第三章毛细管电泳分离技术PPT讲稿.ppt
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1、第三章毛细管电泳分离技术第1页,共58页,编辑于2022年,星期二第一节概述第一节概述 电泳电泳是基于两种或多种带电粒子或微粒,它们是基于两种或多种带电粒子或微粒,它们所在的介质受到外加直流电场的作用下,其迁所在的介质受到外加直流电场的作用下,其迁移速率不同而得到分离的一类方法。移速率不同而得到分离的一类方法。(electrophoresis)第2页,共58页,编辑于2022年,星期二发展历程发展历程1807年,年,Ferdinand Frederic Reuss就观察到了荷就观察到了荷电物质在电场力作用下会发生运动的现象。电物质在电场力作用下会发生运动的现象。1909年,由年,由Michae
2、lis对此现象的描述中提出对此现象的描述中提出电泳电泳这这个术语个术语(elektron和和pbore,分别代表电和搬运者的意分别代表电和搬运者的意思思)20世纪世纪30年代,通过年代,通过Tiselius的研究,电泳技术才的研究,电泳技术才得到有实际意义的发展,得到有实际意义的发展,Tiseluis也因此获得了也因此获得了1948年度的诺贝尔奖。年度的诺贝尔奖。到到20世纪世纪50年代,电泳已经是一种与纸和薄层的平年代,电泳已经是一种与纸和薄层的平面色谱技术一样的实验室常用技术。面色谱技术一样的实验室常用技术。20世纪世纪70年代在年代在HPLC的推动下,电泳分离技术成为了一的推动下,电泳分
3、离技术成为了一种种“灰姑娘灰姑娘”式的技术式的技术 第3页,共58页,编辑于2022年,星期二1981年,年,Jorgenson等介绍了毛细管区带电泳技术。等介绍了毛细管区带电泳技术。1984年年Terabe等提出的胶束电动毛细管色谱。等提出的胶束电动毛细管色谱。1987年,年,Hjerten建立了毛细管等电聚焦。建立了毛细管等电聚焦。1987年,由年,由Chohen等提出了毛细管凝胶电泳。等提出了毛细管凝胶电泳。1991年,年,Monnig等首次提出了高速毛细管电泳。等首次提出了高速毛细管电泳。目前,毛细管电泳已广泛应用于氨基酸、肽、蛋白目前,毛细管电泳已广泛应用于氨基酸、肽、蛋白质和核酸等
4、离子型生物大分子的分离分析,加入表质和核酸等离子型生物大分子的分离分析,加入表面活性剂还可以扩大到中性粒子,甚至应用到细胞面活性剂还可以扩大到中性粒子,甚至应用到细胞和病毒等的分离。同时,在小分子化合物的分离分和病毒等的分离。同时,在小分子化合物的分离分析方面也取得了重大进展。析方面也取得了重大进展。第4页,共58页,编辑于2022年,星期二第5页,共58页,编辑于2022年,星期二第二节毛细管电泳基本原理第二节毛细管电泳基本原理 一、毛细管电泳的理论基础一、毛细管电泳的理论基础毛细管电泳法:毛细管电泳法:是指以弹性石英毛细管为分离通道,以高压直是指以弹性石英毛细管为分离通道,以高压直流电场为
5、驱动力,依据样品中各组分的淌度(单位电场强度流电场为驱动力,依据样品中各组分的淌度(单位电场强度下的迁移速度)和下的迁移速度)和/或分配行为的差异而实现分离的一种分或分配行为的差异而实现分离的一种分析方法。析方法。在毛细管电泳中带电粒子所受的在毛细管电泳中带电粒子所受的驱动力驱动力:电泳力电泳力 电渗力电渗力 第6页,共58页,编辑于2022年,星期二(一)电泳和电渗(一)电泳和电渗n电泳电泳(Electrophoresis)是指溶液中是指溶液中带电粒子带电粒子(离离子、胶团子、胶团)在在电场电场中中定向移动定向移动的现象。电泳是驱动电的现象。电泳是驱动电解质运动的解质运动的第一种动力第一种动
