植物组织中淀粉含量的测定（四）.doc

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1、书山有路勤为径，学海无涯苦作舟。植物组织中淀粉含量的测定 一、原理 淀粉是由葡萄糖残基组成的多糖，在酸性条件下加热使其水解成葡萄糖，然后在浓硫酸的作用下，使单糖脱水生成糠醛类化合物，利用蒽酮试剂与糠醛化合物的显色反应，即可进行比色测定。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料任何植物材料。 （二）试剂 浓硫酸（比重1.84）。 9.2mol/lhclo4。 2%蒽酮试剂，同实验24。 （三）仪器设备 电子天平，容量瓶。100ml4个、50ml2个，漏斗，小试管若干支，电炉，刻度吸管0.5ml1支、2.0ml3支、5ml4支，分光光度计，记号笔。 三、实验步骤 1.标准曲线制作 取小试管1

2、1支从010编号，按表24-3加入溶液和蒸馏水。 以下步骤按苯酚法或蒽酮法均可，见方法一或方法二，绘制相应的标准曲线。 表24-3各试管加入标准液和蒸馏水量 管号0123456 78910淀粉标准液（ml） 00.40.81.21.62.0蒸馏水（ml） 2.01.61.20.80.40 淀粉含量（mg） 040801202102021.样品提取称取50100mg粉碎过100目筛的烘干样品，置于15ml刻度试管中，加入67ml80乙醇，在80水浴中提取30min，取出离心（3000rpm）5min，收集上清液。重复提取两次（各10min）同样离心，收集三次上清液合并于烧杯，置于85恒温水浴，使

3、乙醇蒸发至23ml，转移至50ml容量瓶，以蒸馏水定容，供可溶性糖的测定。 向沉淀中加蒸馏水3ml，搅拌均匀，放入沸水浴中糊化15min。冷却后，加入2ml冷的9.2mol/l高氯酸，不时搅拌，提取15min后加蒸馏水至10ml，混匀，离心10min，上清液倾入50ml容量瓶。再向沉淀中加入2ml4.6mol/l高氯酸，搅拌提取15min后加水至10ml，混匀后离心10min，收集上清于容量瓶。然后用水洗沉淀12次，离心，合并离心液于50ml容量瓶用蒸馏水定容供测淀粉用。 3.测定取待测样品提取液1.0ml于试管中，再加蒽酮试剂5ml，快速摇匀，然后在沸水浴中煮10min，取出冷却，在620n

4、m波长下，用空白调零测定光密度，从标准曲线查出淀粉含量（mg）。 四、结果计算：含量（%）=100*c*vt/v1*1000*w 式中。c从标准曲线查得淀粉量，mg。vt样品提取液总体积，ml。v1显色时取样品液量，ml。w样品重，g。 0.9由葡萄糖换算为淀粉的系数。 碘-淀粉比色法 一、原理 对于淀粉含量较少的植株样品，也可采用碘淀粉比色法。淀粉在加热情况下能溶于硝酸钙溶液中，当碘化钾和硝酸钙共存时，碘能以碘淀粉蓝色化合物沉淀全部淀粉。将此沉淀溶于碱液，并在酸性条件下与碘作用形成蓝色溶液进行比色。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料任何植物材料。 （二）试剂 1.80硝酸钙溶液。

5、 2.0.5碘液。称5.00g结晶碘和10.00g碘化钾，放入研钵混合干研，然后加10ml蒸馏水研至全部碘溶解，将溶液全部转入1000ml容量瓶定容后，贮于磨口试剂瓶。 3.5含碘硝酸钙溶液。取10ml80的硝酸钙溶液，加入160ml水再加入3ml0.5的碘液混匀，现用现配。 4.标准淀粉溶液。称取纯淀粉50mg于研钵中，加3ml80硝酸钙溶液，研细并转移到100ml的三角瓶中，用15ml80的硝酸钙溶液冲洗研钵，无损地收集于三角瓶中。将三角瓶置于沸水浴中煮沸5min，冷却后全部转入50ml容量瓶中并定容。此液为1mg/ml的淀粉标准液。 5.0.1mol/lnaoh。 6.0.1mol/lh

