白酒酿造微生物分析及东方伊萨酵母发酵特性研究.doc

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1、,武汉工业学院硕 士 学 位 论 文白云边酒酿造微生物分析及东方伊萨酵母发酵特性研究Brewing Microbes Analyzing and Fermentation Study Of Issatchenkia Orientalis in Baiyunbian Liquor2011年5月分类号 密 级 U D C 学校代码 10496 武汉工业学院硕 士 学 位 论 文白云边酒酿造微生物分析及东方伊萨酵母发酵特性研究Brewing Microbes Analyzing and Fermentation Study Of Issatchenkia Orientalis in Baiyunbi

2、an Liquor论文作者 刘婷婷 指导教师 缪礼鸿教授 学科专业 微生物与生化药学 论文提交日期 论文答辩日期 答辩委员会主席 评阅人 2011年5月,论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 武汉工业学院 或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人或集体均已在文中作了明确的说明并表示谢意。本人完全意识到本声明的法律责任和法律后果由本人承担。论文作者签名：签字日期： 年 月 日论文版权使用授权书本学位论文作者

3、完全了解 武汉工业学院 有关保留、使用学位论文的规定，特授权 武汉工业学院 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编，以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复本和电子文件。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）论文作者签名： 导师签名：签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日摘 要本实验从大曲和原料小麦中分离获得5株有明显差异的细菌和霉菌纯培养物，分别命名为WB-1，WB-2，WP-1，ZP-1和ZP-2。其中细菌WB-1和WB-2与芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens 和Bacillus s

4、ubtilis 菌株的16S rDNA相似性分别达到99%和100%；另外三株霉菌WP-1，ZP-1和ZP-2与壮观拟青霉Paecilomyces spectabilis，伞枝犁头霉Absidia corymbifera和微小根毛霉Rhizomucor pusillus菌株的18S rDNA序列相似性分别达到99%，100%和88%。从中国传统白酒白云边酒的发酵堆积料和出池酒醅中分离得到了七株典型酵母菌，依次命名为Z1，Z2，Z3，Z4，BYB-2，BYB-3和FJ5，分别对其进行分子鉴定，结果显示，其中四株酵母菌Z1，Z2，Z3和FJ5均属于东方伊萨酵母属（Issatchenkia orie

5、ntalis）；酵母菌Z4属于假丝酵母属（Candida tropicalis）；酵母菌BYB-2属于酿酒酵母属（Saccharomyces cerevisiae）；酵母菌BYB-3属于毕赤酵母属（Pichia galeiformis或Pichia manshurica）鉴定结果显示，在白云边酒发酵堆积料和出池酒醅中东方伊萨酵母较占优势，高温大曲和小麦原料中的主要真菌和细菌种类基本相同，而白云边酒中温曲中的主要优势真菌和细菌与高温大曲明显不同；白云边酒高温曲中的优势霉菌为壮观拟青霉，未分离和检测到高温霉菌。对从白云边分离到的七株酵母菌分别进行耐高温能力和耐酒精能力的检测后发现东方伊萨酵母Z1的

6、综合能力最好，两方面能力均优于东方伊萨酵母标准菌株Cbs5147。对7株酵母菌进行的酒精发酵实验结果显示东方伊萨酵母Z1的产乙酸乙酯能力很高，达到229.0647.83（mg/L），优于其它酵母菌；在其与酿酒酵母XG-1的混合酒精发酵中，仍然能保持较高的乙酸乙酯产量，且不影响酒精产量；在利用不同原料进行的的酒精发酵实验中综合纯种发酵和混合发酵的发酵结果可以发现以高粱为发酵原料发酵效果最好。关键词：白云边酒醅，大曲，小麦，酵母菌，细菌，霉菌，分子鉴定，酒精发酵ABSTRACTIn this study，7 yeast strains were isolated from fermenting p

7、acking materials and fermented grains of Baiyunbian Liquor，and were named as Z1，Z2，Z3，Z4，FJ5，BYB-2 and BYB-3 separatelyThen five distinct strains were isolated from the wheat，high temperature daqu，and medium temperature starter supplied by Baiyunbian Liquor，using Rose Bengal Medium，Beef extract-pept

