层琼脂平板中含有梯度浓度的抗菌药物。脂平板中含有梯度浓度的抗菌药

16、物。要求其最小抑菌浓度的位置约要求其最小抑菌浓度的位置约处于平板的一半。处于平板的一半。然后将试验菌液均匀涂布在平板表面。取纸条浸然后将试验菌液均匀涂布在平板表面。取纸条浸透另一待检药液，按梯度中药物浓度递减的方向置于平板表面，透另一待检药液，按梯度中药物浓度递减的方向置于平板表面，培养后观察形成的抑菌区的图形以判断两种药物之间的相互作用培养后观察形成的抑菌区的图形以判断两种药物之间的相互作用。第18页，共31页，编辑于2022年，星期六意义意义目的在于：目的在于：治疗混合性感染；治疗混合性感染；预防或推迟细菌抗生素耐预防或推迟细菌抗生素耐 药性的发生；药性的发生；联合用药可以减少剂量以联合用

17、药可以减少剂量以 避免达到毒性剂量；避免达到毒性剂量；联合用药比单一用药时效联合用药比单一用药时效 果更好。果更好。第19页，共31页，编辑于2022年，星期六二、二、药物的体内抗菌试验药物的体内抗菌试验 药物的体内抗菌试验又称为动物实验治疗试验或保护力药物的体内抗菌试验又称为动物实验治疗试验或保护力试验。当抗菌药物进入机体后，其效力的发挥要受体内各种试验。当抗菌药物进入机体后，其效力的发挥要受体内各种因素的影响。因素的影响。如血液及组织内的蛋白质或磷脂、脓汁内的核酸如血液及组织内的蛋白质或磷脂、脓汁内的核酸均与药物结合，降低药物的活性；坏死组织内的酸性环境也能均与药物结合，降低药物的活性；坏

18、死组织内的酸性环境也能影响药物的活性。机体内的微生物，代谢活动较低，对药物的影响药物的活性。机体内的微生物，代谢活动较低，对药物的敏感性降低，有时还可形成细胞壁缺陷型细菌，对某些药物不敏感性降低，有时还可形成细胞壁缺陷型细菌，对某些药物不敏感。机体内各组织中药物的吸收，分布不同，使药物的浓度敏感。机体内各组织中药物的吸收，分布不同，使药物的浓度难以恒定。难以恒定。因此在评定新药的药效时除做体外抗菌试验外还因此在评定新药的药效时除做体外抗菌试验外还需要做体内的抗菌试验。需要做体内的抗菌试验。第20页，共31页，编辑于2022年，星期六三、影响抗菌试验的因素1.1.菌种菌种在抗菌试验中所用到的菌种

19、，必需是国家卫生部生物制品检定所菌各保藏中心专门提供的标准菌株。在特殊情况下，也可以采用临床新分离的并经过鉴定、纯化及合理保藏的菌株。而且我们要用到的试验菌种应该选择是对数期生长对数期生长菌。因为那时菌种生命力最旺盛，这对于我试验测定的结果也会准确些。第21页，共31页，编辑于2022年，星期六1.1.培养基培养基试验所用到的培养基应按各试验菌的营养要求进行配制，严格控制各种原料、成分的质量及培养基的配制过程。要注意当有些药物具有抗代谢作用时，培养应不能存在代谢物，否则抑菌作用将会被消除。培养基内如果含有血清等蛋白质时，有可能与某些抗菌药物结合，使抗菌药物失去，所以就要避免培养基混进这类营养物

20、。第22页，共31页，编辑于2022年，星期六3.3.抗菌药物抗菌药物 药物的物理状态、浓度、稀释方法等都会直接影响抗药物的物理状态、浓度、稀释方法等都会直接影响抗菌试验的结果，必需精确配制。如果是固体药物，必需使菌试验的结果，必需精确配制。如果是固体药物，必需使药物溶解或使药物呈均匀悬液。药物溶解或使药物呈均匀悬液。PHPH值应调至中性，以确保药值应调至中性，以确保药物的稳定性和不影响细菌的生长。中草药因为有颜色和含有鞣质，物的稳定性和不影响细菌的生长。中草药因为有颜色和含有鞣质，结果的判断，应特别注意。结果的判断，应特别注意。第23页，共31页，编辑于2022年，星期六4.对照试验对照试验

21、 为确保试验结果的科学性和准确性，试验时应为确保试验结果的科学性和准确性，试验时应同时进行各种对照试验。同时进行各种对照试验。试验菌对照试验菌对照：在无药情况下，应能在培养基内正常生长。：在无药情况下，应能在培养基内正常生长。溶剂及稀释液对照溶剂及稀释液对照：配制抗菌药物时所用的溶剂及稀释：配制抗菌药物时所用的溶剂及稀释液均应无抗菌作用。液均应无抗菌作用。已知药物对照已知药物对照：应使已知抗菌药物对标准菌株出现抗菌效：应使已知抗菌药物对标准菌株出现抗菌效应应。第24页，共31页，编辑于2022年，星期六复习题：复习题：1.药物体外抑菌试验常用的方法有哪几种？具体的试验操作方法？2.如何测定药物

