分析化学中分第六章联用技术PPT讲稿.ppt

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1、分析化学中分第六章联用技术第1页，共82页，编辑于2022年，星期五6.1导言导言随着生命科学、材料科学和环境科学等的发展和需求，复杂样随着生命科学、材料科学和环境科学等的发展和需求，复杂样品体系的分离、分析已成为分析化学的重要研究方向和研究热品体系的分离、分析已成为分析化学的重要研究方向和研究热点之一。点之一。所谓复杂样品体系，不仅仅是指样品中的组分多样性，而且还包所谓复杂样品体系，不仅仅是指样品中的组分多样性，而且还包含完全不同体系的物质共存于一个样品中。含完全不同体系的物质共存于一个样品中。例如：无机与有机化例如：无机与有机化合物共存一体，高分子、大分子与小分子化合物共存一体，生命合物共

2、存一体，高分子、大分子与小分子化合物共存一体，生命与非生命物质共存一体等。如果要对复杂样品体系提供全面、准与非生命物质共存一体等。如果要对复杂样品体系提供全面、准确的结构与成分表征信息，那么其分析过程可能包括从常量到微确的结构与成分表征信息，那么其分析过程可能包括从常量到微量、痕量分析，从成分到结构、形态分析，从总体到微区、表面、量、痕量分析，从成分到结构、形态分析，从总体到微区、表面、空间分布分析，从宏观形貌到微观结构分析，从静态到动态、时空间分布分析，从宏观形貌到微观结构分析，从静态到动态、时间分辨分析，从破坏到非破坏分析等等。因此，为了圆满完成复间分辨分析，从破坏到非破坏分析等等。因此，

3、为了圆满完成复杂样品体系的全分析，需要综合利用包括色谱法和质谱法在内的杂样品体系的全分析，需要综合利用包括色谱法和质谱法在内的多种现代分离、分析方法。多种现代分离、分析方法。联用技术的重要性和必要性！联用技术的重要性和必要性！第2页，共82页，编辑于2022年，星期五本章在简介新质谱方法的同时，也将介绍色本章在简介新质谱方法的同时，也将介绍色谱谱-质谱质谱联用技术联用技术及及接口技术接口技术的发展，还将介的发展，还将介绍各种不同模式和类型的色谱绍各种不同模式和类型的色谱-质谱联用技术质谱联用技术的实现、研究进展及其在生命科学研究领域的实现、研究进展及其在生命科学研究领域中的应用，以及其它联用技

4、术，如电化学中的应用，以及其它联用技术，如电化学光谱，毛细管电泳光谱联用等。光谱，毛细管电泳光谱联用等。第3页，共82页，编辑于2022年，星期五6.2 新质谱法新质谱法6.2.1 质谱学简介及其特点质谱学简介及其特点1906年年J.J.Thomson发明了质谱仪发明了质谱仪(Mass spectroscopy,MS)，但直至但直至1920s左右质谱法才逐渐成为一种分析手段，被化学左右质谱法才逐渐成为一种分析手段，被化学家采用。从家采用。从1940s以后以后MS广泛地应用于有机物质分析。广泛地应用于有机物质分析。1980s末期新软电离技术的发明，能够用于分析高极性、难末期新软电离技术的发明，能

5、够用于分析高极性、难挥发和热不稳定样品之后，生物质谱才发展起来。挥发和热不稳定样品之后，生物质谱才发展起来。常规质谱分析仪的质量范围是几十到常规质谱分析仪的质量范围是几十到2000 da。生物质谱生物质谱(新质谱法新质谱法)是现代分析化学及相关生化研究的热点是现代分析化学及相关生化研究的热点之一和蛋白质组学的主要手段。之一和蛋白质组学的主要手段。第4页，共82页，编辑于2022年，星期五质谱法的特点：质谱法的特点：(1)高灵敏度，可测高灵敏度，可测10-8mol以下物质的量；以下物质的量；(2)快速，数分钟内即可完成测试；快速，数分钟内即可完成测试；(3)能同时提供样品的精确分子质量和结构信息