8、one medium and Koji extract medium and also were named as WB-1，WB-2，WP-1，ZP-1 and ZP-2. The 16 S rDNA，18S rDNA and 26 S rDNA sequences of the strains were obtained by PCR amplification and were subjected to homology search and identifiedThe 4 following yeast strains Z1，Z2，Z3 and FJ5 were all belonge

9、d to Issatchenkia orientalisThe 3 rest yeast strains Z4，BYB-2 and BYB-3 were belonged to Candida tropicalis，Saccharomyces cerevisiae and Pichia galeiformis or Pichia manshurica respectivelyThe strains WB-1 and WB-2 were shown to be 99% and 100% phylogenetically similar to the type strains of Bacillu

10、s amyloliquefaciens and Bacillus subtils, respectivelyStrain ZB-1 were showed to be 88% phylogenetically similar to the type strains Methylobacillus sp. or Methylophilus sp. The strains WP-1，ZP-1 and ZP-2 were shown to be 99%，100% and 88% phylogenetically similar to the type strains of Paecilomyces

11、spectabilis，Absidia corymbifera and Rhizomucor pusillus， respectively The results showed that，the main type of yeasts of fermenting packing materials and fermented grains is Issatchenkia orientalis；the main types of fungi and bacteria in the material wheat are basically similar with high temperature

12、 daqu，while the medium temperature starter are quite different from itThe advantage fungi in Baiyunbian high temperature daqu is Paecilomyces spectabilis，and no high temperature fungi was foundAccording to this study，Issatchenkia orientalis Z1 is proved to be the best strain during the Alcohol toler

13、ance，heat-resisting ability and fermentation studyIt has a good ability at acetate ethyl producing，and in mixed fermentations it also keeps a high acetate ethyl production，while having no negative influence on ethanol producing Keywords: Baiyunbian Liquor，Yeast，Fungi，Bacteria，Wheat，Daqu，Fermented gr

14、ains，Molecular analysis目 录第1章 绪 论11.1 酒曲的介绍11.2 中国传统白酒微生物的研究进展21.3 白酒中香味物质及相关酵母菌的研究进展31.3.1 白酒的香味成分31.3.2白酒中酯类成分及产酯酵母菌属的研究41.3.3DNA序列分析技术和酒类相关酵母菌多样性研究进展71.3.4白酒香味成分的分析技术研究进展91.4 本课题主要研究内容及意义101.4.1 研究内容101.4.2 研究意义11第章 材料与方法122.1 实验材料122.1.1 样品来源122.1.2菌株来源122.1.3 主要试剂132.1.4 培养基142.2 实验方法152.2.1 白云

15、边酒制曲及发酵工艺152.2.2 白云边酒酿造微生物菌种分离方法152.2.3 酵母菌总数计数方法162.2.4 不同酵母菌混合培养各菌株的活菌数的测定方法162.2.5 酵母菌细胞形态观察162.2.6 淀粉含量测定方法162.2.7 酒精发酵液理化指标测定172.2.8 不同酒精含量培养基配制方法172.2.9 酵母菌对糖的利用实验方法182.2.10 DNA的提取182.2.11 提取DNA的PCR扩增和分子测序182.2.12 构建微生物系统发育树192.4.13 酵母菌耐高温能力测定方法192.2.14 酵母菌耐酒精能力测定方法192.2.15 酵母及混合菌株液态酒精发酵方法192.

16、2.16 气相色谱分析方法202.2.17 实验室制备生香活性干酵母的实际应用方法21第3章 结果与讨论223.1 白云边酒大曲和小麦原料中优势细菌和霉菌的分离鉴定223.1.1大曲和小麦中优势菌株的分离及形态观察结果223.1.2 在不同原料中分离的细菌和霉菌数量测定比较结果253.1.3 优势细菌和霉菌的分子鉴定结果263.1.4 讨论283.2白云边酒酵母菌株的分离鉴定结果293.2.1 7株酵母菌的基本形态和糖类利用结果293.2.2 7株酵母菌的酒精发酵实验结果313.2.3 白云边酒酵母菌的分子鉴定结果323.2.4 讨论343.3 白云边酒酵母菌耐高温耐酒精能力实验结果353.3

