第五讲基因定点诱变技术精选文档.ppt

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1、第五讲基因定点诱变技术第五讲基因定点诱变技术本讲稿第一页，共二十四页n nM.Smith（加拿大生物化学家）1993年诺贝尔化学奖，1978年发明了寡核苷酸定点诱变技术。利用寡核苷酸定点诱变技术，可以认为地通过基因的改变来修饰、改造某一已知的蛋白质，从而可以研究蛋白质的结构及其与功能的关系、蛋白质之间的相互作用。寡核苷酸定点诱变技术寡核苷酸定点诱变技术本讲稿第二页，共二十四页基因诱变的应用n n1 结构和功能n n2 基因的注释n n3 代谢途径-分子育种n n4 蛋白质的修饰n n5 分子设计-分子进化工程本讲稿第三页，共二十四页缺失诱变缺失诱变n n1 简单缺失 通过对DNA片段中具有的相

2、应的酶切位点进行切割，而后用T4连接酶进行连接。n n2 系统缺失 核酸外切酶III、S1核酸酶、Klenow大片段本讲稿第四页，共二十四页插入突变插入突变n n1 人工合成片段n n2 Transposon insertion（Tn5）n n3 同源重组n n4 PCR本讲稿第五页，共二十四页 基因的体外诱变本讲稿第六页，共二十四页Kunkel法法 或称或称”U”法法 dut-：dUTPdUTP酶（酶（dUTPasedUTPase）缺陷，细胞不能把）缺陷，细胞不能把dUTPdUTP转化为转化为dUMP,dUMP,因此细胞内因此细胞内dUTPdUTP的含量大为增加，的含量大为增加，其中一些其中

3、一些dUTPdUTP可掺入可掺入DNADNA中正常情况下有中正常情况下有“T”“T”占据占据的位置。的位置。ung ung-：UDGUDG酶缺陷，酶缺陷，UDGUDG酶（尿嘧啶酶（尿嘧啶-N-N-糖基化糖基化酶）可除去酶）可除去DNADNA中的尿嘧啶中的尿嘧啶本讲稿第七页，共二十四页E.Coli（dut-，ung-）n n合成的DNA中含有尿嘧啶，M13噬菌体DNA中将含有20-30个尿嘧啶碱基。n nCJ236(dut-，ung-，F+)本讲稿第八页，共二十四页ssDNA制备载体制备载体n n1 单链噬菌体载体 M13n n2 phagemid载体-辅助噬菌体本讲稿第九页，共二十四页所用酶类

4、所用酶类n nT4噬菌体聚合酶：诱变几率65%n nT7噬菌体聚合酶：3-5外切活性强，持续合成DNA的能力强，遇到引物时会停止。诱变几率83%n nKlenowDNA聚合酶：前端有引物或双链时，可能会替换。诱变几率36%本讲稿第十页，共二十四页影响因素影响因素n n1 引物：热动力学（配对），突变碱基的左右8-10bpn n2 T4连接酶n n3 5端磷酸化n n4 单链结合蛋白：解决颈环结构本讲稿第十一页，共二十四页n n基因扩增（gene amplification）主要内容：主要内容：1.1.体外扩增体外扩增 2.2.通过体外重组和转化，将目的基因在宿主细通过体外重组和转化，将目的基因

5、在宿主细胞进行扩增胞进行扩增 3.在环境作用下，生物体内相关基因的扩增。4.程序基因扩增 5.5.进化过程中的基因扩增进化过程中的基因扩增本讲稿第十二页，共二十四页n nPCRPCR技术技术 在在19831983年，美国年，美国CetusCetus公司人类遗传公司人类遗传研究室的科学家研究室的科学家K.B.MullisK.B.Mullis发明的。发明的。PCR PCR是一种在体外快速扩增特定基因是一种在体外快速扩增特定基因或或DNADNA序列的方法，有称之为体外扩序列的方法，有称之为体外扩增法。增法。本讲稿第十三页，共二十四页(c)(c)(b)(b)引物引物引物引物2 255333333555

6、5(d)(d)新引物新引物新引物新引物5533靶靶靶靶DNADNA的扩增的扩增的扩增的扩增(a)(a)5533引物引物引物引物1 13 3 553355引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链单位长度的链单位长度的链单位长度的链单位长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链5 5 3 3 3355引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图聚合

7、酶链式反应示意图(e)(e)(f)(f)(g)(g)本讲稿第十四页，共二十四页温度温度温度温度（）时间时间时间时间（minmin）9494727260609494变性变性变性变性（1min1min）60 60 退火退火退火退火（1min1min）72 72 延伸延伸延伸延伸（1.5min1.5min）循环循环循环循环1 1 循环循环循环循环2 2 循环循环循环循环3 3PCRPCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期PCR PCR PCR PCR 反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由DNADNADNADNA变性

8、、引变性、引变性、引变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是应参数是应参数是应参数是94949494变性变性变性变性1min1min1min1min，60 60 60 60 退火退火退火退火1min1min1min1min，72 72 72 72 延伸延伸延伸延伸1.5min1.5min1.5min1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增。如此周而复始，重复进行，直至扩增。如此周而复始，重复进行，直至扩增。如此周而复始，重复进行，直至扩增

9、产物的数量满足实验需求为止。产物的数量满足实验需求为止。产物的数量满足实验需求为止。产物的数量满足实验需求为止。本讲稿第十五页，共二十四页Reaction Condition for a Typical PCR AssayReaction Condition for a Typical PCR Assay本讲稿第十六页，共二十四页Typical PCR Thermal ProfileTypical PCR Thermal Profile*This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow*This cycle is

10、normally included in a PCR assay in order to allow any“unfinished”product from previous amplification to achieve its any“unfinished”product from previous amplification to achieve its full lengthfull length本讲稿第十七页，共二十四页Some DNA Polymerases Used in PCR本讲稿第十八页，共二十四页Characteristics of Taq PolymeraseChar

11、acteristics of Taq Polymerase 本讲稿第十九页，共二十四页n nPCR引物：与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片断。1.其长度通常在1530个核苷酸之间。2.简并引物 atggctant 3.嵌套引物嵌套引物 PCR扩增的长度：2kb本讲稿第二十页，共二十四页n nPCR技术的应用：1.基因组克隆 突变体的鉴定和在PCR过程中有目的的添加核算序列。本讲稿第二十一页，共二十四页本讲稿第二十二页，共二十四页n n反相反相反相反相PCRPCR(reverse PCR)(reverse PCR)与染色体步移与染色体步移与染色体步移与染色体步移本讲稿第二十三页，共二十四页n n不对称PCR(asymmertric PCR)用来制备单链的DNA 特点：两种引物的浓度不同，低浓度的限制引物和高浓度引物，两者浓度相差约100倍。获得单链核苷酸的另一种方法是通过固相支持物作DAN链的特意洗脱。（生物素链霉素包裹的磁珠）本讲稿第二十四页，共二十四页