6、；能同时提供样品的精确分子质量和结构信息；(4)既可用于定性分析，也可用于定量分析；既可用于定性分析，也可用于定量分析；(5)能有效地与各种色谱技术联用，如能有效地与各种色谱技术联用，如GC/MS，HPLC/MS，TLC/MS及及CZE/MS等，用于复杂等，用于复杂 体系分析。体系分析。MS的特点可概括为的特点可概括为4个个S:灵敏灵敏(sensitivity)、快速、快速(speed)、专一、专一(specificity)、化学计量、化学计量(stoichiometry)。第5页，共82页，编辑于2022年，星期五在过去的几十年中，生物质谱的主要进展在于解决如在过去的几十年中，生物质谱的主要

7、进展在于解决如何测定大质量分子质荷比何测定大质量分子质荷比m/z及其相关的问题，主要的及其相关的问题，主要的研究领域包括：研究领域包括：(1)如何扩大质谱仪器的质量范围？如何扩大质谱仪器的质量范围？(2)如何使生物大分子电离和使其带多电荷如何使生物大分子电离和使其带多电荷(即降低即降低m/z)？(3)如何解释大质量分子质谱？如何解释大质量分子质谱？(4)如何发展生物大分子质谱测定方法？如何发展生物大分子质谱测定方法？Fred M.McLafferty et al,Science,2006,314,109-112报道了采用报道了采用MS可研究质量大于可研究质量大于200 Kda的蛋白质！的蛋白质

8、！第6页，共82页，编辑于2022年，星期五与质谱相关而获得诺贝尔奖的有：与质谱相关而获得诺贝尔奖的有：J.J.Thomson(物理物理1906，发明质谱技术并用于研究，发明质谱技术并用于研究气体的电导气体的电导)；F.W.Aston(化学化学1922，用质谱仪发现了非放射性元，用质谱仪发现了非放射性元素的同位素素的同位素)；W.Paul(物理物理1980，发明离子阱质谱原理与技术，发明离子阱质谱原理与技术)；R.F.Curl、R.E.Smalley和和H.W.Kroto(化学化学1996，用，用质谱仪观察到激光轰击下产生的质谱仪观察到激光轰击下产生的C60)；K.Tanaka(田中耕一田中耕

9、一)和和J.B.Fenn(化学化学2002，发明，发明MALDI-MS和和ESI-MS技术技术)。第7页，共82页，编辑于2022年，星期五生物质谱的最基本用途是能够测量多肽生物质谱的最基本用途是能够测量多肽/蛋白质蛋白质/核酸等生物大分核酸等生物大分子的分子质量，并间接推测它的结构及相互作用。子的分子质量，并间接推测它的结构及相互作用。1994年蛋白质组学第一次被提出年蛋白质组学第一次被提出(Marc Wilkins)，随后生物质谱，随后生物质谱被确认为蛋白质组学技术平台的重要组成部分，认识到生物质谱被确认为蛋白质组学技术平台的重要组成部分，认识到生物质谱另一吸引人之处是可以取代另一吸引人之

10、处是可以取代Edman降解测序方法，了解蛋白生成降解测序方法，了解蛋白生成的早期结构域，以及可以鉴定翻译后修饰的能力。另外，生物质的早期结构域，以及可以鉴定翻译后修饰的能力。另外，生物质谱还可以用来测定非共价键作用如抗体谱还可以用来测定非共价键作用如抗体-抗原结合作用。抗原结合作用。2001以后，随着基因组测序计划的完成，蛋白质组学的规模化以后，随着基因组测序计划的完成，蛋白质组学的规模化已成定局，生物质谱正在发挥着不可取代的中坚作用。已成定局，生物质谱正在发挥着不可取代的中坚作用。蛋白质组学的研究之所以能够蓬勃发展，主要依赖于高通量分离蛋白质组学的研究之所以能够蓬勃发展，主要依赖于高通量分离

11、和分析技术的突破性进展。首先是质谱技术，尤其是软电离技术和分析技术的突破性进展。首先是质谱技术，尤其是软电离技术的发展和双向的发展和双向(二维二维)凝胶电泳技术的完善，使得蛋白质的大范围凝胶电泳技术的完善，使得蛋白质的大范围高通量分析成为可能。高通量分析成为可能。蛋白质组学蛋白质组学(Proteomics)生物质谱！生物质谱！第8页，共82页，编辑于2022年，星期五Proteomics is the study of the proteome,the protein complement of the genome.The terms”proteomics”and“proteome”were