17、.1 酵母菌耐高温能力实验结果353.3.2 酵母菌耐酒精能力实验结果363.3.3 结论393.4 白云边酒酿造酵母菌的酒精发酵及气相色谱分析结果393.4.1 分离酵母菌株的酒精发酵及代谢产物分析393.4.2 东方伊萨酵母菌与酿酒酵母菌在不同比例下混合发酵结果423.4.3不同原料对东方伊萨酵母纯种和混合菌种发酵结果的影响453.4.4 酵母菌与芽孢杆菌的混合发酵结果463.4.5 讨论483.5 生香活性干酵母的制备及发酵结果分析513.5.1 生香酵母耐高温及耐酒精能力的测定比较结果513.5.2 酵母菌Z1和XG-1混合酒精发酵与生香酵母的对照实验533.5.3 讨论55第4章 总

18、 结56参考文献58致 谢64附录A65硕士攻读期间研究成果75符号缩写说明缩写英文全称中文全称GCGas Chromatography气相色谱PCRPolymerase Chain Reaction聚合酶链式反应bpBasepair(s)碱基DNS3,5-Dinitrosalicylic Acid3,5-二硝基水杨酸试剂MRSMRS Ager Base乳酸菌分离培养基PDAPotato Destrose Ager马铃薯培养基YPD Yeast Extract Peptone Dextrose 酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基ODOptical density value吸光度rpmRound per

19、 minute每分钟转速h/minhour/minute小时/分钟,第1章 绪 论白酒是中国传统的蒸馏酒，为世界七大蒸馏酒之一。中国的白酒是利用高粱等粮食为原料进行发酵的，这跟亚洲其它国家，如越南白酒的生产类似1。中国白酒酿造历史悠久，工艺精湛，品种繁多，香型各异。以酱香、清香和浓香三大香型白酒为主，成为全国人民的当家酒，在中国政治、经济、文化和外交等各个领域都发挥着积极的作用。其传统工艺和优秀酒文化应继承、发扬和开发，以建设祖国的酿酒事业。1979年，全国第三届白酒评酒会评比的酒样分别为酱香、清香、浓香、米香和其他香，成为我国五大香型，又称五类型。后来其他香又发展为芝麻香、兼香、凤型、豉香和

20、特型，构成了全国十大香型2。白酒酿造实际上是微生物生长、代谢的过程。因此，要弄清白酒的发酵本质及其相关风味物质产生的机理，就必须从微生物着手来进行研究。白酒微生物指白酒生产过程中以及生产环境中的微生物的总称，包括自然接种的天然微生物和人工选育的纯种微生物。白酒生产过程中出现的微生物既包括糖化菌、发酵菌等有益微生物，也包括导致苦味和酸败的有害菌3。20世纪80年代至今，白酒微生物的研究进入了高潮，各酒厂、科研机构和学校纷纷对白酒微生物进行研究。1.1 酒曲的介绍酒曲是白酒发酵中重要的因素。日本东京大学名誉教授坂口谨一郎认为中国创造酒曲，可以与中国的四大发明相媲美。自建国以来，我国的科研工作者一直

21、没有停止过对白酒大曲的认识和对大曲微生物区系的研究分析。廖建民4等在前人对霉菌和酵母研究的基础上，对大曲中的细菌菌系进行了详细研究，指出曲药中的细菌主要是数量和种类均较多的芽孢杆菌，而无芽孢杆菌和球菌的数量相对较少；无芽孢杆菌主要是醋酸杆菌和乳酸杆菌，而球菌种类比较单一，主要是乳球菌类。,1.2 中国传统白酒微生物的研究进展目前中国传统白酒中最具代表性的酱香型白酒茅台酒的微生物区系及其香味成分已经有了较详细的研究分析5。其中，贵州轻工科研所在1975年就开始对茅台酒酿造微生物进行了研究，经观察与分离发现茅台酒制曲酿酒中的微生物种类繁多，相当复杂。常见的有细菌、根霉、毛霉、念珠霉、曲霉和酵母等。