6、力。n电泳迁移速度电泳迁移速度Ve:Ve=eE=eV/L 注:注:e:电泳迁移率电泳迁移率(电泳淌度电泳淌度);E:电场强度电场强度;V毛细管柱两毛细管柱两端施加的电压;端施加的电压;L毛细管柱的长度。毛细管柱的长度。e=e/E=Q/f 第7页,共58页,编辑于2022年,星期二当毛细管长度一定时,带电离子的迁移速度当毛细管长度一定时,带电离子的迁移速度与溶质离子的电荷、施加的电压、缓冲溶液与溶质离子的电荷、施加的电压、缓冲溶液的粘度及带电离子的大小有关。的粘度及带电离子的大小有关。注:注:Q离子所带的净电荷;离子所带的净电荷;fStokes阻力系数。阻力系数。是缓冲溶液是缓冲溶液的粘度的粘度
7、(动力学的动力学的),Rs是离子的有效半径是离子的有效半径(包括溶剂化层包括溶剂化层)第8页,共58页,编辑于2022年,星期二n电渗电渗(Electro osmosis)是驱动电解质运动是驱动电解质运动的第二种作用力,它使毛细管中的的第二种作用力,它使毛细管中的溶剂溶剂在在直流电场作用下发生定向运动。直流电场作用下发生定向运动。第9页,共58页,编辑于2022年,星期二电渗流的产生电渗流的产生n毛细管内壁表面上的硅醇基在毛细管内壁表面上的硅醇基在pH3的水溶液中,可电离而产生的水溶液中,可电离而产生SiO-负离子,使毛细管内壁带上负电荷,因此,溶液中的一部分正离子就负离子,使毛细管内壁带上负
8、电荷,因此,溶液中的一部分正离子就靠静电作用而吸附于毛细管内壁上,形成一个靠静电作用而吸附于毛细管内壁上,形成一个双电层双电层(Electric double layer)。其中一层是带负电的内壁,一层是带正电的溶液。其中一层是带负电的内壁,一层是带正电的溶液离子离子吸附层吸附层。但溶液中的其余大部分正离子则是离内壁越远,。但溶液中的其余大部分正离子则是离内壁越远,越呈自由状态,于是在吸附层之外又存在着一个越呈自由状态,于是在吸附层之外又存在着一个扩散层扩散层。第10页,共58页,编辑于2022年,星期二n固、液两相之间的相对运动发生在吸附层与固、液两相之间的相对运动发生在吸附层与扩散层之间的
9、滑动面上,此处的电动势称扩散层之间的滑动面上,此处的电动势称为为界面电动势界面电动势,也称,也称电位电位。n由于处在扩散层中的正离子的溶剂化作用,由于处在扩散层中的正离子的溶剂化作用,它在电场中发生迁移时,将带动整个溶液它在电场中发生迁移时,将带动整个溶液向阴极移动,所以就形成向阴极移动,所以就形成电渗流(电渗流(Electro Osmotic Flow,EOF)。第11页,共58页,编辑于2022年,星期二p电渗流速度电渗流速度Veo与与电位、电位、E成正比,而成正比,而与介质的粘度与介质的粘度成反比。成反比。电渗流迁移率介质的介电常数界面电动势介质的粘度溶剂流迁移速度第12页,共58页,编
10、辑于2022年,星期二n与与HPLC柱不同,毛细管中的电渗流呈柱不同,毛细管中的电渗流呈平面平面流型,流型,它不存在它不存在径向径向梯度。梯度。第13页,共58页,编辑于2022年,星期二电渗流的意义电渗流的意义1.电泳过程中伴随着电渗现象电泳过程中伴随着电渗现象2.电渗流的速度比电泳速度快电渗流的速度比电泳速度快5-7倍倍3.利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同一方向,产生差速迁移,在一次电泳操向同一方向,产生差速迁移,在一次电泳操作中同时完成正、负离子的分离分析。作中同时完成正、负离子的分离分析。第14页,共58页,编辑于2022年,星期二n电解