12、 coined by Marc Wilkins and colleagues in the early 1990s and mirror the terms“genomics”and“genome”,which describe the entire collection of genes in an organism.Introduction to Proteomics,Daniel Liebler.2002,Humana Press蛋白质组学目前面临的最大挑战是什么？蛋白质组学目前面临的最大挑战是什么？第9页，共82页，编辑于2022年，星期五6.2.2 各种质谱技术各种质谱技术质谱仪的一

13、般结构框图如图质谱仪的一般结构框图如图6.1所示。质谱分析是一个制备样品所示。质谱分析是一个制备样品或从其他分析仪器引入样品或从其他分析仪器引入样品样品气化并离子化样品气化并离子化引入样品离引入样品离子到分析器子到分析器在分析器中按照离子的质荷比不同分离离子在分析器中按照离子的质荷比不同分离离子分分别检测各种离子并得到质谱图的过程。别检测各种离子并得到质谱图的过程。图图6.1 质谱仪器组成示意图质谱仪器组成示意图第10页，共82页，编辑于2022年，星期五质谱仪的核心是质谱仪的核心是离子源离子源和和分析器分析器，其他的部分一般，其他的部分一般根据离子源和分析器相应地配备。根据离子源和分析器相应

14、地配备。离子源多种多样，工作在离子源多种多样，工作在真空状态下真空状态下的有：电子轰的有：电子轰击源击源(electron bombardment,EB)、化学离子源、化学离子源(chemical Ionization,CI)、真空火花源、真空火花源(spark source,SS)、激光表面解析源、激光表面解析源(laser desorption,LD)等；工作等；工作在低压下的有辉光放电离子源在低压下的有辉光放电离子源(glow discharge,GD)；工作在大气压下的有电工作在大气压下的有电(离子离子)喷雾喷雾(electron/ion spray,E/IS)、电感耦合等离子体源、电

15、感耦合等离子体源(inductively coupled plasma,ICP)等。等。第11页，共82页，编辑于2022年，星期五分析器类型主要有：磁偏转、四极杆、离子阱、分析器类型主要有：磁偏转、四极杆、离子阱、飞行时间、离子回旋共振等。飞行时间、离子回旋共振等。不同的分析器与离子源之间有多种组合，构成了不同的分析器与离子源之间有多种组合，构成了质谱仪器庞大的家族。质谱仪器庞大的家族。二维质谱：二维质谱：两种不（相）同类型的质谱串联在一两种不（相）同类型的质谱串联在一起可形成二维质谱。例如起可形成二维质谱。例如Q-TOF MS,QQ-TOF MS,TOF-TOF MS以及以及MSn等。等。

16、二维质谱在提高分析灵敏度、通量等方面具有特殊二维质谱在提高分析灵敏度、通量等方面具有特殊的优点，是蛋白质组大规模筛选的的优点，是蛋白质组大规模筛选的首选工具首选工具。第12页，共82页，编辑于2022年，星期五6.2.3 大分子电离技术大分子电离技术由于生物样品的非挥发性、热不稳定性及相对分子质量大等特性，由于生物样品的非挥发性、热不稳定性及相对分子质量大等特性，使传统的电子轰击使传统的电子轰击(EI)、化学离子源、化学离子源(CI)等电离技术的应用受到等电离技术的应用受到极大限制。随着极大限制。随着FAB、MALDI、ESI、ISI、大气压下碰撞电离、大气压下碰撞电离(APCI)等电离技术的

17、出现，大大提高了质谱的测定范围，改善了等电离技术的出现，大大提高了质谱的测定范围，改善了测量灵敏度，并在一定程度上解决了溶剂分子干扰等问题，使质测量灵敏度，并在一定程度上解决了溶剂分子干扰等问题，使质谱在生物分析中的应用得到进一步的发展。谱在生物分析中的应用得到进一步的发展。表表6.1 生物质谱电离技术比较生物质谱电离技术比较第13页，共82页，编辑于2022年，星期五目前用于生物大分子质谱分析的软电离质谱技术如下目前用于生物大分子质谱分析的软电离质谱技术如下：(1)电喷雾电离质谱电喷雾电离质谱(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)

18、;(2)基体辅助激光解吸电离质谱基体辅助激光解吸电离质谱(matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry,MALDI-MS)；(3)快原子轰击质谱快原子轰击质谱(fast atom bombardment mass spectrometry,FAB-MS)；(4)离子喷雾电离质谱离子喷雾电离质谱(ion spray ionization mass spectrometry,ISI-ISI-MS)；(5)大气压电离质谱大气压电离质谱(atmospheric pressure ionization mass spectro