22、制曲过程中的微生物主要来源于曲母，以细菌最多，念珠霉次之，酵母、根霉和毛霉等较少。酿酒车间的微生物则以酵母和细菌最多，霉菌次之，因取样季节等因素不同而异，后来分离并鉴定了17种芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌)，其中有5株能产生黑色素，这些菌株培养在碎麦粉中，也生成了像茅台酒曲的香味。在茅台酒醅中发现了酒精发酵力比较强的卡尔斯伯酵母、酿酒酵母，产生香气的白地霉、假丝酵母，还有栗酒裂殖酵母、球拟酵母、毕氏酵母，甚至还有掷孢酵母等。茅台酒曲中也分离出了各种霉菌，如曲霉、根霉、毛霉和青霉等，甚至还有很难生长的红曲霉。这些霉菌大多在曲子表面繁殖，并生成孢子，耐高温高湿的孢子才能幸存下来。此外还发现了一株与金色嗜

23、热子囊菌类似的菌株，通过各种调查研究，最终确认茅台酒曲是一种细菌曲，认为以前少见，从此得到共识6。 作为浓香型白酒代表的泸州老窖也跟进了微生物区系的研究。泸州老窖有着悠久的历史，其大曲酒沿用传统的续碴法，以老窖、万年糟和酒质为基础，说明三者与产品质量的重要关系。对试验的老窖进行总结，发现其中4口窖池建于明朝年间，连续使用至今已约有400余年的历史。1996年11月，经国务院审查批准，以国发(1996)17号文件确定其为全国重点文物，称为“中国第一窖”。1995年，该400年的老窖，被载入吉尼斯世界纪录，成为世界酿造史上的奇迹。从老窖粮糟的蒸酒试验中发现，老窖的酒质以下层优于中层，中层又优于上层

24、，而且窖边又优于中间部位，这足以证明泸型曲酒的香味与窖泥分不开，老窖被认为是优质酒的命根子，也为浓香型白酒发展提供依据。老窖的窖泥为酸性，氨态氮、腐殖质和有效磷高出其它窖1O倍左右，这是窖泥微生物长年累月栖息和母糟黄水作用下的结果。而从微生物检测结果可以看出，老窖和新窖窖泥微生物数量和类群有着明显差异，这充分说明了浓香型白酒的老窖是嫌气微生物，尤其是嫌气芽孢杆菌的主要栖息地，这是泸州老窖窖泥的独特微生物学特征。从老窖泥中分离出的梭状芽孢杆菌，又称己酸菌，可培养窖泥建新窖或着改造老窖，在短期内就可生产优质酒，打破了过去非50年老窖不能生产名酒的说法7。中国清香型白酒代表汾酒也在微生物区系方面进行

25、了一定程度的研究。汾酒大曲一直以来都是利用自然界微生物(自然接种)，让其生产繁殖而制成的，依照制曲所在地区环境的不同而稍有差异。从伏曲生产写实中可以发现，微生物主要来源于曲房中空气、制曲用工具、大麦、豌豆原料和谷糠、芦苇等辅料。初步观察证明，霉菌是由曲房空气以及谷糠、芦苇和席片等辅助材料中接入的，主要有梨头霉、根霉、黄米曲霉、拟内孢霉等，拟内孢霉是曲坯“上霉”的主要微生物；酵母和细菌则是由制曲原料，即粉碎的豌豆和大麦带来的，其中以酵母为主；曲房空气中，除芽孢杆菌外，其它细菌通常很少。汾酒大曲和酒醅中分离出的典型菌株，经初步鉴定已确认的有20个属31个种，其中酵母菌7个属，霉菌5个属，细菌8个属

26、，共计274株，这些菌株都是汾酒生产的宝贵财富8。此外还有其它白酒都开始对微生物进行相关的研究，如施安辉9等对白酒酒徐坊大曲的微生物区系进行了系统的调查，初步弄清了微生物的构成情况，认为中温大曲和中高温大曲的微生物区系的构成存在明显差异。1.3 白酒中香味物质及相关酵母菌的研究进展1.3.1 白酒的香味成分白酒的主要成分为乙醇和水，占总量的98%-99%左右，而溶于其中的酸、酯、醇、醛等种类众多的微量有机化合物仅为总量的1%-2%，这些微量成分作为白酒的呈香呈味物质，决定着白酒的风格和质量。目前在国际上，酒类芳香成分的分析技术不断进步，研究成果巨大，啤酒、葡萄酒和蒸馏酒等酒类的芳香成分种类已发