6、cl。 （三）仪器设备 分析天平，研钵，容量瓶，量筒，三角瓶，水浴，小漏斗，电炉，离心机，离心管，试剂瓶。 三、实验步骤 1.称取13g叶片，剪碎放入研钵，加5ml80的硝酸钙溶液，研磨成糊状移入100ml的三角瓶中，用10ml80的硝酸钙冲洗研钵，无损地收集于三角瓶中，瓶口盖上小漏斗，在沸水浴上煮沸35min（叶片含淀粉少的3min，含淀粉多的5min），使样品中淀粉转变为胶体溶液。 2.给三角瓶中加20ml蒸馏水，混合液转入离心管中离心（20213000rpm）23min，将离心后的淀粉胶体浑浊液移入100ml容量瓶（淀粉含量少时，可移入50ml容量瓶），三角瓶及离心沉淀物用510ml热蒸

7、馏水冲洗并同样离心，离心液并入容量瓶中（共洗23次）定容，即为淀粉提取液。 3.取510ml淀粉待测液，加入到盛有2ml0.5碘液的离心管中，混匀静置15min后离心（3000rpm）5min，弃上清液。沉淀用5的含碘硝酸钙溶液冲洗两次，向冲洗后的沉淀中加入10ml0.1mol/l的naoh混匀，将离心管浸入沸水内5min，使沉淀溶解。将溶液转入50ml容量瓶中，加入0.3ml0.5碘液，用30ml左右的水冲洗并入容量瓶，加入2ml1mol/l的盐酸，用水定容并显色，在590nm波长处测定光密度。 4.绘制标准曲线取标准淀粉溶液（1mg/ml）0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0

8、ml于6个离心管中，用80硝酸钙溶液将各管的体积补足至5ml，再向各管加入2ml0.5碘液，混匀静置15min后离心，其他操作同样品测定步骤，显色后在590nm波长下测定光密度。此系列溶液的淀粉含量分别为0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg，然后以光密度为横坐标，以淀粉含量为纵坐标绘制标准曲线。 四、结果计算：含量（%）=100*c*vt/v1*1000*w式中：c从标准曲线查得淀粉量，mg。vt样品提取液总体积，ml。v1显色时取样品液量，ml。w样品重（g）。 iii旋光法（谷物淀粉含量的测定） 一、原理。酸性氯化钙溶液与磨细的含淀粉样品共煮，可使淀粉轻度水解。同时钙离子

9、与淀粉分子上的羟基络合，这就使得淀粉分子充分地分散到溶液中，成为淀粉溶液。淀粉分子具有不对称碳原子，因而具有旋光性，可以利用旋光仪测定淀粉溶胶的旋光度（），旋光度的大小与淀粉的浓度成正比，据此可以求出淀粉含量。溶提淀粉溶胶所用的酸性氯化钙溶液的ph值必须保持2.30，密度须为1.30，加时间的长短也要控制在一定范围。因为只有在这些条件下，各种不同来源的淀粉溶液的比旋度才都是203，恒定不变。样品中其他旋光性物质（如糖分）须预先除去。 二、材料、仪器设备及试剂： （一）材料：面粉或其他风干样品 （二）仪器设备： 1.植物样品粉碎机； 2.离心机； 3.分析天平； 4.粗天平； 5.旋光仪及附件；

10、 6.三角瓶； 7.分样筛（100目）； 8.布氏漏斗、抽滤瓶及真空泵； 9.离心管； 10.小电炉。 （三）试剂： 三、实验步骤： 1.样品准备：（1）称取样品：将样品风干、研磨、通过100目筛，精确称取约2.5g样品细粉（要求含淀粉约2g，请参考附注估计），置于离心管内。（2）脱脂：加乙醚数ml到离心管内，用细玻棒充分搅拌，然后离心。倾出上清液并收集以备回收乙醚。重复脱脂数次，以去除大部分油脂、色素等（因油脂的的存在会使以后淀粉溶液的过滤困难）。大多数谷物样品含脂肪较少，可免去这个脱脂手续。（3）抑制酶活性：加含有氯化高汞的乙醇溶液10ml到离心管内，充分搅拌，然后离心，倾去上清液，得到残