19、metry,API-MS)；(6)解吸电喷雾电离质谱解吸电喷雾电离质谱(desorption electrospray ionization mass spectrometry,DESI-MS)。第14页，共82页，编辑于2022年，星期五6.2.4 基体辅助激光解吸电离基体辅助激光解吸电离MALDI离子源可以电离分子质量为离子源可以电离分子质量为100-1000000Da的生的生物分子并用于质谱分析，提供了高的灵敏度、高的离子物分子并用于质谱分析，提供了高的灵敏度、高的离子透过率和强的可操作性。透过率和强的可操作性。MALDI之所以得到发展，得之所以得到发展，得益于早期试验用激光解吸及等离子

20、体解吸生物有机分子益于早期试验用激光解吸及等离子体解吸生物有机分子的成功，也得益于的成功，也得益于FAB生物基质的进展。生物基质的进展。1990s在日本和在日本和德国几乎同时报道了德国几乎同时报道了60000Da分子质量的蛋白质的电离，分子质量的蛋白质的电离，引起全球的关注和兴趣，并刺激了许多公司致力于开发引起全球的关注和兴趣，并刺激了许多公司致力于开发相关质谱仪，并研究如何用相关质谱仪，并研究如何用MALDI技术分析蛋白质、技术分析蛋白质、多肽及多肽及DNA。第15页，共82页，编辑于2022年，星期五MALDI是是1988年由年由Hillenkamp 和和Micheal Karas等首等首

21、先提出的，其原理同先提出的，其原理同FAB类似。它利用激光束照射分类似。它利用激光束照射分散于基体中的样品，由于这些基体（质）能够强烈吸散于基体中的样品，由于这些基体（质）能够强烈吸收激光，从而保护了样品分子。收激光，从而保护了样品分子。图图6.2 MALDI技术原理示意图技术原理示意图第16页，共82页，编辑于2022年，星期五激光光束的能量首先被基体中的发色团吸收，随后这些激光光束的能量首先被基体中的发色团吸收，随后这些基体迅速蒸发为气相，被包含的样品分子被带入气相，基体迅速蒸发为气相，被包含的样品分子被带入气相，而离子化的产生是由于受激的基体分子将质子转移给样而离子化的产生是由于受激的基

22、体分子将质子转移给样品分子。这样离子被引入质量分析器，测量品分子。这样离子被引入质量分析器，测量m/z得到质得到质谱图，并提供其离子同位素的分布信息。谱图，并提供其离子同位素的分布信息。MALDI-MS的实验参数包括：的实验参数包括：基体和基体基体和基体/分析物，激光功率，波长，脉冲宽度及记录分析物，激光功率，波长，脉冲宽度及记录模式模式(正离子或负离子正离子或负离子)。N2激光由于在激光由于在UV段段(337nm)有较好的性能，而被广泛应有较好的性能，而被广泛应用于用于MALDI仪器中。仪器中。第17页，共82页，编辑于2022年，星期五MALDI中的基体起着如下几种重要作用：中的基体起着如

23、下几种重要作用：（1）基体相当于样品分子的）基体相当于样品分子的溶剂溶剂，样品分子被基体，样品分子被基体彼此分开，从而消弱了样品之间的相互作用；彼此分开，从而消弱了样品之间的相互作用；（2）基体分子从脉冲激光中吸收足够的能量，隔离）基体分子从脉冲激光中吸收足够的能量，隔离样品分子，提供光激发的酸或减基团，以及在离子样品分子，提供光激发的酸或减基团，以及在离子-分子碰撞中电离样品分子。分子碰撞中电离样品分子。第18页，共82页，编辑于2022年，星期五选择选择MALDI的基体主要要求如下：的基体主要要求如下：(1)对激光有高的吸收系数；对激光有高的吸收系数；(2)与样品能够溶于同一种溶剂中；与样