27、现超过1000 种10。白酒种类较多，风味各异。作为白酒风味质量的关键因素，各种白酒中香味成分的种类和作用也各不相同11。至1998年，白酒中香味成分已检出342种，其中定量检出180种以上3。白酒香味成分种类有醇类、酯类、酸类、醛酮类化合物、缩醛类、芳香族化合物、含氮化合物和呋喃化合物等12。醇类成分中除乙醇外，最主要的是异戊醇、异丁醇和正丙醇，在浓香型和酱香型白酒中还含有一定量的正丁醇，是醇甜和助香剂的主要物质来源，对形成酒的风味及促使酒体丰满、浓厚起着重要的作用；醇类也是酯类产生的前驱物质，酯类是具有芳香的化合物，在各种香型白酒中起着重要作用，是形成酒体香气浓郁的主要因素，其中己酸乙酯、

28、乳酸乙酯和乙酸乙酯是白酒的重要香味成分；白酒中的酸类主要是乳酸、乙酸、丁酸和己酸等有机酸类，它们影响白酒的口感和后味，是影响口味的主要因素，酸不足则会造成后味寡淡；醛酮类化合物则包括乙醛、2,3-丁二酮和3-羟基丁酮等；缩醛类以乙缩醛含量最多。4-乙基愈创木酚、苯甲醛、香草醛和酪醇等芳香族化合物是影响酱香型白酒香味的重要组成成分；-苯乙醇在豉香型白酒中的含量最高，在米香型酒中次之；含氮化合物主要是四甲基吡嗪、三甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪；呋喃化合物中以呋喃甲醛较为突出，是酱香型白酒的特征成分之一11。1.3.2 白酒中酯类成分及产酯酵母菌属的研究目前国内外对酿酒酵母属的酵母菌有较多的研究。此

29、类酵母菌的主要特征是具有很强的产酒精能力。而白酒发酵过程中酯的产生量则与特殊的非酿酒酵母菌种类有密切关系。乙酸乙酯的产生量高低被普遍认为是依赖于酯的合成（通过乙酰转移酶）和酯的水解（通过酯水解酶）之间的平衡，而包括乙酸乙酯在内的众多酯类一直被认为是决定葡萄酒和白酒等酒精饮料品质的重要因素13-15。发酵后产生的不同香味例如果香和花香等，通常也都是各种酯类混合的结果14, 16- 19。中国传统名优白酒风格的不同，也是由于它们所含酯类的种类（包括乙酸乙酯、己酸乙酯和乳酸乙酯等）、含量和相互之间的配比不同所形成的。目前国内外已经对此类产酯酵母进行了大量相关的研究。Virginia等20研究了11株

30、从葡萄及葡萄酒中分离的酵母菌，其中包括假丝酵母属（Candida），汉逊酵母属（Hanseniaspora），美奇酵母属（Metschnikowia），毕赤酵母属（Pichia），裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）和接合酵母属（Zygosacharomyces）的酵母菌和2株酿酒酵母菌。发现产乙酸乙酯能力强的为Hanseniaspora和Pichia两个属的酵母。研究发现乙酸乙酯产量与酵母菌种和发酵条件（氧气）有关。在对西班牙某地区三种红葡萄中不同酵母菌种类的研究中则发现大部分的菌株属于产酯酵母，其中克鲁维氏酵母（Kluyveromyces thermotolerans）,

31、汉逊酵母（H. guilliermondii, H. uvarum）和东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）又占了很大一部分21。坦桑尼亚一种名为togwa的玉米粥中则发现了东方伊萨酵母（I. orientalis）, 毕赤酵母（ P. anomala）,酿酒酵母（S. cerevisiae）, 克鲁维氏酵母（ K. marxianus） 和假丝酵母（ C. glabrata）这几种酵母菌属，这几种酵母菌都对togwa的感官品质有一定的贡献22。在对乌干达的一种粥的微生物体系研究中也分离得到了发挥作用的多种优势酵母，其中包括东方伊萨酵母（I. orientalis），这