11、质区带的移动速度电解质区带的移动速度(Vi)等于电解质区带的等于电解质区带的电泳迁移速度电泳迁移速度(Ve)与溶剂流速度与溶剂流速度(Veo)之和。之和。Vi=Ve+Veo 第15页,共58页,编辑于2022年,星期二n当把样品从阳极端注入毛细管时,假设当把样品从阳极端注入毛细管时,假设A物质为负离子,物质为负离子,B物质为正离子,则带不同电荷的离子将按下面的速度迁物质为正离子,则带不同电荷的离子将按下面的速度迁移到阴极,到时间移到阴极,到时间t时,时,A、B物质已经分离了。物质已经分离了。正离子正离子:t=eo+中性分子:中性分子:t=eo 负离子:负离子:t=eo-注:电渗流的速度为注:电
12、渗流的速度为泳流的若泳流的若5-7倍倍 第16页,共58页,编辑于2022年,星期二抑制毛细管中电渗流的办法:抑制毛细管中电渗流的办法:消除固液界面间的消除固液界面间的电位或提高溶液的粘度;电位或提高溶液的粘度;在毛细管的内壁涂上聚合物,如聚丙烯酰胺涂层。在毛细管的内壁涂上聚合物,如聚丙烯酰胺涂层。具体方法有:具体方法有:n电渗流是毛细管电泳分离的重要参数,电渗流是毛细管电泳分离的重要参数,控制电控制电渗流的大小和方向,可提高毛细管电泳分离的效渗流的大小和方向,可提高毛细管电泳分离的效率、重现性、分离度率、重现性、分离度第17页,共58页,编辑于2022年,星期二第18页,共58页,编辑于20
13、22年,星期二第19页,共58页,编辑于2022年,星期二第20页,共58页,编辑于2022年,星期二(二二)分离效率和分离度分离效率和分离度1、分离效率、分离效率柱效可用柱效可用理论塔板数理论塔板数n表示表示 理论塔板高理论塔板高毛细管电泳分离柱效方程式毛细管电泳分离柱效方程式实验上可按下式求出理论塔板数实验上可按下式求出理论塔板数毛细管有效长度毛细管总长度两端电压溶质扩散系数电泳湍度电渗湍度电泳图上从起点至电泳峰最大值之间的距离电泳峰的半高峰宽第21页,共58页,编辑于2022年,星期二提高提高分离电压分离电压是增加分离效率的主要途径,在相同的操是增加分离效率的主要途径,在相同的操作电压下
14、,作电压下,l/L=1,分离效率最高(,分离效率最高(短的毛细管短的毛细管)。此)。此外,外,N与溶质的扩散系数与溶质的扩散系数D成反比,所以用毛细管电泳成反比,所以用毛细管电泳分分离大分子离大分子时,可得到高的柱效。时,可得到高的柱效。高的电渗流高的电渗流也可提高也可提高柱效。柱效。毛细管电泳分离柱效方程式毛细管电泳分离柱效方程式第22页,共58页,编辑于2022年,星期二2、分离度、分离度电泳中两峰的分离度,也称电泳中两峰的分离度,也称分辨率分辨率,它表明湍度相,它表明湍度相近的组分分开的能力,可表达为(近的组分分开的能力,可表达为(和哪些因素有关和哪些因素有关):):柱效相邻两区带的迁移
15、速度差两者的平均速度 表示分离的选择性第23页,共58页,编辑于2022年,星期二分离度计算式(具体如何计算)分离度计算式(具体如何计算):组分迁移时间峰底宽度第24页,共58页,编辑于2022年,星期二(三)区带宽度及展宽因素(三)区带宽度及展宽因素1、各组分都有相近的空间宽度、各组分都有相近的空间宽度毛细管电泳里有毛细管电泳里有电渗流电渗流,泳动是平头的,几,泳动是平头的,几乎不扩散,不管什么时间测峰,区带宽度乎不扩散,不管什么时间测峰,区带宽度几乎是相等的,这跟液相色谱是不一样的。几乎是相等的,这跟液相色谱是不一样的。第25页,共58页,编辑于2022年,星期二2、区带宽度展宽因素、区带
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