22、的最小致死浓度？3.联合抗菌试验常用的方法有哪些？4.药物体内抗菌试验的方法？5.抗菌试验的影响因素有哪些？第25页，共31页，编辑于2022年，星期六实验实验 细菌对药物敏感性的实验细菌对药物敏感性的实验（药敏片扩散法）（药敏片扩散法）目的意义：目的意义：目的意义：目的意义：掌握药敏片扩散法进行药敏实验的一般方法掌握药敏片扩散法进行药敏实验的一般方法体会药敏实验在临床用药上的指导意义体会药敏实验在临床用药上的指导意义基本原理：基本原理：基本原理：基本原理：药药敏敏片片是是含含有有抗抗生生素素的的滤滤纸纸片片，将将其其置置于于涂涂满满待待测测菌菌的的固固体体培培养养基基上上，抗抗菌菌药药物物通

23、通过过向向培培养养基基内内扩扩散散，抑抑制制细细菌菌生生长长，从从而而出出现现抑菌环。根据抑菌环的大小可以判定细胞对此药物的敏感度。抑菌环。根据抑菌环的大小可以判定细胞对此药物的敏感度。第26页，共31页，编辑于2022年，星期六器材及试剂器材及试剂器材及试剂器材及试剂:药敏片：含各种抗生素的市售产品药敏片：含各种抗生素的市售产品培培养养基基平平板板：普普通通牛牛肉肉膏膏蛋蛋白白胨胨固固体体培培养养基基，待待检检细菌的培养物。细菌的培养物。眼科镊、无菌棉拭子、酒精灯等。眼科镊、无菌棉拭子、酒精灯等。第27页，共31页，编辑于2022年，星期六实验步骤实验步骤:1 1、用无菌棉拭子沾取小量待测菌

24、液，均匀涂布、用无菌棉拭子沾取小量待测菌液，均匀涂布、用无菌棉拭子沾取小量待测菌液，均匀涂布、用无菌棉拭子沾取小量待测菌液，均匀涂布 平板，待稍干后，平板，待稍干后，平板，待稍干后，平板，待稍干后，用无菌眼科镊将各种药敏用无菌眼科镊将各种药敏用无菌眼科镊将各种药敏用无菌眼科镊将各种药敏 片分别平贴在平板培养基表面，每板片分别平贴在平板培养基表面，每板片分别平贴在平板培养基表面，每板片分别平贴在平板培养基表面，每板4-64-6个，个，个，个，相互间应有一定距离（相互间应有一定距离（相互间应有一定距离（相互间应有一定距离（15mm15mm）。）。）。）。2 2、置、置、置、置3737 ，培养，培养

25、，培养，培养8-12h8-12h，观察结果。，观察结果。，观察结果。，观察结果。3 3、结果判定：观察有无抑菌圈、结果判定：观察有无抑菌圈、结果判定：观察有无抑菌圈、结果判定：观察有无抑菌圈 及测量其直径，按下表判定及测量其直径，按下表判定及测量其直径，按下表判定及测量其直径，按下表判定 对药物的敏感性。对药物的敏感性。对药物的敏感性。对药物的敏感性。第28页，共31页，编辑于2022年，星期六 中国药典中国药典20002000版二部微生物限度标准版二部微生物限度标准(单位：个单位：个/g/g或个或个/ml)/ml)编号编号剂型剂型细菌数细菌数霉菌霉菌、酵母菌数酵母菌数大肠大肠杆菌杆菌金黄色金

26、黄色葡萄球葡萄球菌菌铜绿假铜绿假单胞菌单胞菌1 1片剂片剂10001000100100-2 2酊剂酊剂100100100100-3 3胶囊剂胶囊剂10001000100100-4 4软膏剂软膏剂100100100100-5 5一般眼膏剂一般眼膏剂100100-6 6一般滴眼剂一般滴眼剂100100-7 7丸剂丸剂(滴丸、滴丸、糖丸等糖丸等)10001000100100-8 8气雾剂气雾剂1001001010-9 9糖浆剂糖浆剂100100100100-第29页，共31页，编辑于2022年，星期六活螨的检验活螨的检验o用于口服、创伤、粘膜和腔道的药品均不得检出活螨o直接观察法直接观察法o漂浮法漂浮法o分离法分离法第30页，共31页，编辑于2022年，星期六作业作业1.现有青霉素、磺胺嘧啶钠注射液，如何分别对这两种药物进行无菌检查？2.有一中药丸剂（银翘解毒丸），如何进行该药的微生物学检查？第31页，共31页，编辑于2022年，星期六