32、些酵母分别对该种食品的发酵和成熟都有重要的作用23。尽管利用酿酒酵母进行纯种发酵能够比较容易的控制发酵过程，并能保持不被污染，一些研究仍然指出特定地区独有的酵母菌对该地区的酒的特征有着极其重要的影响24, 25，并且提出可以利用这些非酿酒酵母菌与酿酒酵母共同进行发酵来提高酒的感官品质26, 27。在酒类发酵中，Kloeckera, Hansensiaspora, Candida, 和 Pichia, 包括 P. anomala这些种属的酵母菌在发酵前期生长迅速，但是在主发酵时期酿酒酵母发挥作用时这些酵母菌便开始衰亡28，这些产酯酵母被认为是各种挥发性成分的高产菌株29- 32。到目前为止已经有

33、研究尝试模仿自然酒精发酵不同酵母菌的初始比例进行混合发酵的实验24, 33, 34。汉逊酵母（Hguilliermondii）和毕赤酵母（Panomala）与酿酒酵母混合发酵葡萄酒的研究显示酒中的乙酸乙酯等风味物质含量明显增加，混合培养对非酿酒酵母产乙酸乙酯的能力没有影响35，东方伊萨酵母和酿酒酵母混合发酵葡萄酒则能减少苹果酸的产量36。Virginia 等37选择2株产乙酸乙酯能力强的非酿酒酵母H. guilliermondii 11104 和Panomala 10590与酿酒酵母混合发酵葡萄酒，结果混合培养条件下，葡萄酒中乙酸乙酯及异戊酯、2-苯乙基酯等风味物质含量显著增加，混合培养对非酿

34、酒酵母产乙酸乙酯的能力没有影响。但国内外文献均未见关于东方伊萨酵母产乙酸乙酯的研究报道。生香酵母是白酒和黄酒发酵产香的重要菌种，在实际生产中有重要的意义。从全国白酒产量较大的浓香型和清香型来说，前者以己酸乙酯为主的复合香，是在梭状芽孢杆菌(俗称己酸菌)的作用下，产于泥质发酵老窖或人工培养泥窖中，发酵周期长，这是浓香型白酒普遍推广的有效经验；后者以乙酸乙酯为主体香，在小曲、麸曲或液态法白酒中添加生香酵母，使发酵过程中生成乙酸及其乙酯，这是提高白酒质量的好措施38。吴衍庸39在“论提高泸型酒质量的三大微生物技术”一文中指出，“己酸菌、甲烷菌二元发酵，酯化酶生香，生香功能曲”这3项微生物技术是提高泸

35、型酒质量的有效技术。生产高酯液可人为控制，摆脱了传统工艺的束缚，获得高酯调酒液，并可根据反应基质的不同而合成所需要的酯类。香酯液可广泛应用于传统固态白酒提升档次，结合在新型白酒上的应用可使酒质更接近固态白酒风格。董家武40采用安琪耐高温酒精活性干酵母(TH-AADY)、生香活性干酵母（ADY）与糖化酶进行减曲，提高了3%的出酒率，并改善了酒质。邓皖玉等41利用生物培养液和翻窖技术提高浓香型白酒优质品率。该技术可使酒质得到大幅度提升，同时又能保持较高的出酒率，做到了产质兼顾，具有生产周期短（仅为传统的双轮底生产的一半时间），优质品率可达到90 %以上，优质酒档次显著提升等特点。熊子书42总结了我

36、国50多年来对不同酒类酵母筛选与应用的研究成果，并通过大量翔实的数据详尽地阐释了酒类酵母不同的特性与作用，推出优良菌种，以达到优质高产、节约粮食之目的。酒类酵母分为酒精酵母、生香酵母、威士忌酵母。酒精酵母又分为小曲酒酵母、大曲酒酵母、小麦酒精酵母、甘蔗酒精酵母。四川小曲酒酵母以纳溪109号酵母较优良，黄酒126号酵母次之；大曲酒酵母以1308号较优，AS2.399次之；小麦酒精酵母以1308号酒精酵母较优；甘蔗酒精酵母则以川102号较优。庄名扬等43以酱香型白酒高温堆积糟醅为含菌样品，经分离得多株耐温、耐酸酵母菌株，对它们的发酵力、产香特征及次生代谢产物分析测定，确认Yl、Y5-l、Y5-2、