11、余物。（4）脱糖：加80乙醇10ml到离心管中，充分搅拌以洗涤残余物（每次都用同一玻棒），离心，倾去下清液。重复洗涤数次以去除可溶性糖分。 2.溶提淀粉：（1）加醋酸氯化钙：先用醋酸氯化钙溶液约10ml加到离心管中，搅拌后全部倾入250ml三角瓶内，再用醋酸氯化钙溶液50ml分数次洗涤离心管，洗涤液并入三角瓶内，搅拌玻棒也转移到三角瓶内。（2）煮沸溶解：先用蜡笔标记液面高度，直接置于加有石棉网的小电炉上，在4min5min内迅速煮沸，保持沸腾15min17min，立即将三角瓶取下，置流水中冷却。煮沸过程中要时加搅拌，勿令烧焦；要调节温度，勿使泡沫涌出瓶外；常用玻璃将瓶侧的细粒擦下；并加水保持液

12、面高度。 3.沉淀杂质和定容：（1）加沉淀剂：将三角瓶内的水解液转入100ml容量瓶，用醋酸氯化钙溶液充分洗涤三角瓶瓶，并入容量内，加30znso41ml混合后，再加15k4fe（cn）61ml，用水稀释至接近刻度时，加95乙醇一滴以破坏泡沫，然后稀释到刻度，充分混合，静置，以使蛋白充分沉淀。（2）滤清：用布氏漏斗（加一层滤纸）吸气过滤。先倾清溶液约10ml于此滤纸上，使其完全湿润，让溶液流干，弃去滤液，再倾清溶液进行过滤，用干燥的容器接受此滤液，收集约50ml，即可供测定之用。 4.测定旋光度：用旋光测定管装满滤液，小心地按照旋光仪使用说明，进行旋光度的测定。淀粉（）n100/20dl（wk

13、）100式中：用钠光时观测到的旋光度；20d：淀粉的比旋度，在这种方法条件下为203；l：旋光管长度（cm）；w：样品质量（g）；k：样品水分含量（）；n：稀释倍数；100：换算为百分率。也可以不用上列公式计算，改用工作曲线来求得淀粉含量，这样准确度高些。 、淀粉含量的测定 一、目的 掌握植物组织中淀粉含量测定的原理和方法。 二、原理 淀粉用盐酸水解转化成葡萄糖后，测定葡萄糖含量，根据葡萄糖含量换算成淀粉含量。 三、材料、仪器设备及试剂 材料、仪器设备及试剂与上述蔗糖的测定相同，另增加碘试剂；100ml、250ml容量瓶。碘试剂（碘化钾碘溶液）的配制：称取碘化钾20g及碘10g溶于100ml蒸

14、馏水中。使用前需稀释10倍。 四、实验步骤 1.葡萄糖标准曲线制作与上述还原糖含量测定相同。 2.淀粉的水解 取上述还原糖含量测定中经85乙醇浸提后的全部淀粉残渣，放入100ml三角瓶中，加入6moll1盐酸10ml，混匀，在沸水浴中加热10min30min（用碘试剂检查淀粉水解程度，直至不显蓝色为止），再加蒸馏水20ml，摇匀并过滤于100ml容量瓶中，过滤后残渣再用蒸馏水冲洗3次，一并过滤入容量瓶，定容至100ml。准确取出10ml过滤液置入250ml容量瓶中，加酚酞2滴，用10naoh中和至微红色，用蒸馏水定容至250ml，待测。 3.还原糖含量测定 取4支25ml刻度试管，编号，其中3

15、支（三个重复）分别加入待测液2ml，1支空白管加2ml蒸馏水代替样品液，然后各管再加入dns试剂1.5ml，摇匀，混合液在沸水浴中加热5min，然后用自来水冷却，各加入21.5ml蒸馏水使总体积为25ml，摇匀，在520nm波长下测定吸光度（a）值。 五、结果计算 根据待测液的吸光度从上述标准曲线中查出其相应的还原糖含量，然后按下公式计算出样品中还原糖（葡萄糖）含量和淀粉含量的百分率。 淀粉水解液总量（ml）从标准曲线上查得还原糖（mg） 测定时水解液用量（ml） 还原糖（）=100 （葡萄糖）样品重（mg） 粗淀粉含量（）=葡萄糖含量0.9 式中系数0.9依据淀粉（c6h10o5）n水解时吸收n个分子水。 第 9 页 共 9 页