凯氏定氮法PPT讲稿.ppt

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1、凯氏定氮法第1页，共21页，编辑于2022年，星期五测定总氮量测定总氮量 N%F=粗蛋白质含量粗蛋白质含量%因为：样品中除蛋白氮外，可能还包括有非蛋白质因为：样品中除蛋白氮外，可能还包括有非蛋白质含氮化合物，如核酸、含氮碳水化合物、生物碱、含氮化合物，如核酸、含氮碳水化合物、生物碱、含氮类脂、卟啉和含氮色素等。含氮类脂、卟啉和含氮色素等。第三节第三节蛋白质的定量测定蛋白质的定量测定！第2页，共21页，编辑于2022年，星期五一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法 由由Kieldhl于于1833年提出，现发展为常量、微量、年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。自动定氮仪法，半微量

2、法及改良凯氏法。改良：改良：氮的完全氨化，缩短时间，简化操作。氮的完全氨化，缩短时间，简化操作。主要改良催化剂及消化主要改良催化剂及消化蒸馏蒸馏装置。装置。第3页，共21页，编辑于2022年，星期五（一）常量凯氏定氮法（一）常量凯氏定氮法原理原理样样品品与与浓浓硫硫酸酸和和催催化化剂剂一一同同加加热热消消化化，使使蛋蛋白白质质分分解解，其其中中碳碳和和氢氢被被氧氧化化为为二二氧氧化化碳碳和和水水逸逸出出，而而样样品品中中的的有有机机氮氮转转化化为为氨氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。用用H3BO3吸吸收收后后再再以以标标准准HCl滴滴定定

3、或或H2SO4溶溶液液滴滴定定。根根据据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。也也可可以以用用过过量量的的标标准准H2SO4或或标标准准HCl溶溶液液吸吸收收后后再再以以标标准准NaOH滴定过量的酸。滴定过量的酸。第4页，共21页，编辑于2022年，星期五催化剂催化剂煮沸煮沸1、消化：、消化：NCOC+浓浓H2SO4（NH4）2SO4+CO2+SO2+H2O2、蒸馏与吸收：、蒸馏与吸收：2NaOH+（NH4）2SO42NH3+Na2SO4+2H2O 2NH 2NH3 3+4H+4H3 3BOBO3 3 （NHNH4 4）2 2B B4 4O O7 7+5H+5

4、H2 2O O 3 3、滴定：（、滴定：（NHNH4 4）2 2B B4 4O O7 7+5H+5H2 2O+2HCl 2NHO+2HCl 2NH4 4Cl+4HCl+4H3 3BOBO3 3 (注注:NCOC,Nitrogen containing organic compounds):NCOC,Nitrogen containing organic compounds)凯氏定氮法原理（方程式）凯氏定氮法原理（方程式）整个过程分三步：消化、蒸馏与吸收、滴定整个过程分三步：消化、蒸馏与吸收、滴定第5页，共21页，编辑于2022年，星期五1.消化消化加硫酸钾加硫酸钾作为增温剂，提高溶液沸点，作为

5、增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点纯硫酸沸点340，加入硫酸钾之后可以提高，加入硫酸钾之后可以提高至至400以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。高沸点，但效果不如硫酸钾。要防止暴沸要防止暴沸第6页，共21页，编辑于2022年，星期五加硫酸铜加硫酸铜作为催化剂。还可以作消化终点指作为催化剂。还可以作消化终点指示剂、蒸馏时碱性指示剂。还可以加氧化汞、汞示剂、蒸馏时碱性指示剂。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。加氧化剂加氧化剂如双氧水、次氯酸钾等加速有机如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度。

6、物氧化速度。第7页，共21页，编辑于2022年，星期五凯氏定氮法注意事项凯氏定氮法注意事项图：常量凯氏定氮消化及蒸馏装置图：常量凯氏定氮消化及蒸馏装置 a a消化装置消化装置 b b蒸馏吸收装置蒸馏吸收装置1 1、装置的气密、装置的气密性性2 2、何时加碱、何时加碱3 3、火候控制、火候控制4 4、难消化的、难消化的 对对策策5 5、停止蒸馏、停止蒸馏第8页，共21页，编辑于2022年，星期五自动回流消化蒸馏仪自动回流消化蒸馏仪第9页，共21页，编辑于2022年，星期五2.蒸馏与吸收蒸馏与吸收消化液消化液+40%氢氧化钠，加热蒸馏，放出氨气。氢氧化钠，加热蒸馏，放出氨气。“以以奈氏试剂奈氏试剂