37、Y6-l为主要功能菌。通过形态特征、生理生化特征的测定，它们分别归属于酵母属中的意大利酵母、地生酵母、酿酒酵母、间型假丝酵母。徐军等44对大曲中酵母菌进行分离纯化，共得到8株酵母菌。从形态学和生化鉴定两方面对其进行属的鉴定。将其归入4个属，分别是汉逊酵母属、假丝酵母属、酒香酵母属和德克酵母属。半个世纪以来，我国酒曲生产虽然取得成绩，但与酿酒工业发展要求还不相适应，与国内其它行业先进技术水平相比还有很大差距。采用现代生物技术，选育优良酿酒菌种，走纯种多菌混合发酵之路，可以达到既多产酒又生香味的目的，改变单一菌种发酵香味不足的现象。1.3.3 DNA序列分析技术和酒类相关酵母菌多样性研究进展随着D

38、NA序列分析技术的日趋成熟和简易化，rRNA基因（rDNA）的序列分析被越来越多地应用于酵母的分类鉴定以及系统学研究。26S rDNA的D1/D2 区域位于大亚基的5端，序列长度在600bp左右。通用扩增引物为NL1：5-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3和NL4：5-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3。 Lanversin等45研究表明这段区域具有较高的变异率，可以用于亲缘关系较近的菌株之间的分类研究。对大量子囊菌酵母模式菌种的26S rDNA D1/D2区的序列测序分析发现，同种内不同菌株rDNA D1/D2区核苷酸替换率一般不超过1，而不同种的菌株其核苷酸替换率

39、则一般较高。因此，该区可以作为酵母菌种级水平鉴定指标，与传统方法相比具有简便、快速等优点，适合实验室及工业化生产中酵母菌的鉴定。目前这一区域序列在酵母菌分类方面的应用是所有分子学方法中应用最多的。2003年，第4版酵母菌分类研究一书中描述的685种酵母菌中，有666个种的26S rDNA D1/D2区序列存储于DDBJ数据库中，而ITS区序列占50，18S rDNA区序列占7046。赵丽丽等47利用26S rDNA D1/D2区序列分析法，对从葡萄、苹果、梨、枣、黄豆酱、酸菜、荔枝、橙子、干酵母、自发粉中分离得到18株酵母菌进行形态观察，分别提取DNA，PCR扩增和测定其26S rDNA序列，

40、并与基因库中基因序列进行同源性比较，经鉴定5株为酿酒酵母菌，4株为季氏毕赤氏酵母菌，4株为东方伊萨酵母菌，陆生伊萨酵母菌，葡萄有孢汉逊酵母菌，鲁氏接合酵母菌，美极梅奇酵母菌和发酵假丝酵母菌各一株。王泽举等48 研究了新疆葡萄酒自然发酵过程酵母菌的种类和动态变化。他们利用WL营养琼脂培养基，对葡萄酒自然发酵过程中，不同阶段分离的408株酵母菌进行了初步鉴定。结果表明，供试酵母菌被归入8个属的9个种:酿酒酵母（Scerevisiae ）、葡萄汁有孢汉逊酵母（Huvarum ）、季也蒙有孢汉逊酵母（Hguilliermondii）、东方伊萨酵母（Iorientalis）、毕赤克鲁维酵母（Pkuyve

41、r）、膜璞毕赤酵母（Pmembranefaciens）、美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、红冬孢酵母（Rhodos poridium muci laginos ）和假丝酵母（Czemplinina），分别占到了分离总菌株的44.12%、19.36%、8.09%、13.73%、4.66%、3.43%、4.17%、2.21%和0.25%。Thanh VN 等 1采用PCR-DGGE技术对越南传统酒精发酵产品的微生物多样性进行了分析，从中鉴定出包括酵母菌在内的13种真菌和23种细菌。其中包括淀粉酶产生菌 (Rhizopus oryzae，R. microsporus

