基因工程的基本操作程序--精品PPT课件.ppt

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1、基因工程的基本操作程序-精品PPT课件 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤：目的基因的目的基因的获取获取基因表达载体的基因表达载体的构建构建将目的基因将目的基因导入导入受体细胞受体细胞目的基因的目的基因的检测与鉴定检测与鉴定基因的结构（补充知识）基因的结构（补充知识）非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子RNARNA聚合酶能够识

2、别调控序列中的结合位点，并与其聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。结合。转录开始后，转录开始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移动，并以分子移动，并以DNADNA分子分子的一条链为模板合成的一条链为模板合成RNARNA。转录完毕后，转录完毕后，RNARNA链释放出来，紧接着链释放出来，紧接着RNARNA聚合酶也从聚合酶也从DNADNA模板链上脱落下来。模板链上脱落下来。1 1、编码区：能转录相应的信使、编码区：能转录相应的信使RNARNA，能编码蛋白质的序列。，能编码蛋白质的序列。2 2、非编码区、非编码区 ：调控遗传信息表达调控遗传信息表达的核苷酸序列的核苷酸序列(

3、启动子、启动子、终止子），不编码蛋白质。终止子），不编码蛋白质。(原核细胞原核细胞)(真核细胞真核细胞)编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区 内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子基因的结构（补充知识）基因的结构（补充知识）与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点1 1、编码区、编码区2 2、非编码区、非编码区 ：调控遗传信息表达调控遗传信息表达的核苷酸序列的核苷酸序列(启动子、启动子、终止子），不编码蛋白质。终止子），不编码蛋白质。外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列限制酶限制酶基因组基因组DN

4、ADNA基因重组基因重组转化细菌转化细菌体外包装体外包装 1)1)基因组文库基因组文库 是指将某种生物体的是指将某种生物体的全部基因全部基因组组DNADNA用限制性内切酶或机械力量切用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的割成一定长度范围的DNADNA片段，再与片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。的全部基因。目的基因的获取目的基因的获取（一）从基因文库中直接获取（一）

5、从基因文库中直接获取1.1.基因文库基因文库 是由生物的某一特定器是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的官或特定发育时期细胞内的mRNAmRNA经体外反转录后形成的经体外反转录后形成的互补互补DNADNA片段，与载体连接片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生这个受体菌群就叫做这种生物的物的cDNAcDNA文库文库 2)cDNA2)cDNA文库文库基因重组基因重组反转录酶反转录酶mRNAmRNAcDNAcDNA2.2.基因文库的构建方法基因文库的构建方法直接分离法直接分离法(鸟枪法鸟枪法)多用于原核生物多用于原核生物人工合成法人工合成法（真

6、核生物）（真核生物）逆转录法逆转录法化学合成法化学合成法 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、_ _、_ _、_._.原理：原理：_方式：方式：以以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成

7、倍地扩增(二二)利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因（二）利用（二）利用PCR扩增目的基因扩增目的基因1 1、过程、过程高温变性（高温变性（解旋为单链解旋为单链）低温退火（低温退火（引物与单链互补结合引物与单链互补结合）适温延伸适温延伸（在在TaqTaq酶的作用下合成酶的作用下合成 与模板互补的与模板互补的DNADNA双链双链）重复循环重复循环1 1、过程、过程（二）利用（二）利用PCR扩增目的基因扩增目的基因（二）利用（二）利用PCR扩增目的基因扩增目的基因2 2、条件、条件已知基因的核苷酸序列、已知基因的核苷酸序列、四种脱氧核苷酸、四种脱氧核苷酸、引物引物TaqTaqDNA

8、DNA聚合酶聚合酶使目的基因的片段在短时间内成倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成倍地扩增4 4、结果、结果耐高温耐高温3 3、方式：、方式：以以指数指数方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循环的次数）为扩增循环的次数）2 2n n适宜的温度和适宜的温度和PHPH值值思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？以完成任务吗？为什么？复制原点复制原点目的基因目的基因启动子启动子终止子终止子标记基因等标记基因等1 1、基因、基因表达载体表达载体的组成的组成基因表达载体的构建基因表达载体的构建 核心核心1.1.用一定的用一

9、定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处，再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNA DNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同2、构建过程、构建过程将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞（转化方法）（转化方法）1 1、导入植物细胞、导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法(感染双子

10、叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力)基因枪法基因枪法（单子叶植物）（单子叶植物）花粉管通道法花粉管通道法显微注射法：将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受显微注射法：将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受 精卵中精卵中2 2、导入动物细胞、导入动物细胞3 3、导入微生物细胞、导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少细胞、遗传物质少用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表达载体与感表达载体与感受态细胞混合受态细胞混合 感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNA分子分子方法：方法：目的基因

11、的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定1 1、分子水平的检测：分子杂交技术、分子水平的检测：分子杂交技术检测是否插入目的基因检测是否插入目的基因检测是否转录出检测是否转录出mRNAmRNA检测目的基因是否翻译检测目的基因是否翻译 成蛋白质成蛋白质2 2、个体水平的鉴定、个体水平的鉴定DNADNA分子杂交技术分子杂交技术提取蛋白质，用相应的抗体进行提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原抗体杂交，看是否有杂交带抗原抗体杂交，看是否有杂交带依据其性状进行检测如：抗虫或抗病的接种实验依据其性状进行检测如：抗虫或抗病的接种实验提取提取mRNA，用标记的基因探针，用标记的基因探针与与mRNA 杂交，看是否有杂交带，看

12、是否有杂交带归纳归纳:基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCR技术技术2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法、基因枪法农杆菌转化法、显微注射法、基因枪法4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译、个体水平的检检测：是否插入、转录、翻译、个体水平的检测测1.下表关于基因工程中有关基因操作下表关于基因工程中有关基因操作的名的名词词及及对应对应的内容，正确的的内

13、容，正确的组组合是合是2 2、下列属于获取目的基因的方法的是、下列属于获取目的基因的方法的是()()利用利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成从基因组文库中提取从基因组文库中提取从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术技术 利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合成A.B.C.D.A.B.C.D.3.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测C增加质粒分子的分子量D便于与外源基因连接4.4.有关基因

14、工程的叙述正确的是有关基因工程的叙述正确的是A限制酶只在获得目的基因时才用B重组质粒的形成是在细胞内完成的C质粒都可作为运载体 D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料5.5.哪项不是基因表达载体的组成部分哪项不是基因表达载体的组成部分哪项不是基因表达载体的组成部分哪项不是基因表达载体的组成部分()()A.A.启动子启动子 B.B.终止密码终止密码 C.C.标记基因标记基因 D.D.目的基因目的基因6.6.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法()A A基因枪法基因枪法 B B显微注射法显微注射法 C.C.农杆菌转化法农杆菌转化法 D D花粉管通道法花粉管通道法