7、”检查。检查。同时用同时用4%硼酸吸收硼酸吸收Nessler试剂，试剂，K2（HgI4）检验检验NH4+离子，析出黄色或红棕离子，析出黄色或红棕色沉淀。色沉淀。第10页，共21页，编辑于2022年，星期五3.滴定滴定用用HCl滴定滴定用混合指示剂（甲基红用混合指示剂（甲基红+溴甲酚绿或亚甲基兰溴甲酚绿或亚甲基兰+甲基红）甲基红）终点：蓝色终点：蓝色微红色微红色计算：计算：F要根据样品来源定要根据样品来源定 第11页，共21页，编辑于2022年，星期五说明及注意：说明及注意：本本法法可可应应用用于于各各类类食食品品中中蛋蛋白白质质含含量量测测定定（粗粗蛋蛋白质）白质）。结果准确，但费时。结果准确

8、，但费时。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。同时作一空白试验，从消化开始到滴定同时作一空白试验，从消化开始到滴定。消消化化时时不不要要用用强强火火，应应保保持持和和缓缓沸沸腾腾，以以免免粘粘贴贴在在凯凯氏氏瓶瓶内内壁壁上上的的含含氮氮化化合合物物在在无无硫硫酸酸存存在在的的情情况下消化不完全而造成氮损失。况下消化不完全而造成氮损失。第12页，共21页，编辑于2022年，星期五消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。样品中若

9、含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入加入30过氧化氢过氧化氢23m1后再继续加热消化后再继续加热消化。第13页，共21页，编辑于2022年，星期五般消化至呈透明后，继续消化般消化至呈透明后，继续消化3

10、0分钟即可，但对于含有特分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸等时，需适当延长消化时间（如大豆粉）。有机物如分酪氨酸等时，需适当延长消化时间（如大豆粉）。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。蒸馏装置不能漏气。蒸馏时，加热火力要稳定，否则将发生倒蒸馏装置不能漏气。蒸馏时，加热火力要稳定，否则将发生倒吸现象。吸现象。(NH4)2SO4 检验第14页，共21页，编辑于2022年，星期五蒸馏前加蒸馏前加NaOH要足量

11、，溶液应变为深蓝色或黑要足量，溶液应变为深蓝色或黑褐色褐色（Cu（OH）2、CuO、铜氨离子），如颜色、铜氨离子），如颜色不变可能碱不够不变可能碱不够。蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸口，再蒸1分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸。吸。H3BO3吸收液的温度不应超过吸收液的温度不应超过40，否则对，否则对NH3的吸收作用减弱而造成损失。的吸收作用减弱而造成损失。第15页，共21页，编辑于2022年，星期五（二）微量凯氏定氮法（二）微量凯氏定氮法1、原理、步骤及适用范围同前、原理、步骤及适用范围同前2、

12、与常量法不同点：、与常量法不同点：样品量、试剂用量样品量、试剂用量减少减少加入硼酸量加入硼酸量由由50ml10ml,滴定用盐酸浓度由滴定用盐酸浓度由0.1mol/L0.01mol/L,可用微量滴定管。可用微量滴定管。3、蒸馏装置见下图、蒸馏装置见下图。第16页，共21页，编辑于2022年，星期五保持保持酸性酸性第17页，共21页，编辑于2022年，星期五第18页，共21页，编辑于2022年，星期五改良式微量凯氏改良式微量凯氏定氮装置定氮装置 第19页，共21页，编辑于2022年，星期五（三）自动凯氏定氮法（三）自动凯氏定氮法1 1、原理及适用范围同前原理及适用范围同前 2 2、特点：特点：（1

13、）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化）快速：一次可同时消化8个样品，个样品，30分钟可消化分钟可消化完毕。完毕。（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完分钟完成成1个样。个样。第20页，共21页，编辑于2022年，星期五如何测定蛋白氮？如何测定蛋白氮？先把非蛋白质的含氮物与蛋白质分开。一般多采先把非蛋白质的含氮物与蛋白质分开。一般多采用沉淀剂（用沉淀剂（CuSO4+NaOH，或三氯乙酸，或三氯乙酸），将蛋白），将蛋白质沉淀析出，经过过滤（或离心分离），将沉淀物质沉淀析出，经过过滤（或离心分离），将沉淀物再用凯氏法测定含再用凯氏法测定含N量。量。马铃薯含非蛋白氮多。马铃薯含非蛋白氮多。乳中非蛋白氮的测定？乳中非蛋白氮的测定？第21页，共21页，编辑于2022年，星期五