42、，Absidia corymbifera，Amylomyces sp.， Saccharomycopsis fibuligera)，乙醇产生菌(Scerevisiae， Issatchenkia sp.， Panomala， Ctropicalis，P. ranongensis，Clavispora lusitaniae)，和（机会）污染菌 (Xeromyces bisporus，Botryobasidium subcoronatum)。褚学英等49采用添加去氧胆酸钠的选择性培养基，从大曲中分离获得了7株酵母菌纯培养。以NL1和NL4为引物，对分离得到的酵母菌进行了26S rDNA D1/D2

43、区域序列扩增、同源性比较和系统发育分析。研究结果表明：6株分离酵母菌与GenBank数据库中已知酵母有较高的相似性和相近的亲源关系。另外1株酵母菌DQY-7与菌株Uncultured fungus clone FS10有较高的相似性，而与已知酵母菌相似性较低，说明大曲中还存在一种以前尚未被认识的酵母菌。1.3.4 白酒香味成分的分析技术研究进展最早，一般采用常规的化学分析方法测定白酒中的总酸、总酯、总醛、甲醇和杂醇油等成分。1964年，原中国轻工业部组织的茅台、汾酒试点研究组采用纸层析色谱法定性及半定量检出白酒中的酸和酯及芳香族化合物等成分；同时，在茅台试点应用薄层色谱法和柱层色谱法探讨茅台酒

44、中的有机酸成分11, 60；1966年，内蒙古轻工研究所用气相色谱分析定量白酒中较高沸点的酯类，如辛酸乙酯和乳酸乙酯等12, 50。气相色谱法的分离原理是使混合物中的各组分在固定相(固定)与流动相(载体)间进行交换，由于各组分在性质和结构上的不同，当它们被流动相推动经过固定相时与固定相发生的相互作用的大小、强弱会有差异，以致各组分在固定相中滞留的时间有长有短，而按顺序流出达到分离的目的。气相色谱法本是作为一种分离手段，但自从气相色谱配备各种检测器(如N、+H、O 等)以后，能使分离分析一次完成，具有分离效果好、灵敏度高、选择性强、分析速度快、用途广泛等优点，使气相色谱成为一种极重要的现代分析工

45、具。目前通常采用填充色谱分析和毛细管色谱分析，进行填充色谱分析时可采用邻苯二甲酸二壬酯(DNP) 和吐温-60(Tween-60)20:7的混合柱(简称DNP混合柱)和PEG20M（聚乙二醇，平均相对分子质量20000）柱两种12, 51；进行毛细管色谱分析时通常采用FFAP柱。食品发酵工业科学研究所蔡心尧等52 1994年采用FFAP键合毛细管柱直接进样分析白酒香味成分时，一次进样可对包括有机酸的高级脂肪酸乙酯在内的57个组分进行定量测定，结果重现性良好。对于白酒中那些挥发性极低的物质，气相色谱无法检测，这时需要利用高效液相色谱进行分离和检测。银燕于1994年用高效液相色谱法测定酒中的有机酸

46、53。1981年，金佩璋等54通过填充柱、毛细管柱色谱分析和气相色谱质谱联用技术(GC/MS)，检出了玉冰烧酒的香味成分150种。色谱是分离混合物的有效方法，但难以得到结构信息，主要靠与标样对比来达到未知物结构的推定，质谱法提供了丰富的结构信息，样品用量又是几种谱学方法中最少的，因此色谱质谱的结合，成为分离和鉴定未知混合物的理想手段。1.4 本课题主要研究内容及意义1.4.1 研究内容 （1）白云边酒酿造微生物菌种资源的分离及多样性研究。本研究对白云边酒中、高温酒曲和原料小麦中的微生物种类及数量进行分析与测定。主要分析与酿造有关的淀粉酶和糖化酶产生菌（细菌、霉菌）种类及数量，并进行分子鉴定。 （2）对白云边酒高温堆积过程中的原料及发酵完成后的酒醅中的酵母菌的种类进行分析以及分子鉴定，并对其酒精发酵能力和产风味物质的代谢产物进行分析。（3）对白云边酒中乙酸乙酯高产酵母菌株进行了详细的发酵特征研究，并对其与酿酒酵母的混合发酵进行研究，与市售生香活性干酵母进行比较实验，在实验室进行生香活性干酵母的制备。1.4.2 研究意义湖北白云边酒是我国浓酱兼香型白酒的典型代表，兼香型白酒