24、品能够溶于同一种溶剂中；(3)具有真空稳定性；具有真空稳定性；(4)对普遍存在于生物溶液中的无机盐及缓冲液等对普遍存在于生物溶液中的无机盐及缓冲液等 污染物具有包容性。污染物具有包容性。常用的基体有：常用的基体有：芥子酸芥子酸(SA)，2,5-二羟基苯甲酸，咖啡酸，吡臻酸，二羟基苯甲酸，咖啡酸，吡臻酸，安息香酸，尼古丁酸等。安息香酸，尼古丁酸等。第19页，共82页，编辑于2022年，星期五MALDI-MS在基体选定后，准备样品的方法有两种：在基体选定后，准备样品的方法有两种：(1)Tanaka法：法：1987年年 Tanaka等把待测的生物样品溶于甘油中，并与很细的金属粉等把待测的生物样品溶于

25、甘油中，并与很细的金属粉末混合，然后把悬浮液滴到探头上，让激光照射，再进入质谱分末混合，然后把悬浮液滴到探头上，让激光照射，再进入质谱分析。灵敏度析。灵敏度10-9 mol数量级。数量级。(2)Hillenkamp法：法：1988年年 Hillenkamp等认为激光解吸时是底物吸收激光，提出了等认为激光解吸时是底物吸收激光，提出了“基体辅助激光解吸基体辅助激光解吸”的概念。将烟酸和生物样品混合溶液滴到的概念。将烟酸和生物样品混合溶液滴到探头上，干燥后，用激光照射，即可得到生物分子离子信号。探头上，干燥后，用激光照射，即可得到生物分子离子信号。灵敏度灵敏度10-12 mol数量级，且信号强，信噪

26、比高，被广泛采用。数量级，且信号强，信噪比高，被广泛采用。问题：为什么问题：为什么Tanaka获得了获得了Nobel 化学奖，而非化学奖，而非Hillenkamp?第20页，共82页，编辑于2022年，星期五MALDI的优缺点：的优缺点：优点：优点：对样品要求低，能耐高浓度盐、缓冲剂对样品要求低，能耐高浓度盐、缓冲剂和其他非挥发性成分。高灵敏度，样品量只需和其他非挥发性成分。高灵敏度，样品量只需要要1pmol，甚至更少。，甚至更少。缺点：缺点：大质量离子检测较困难。离子型表面活大质量离子检测较困难。离子型表面活性剂和低挥发性溶剂干扰严重，和其他进样技性剂和低挥发性溶剂干扰严重，和其他进样技术联

27、用困难等。术联用困难等。第21页，共82页，编辑于2022年，星期五MALDI可以与不同类型的检测器相互结合，特别是可以与不同类型的检测器相互结合，特别是飞行飞行时间质谱时间质谱(TOF)，即，即MALDI-TOF质谱！质谱！图6.3 The Agilent Pulsed Dynamic Focusing MALDI(PDF-MALDI)第22页，共82页，编辑于2022年，星期五图图6.4 MALDI-TOF-MS的实际图的实际图第23页，共82页，编辑于2022年，星期五MALDI-TOF MS中样品离子化中样品离子化将将TOF谱图转化为常规谱图转化为常规谱图谱图第24页，共82页，编辑于

28、2022年，星期五图图6.5 The MALDI-TOF Spectra for Poly(Propylene Glycol)第25页，共82页，编辑于2022年，星期五摘自：Anal.Chem.,2004,76,1532-1536.RichardB.vanBreemanetal图图6.6第26页，共82页，编辑于2022年，星期五6.2.5 大气压电离质谱方法大气压电离质谱方法API-MS指在大气压下使样品有效地电离并引入与质谱的指在大气压下使样品有效地电离并引入与质谱的接口，再进行质谱分析。接口，再进行质谱分析。API-MS的工作模式：的工作模式：(1)电喷雾电喷雾(ESI)；(2)气动辅

29、助电喷气动辅助电喷雾雾(又称离子喷雾又称离子喷雾,IS)；(3)大气压碰撞电离大气压碰撞电离(APCI)；（；（4）解吸电喷雾电离质谱解吸电喷雾电离质谱(desorption electrospray ionization Mass spectrometry,DESI-MS)。API-MS 可以测定的分子可以测定的分子质量范围是质量范围是100100000Da，精度很容易达到飞克级至皮，精度很容易达到飞克级至皮克级的绝对灵敏度，可适用的化合物的范围非常广泛。可克级的绝对灵敏度，可适用的化合物的范围非常广泛。可与四极杆、离子阱、飞行时间质谱等组合。与四极杆、离子阱、飞行时间质谱等组合。可与许多进

30、样可与许多进样技术兼容技术兼容，如，如FIA,HPLC,CE等。等。第27页，共82页，编辑于2022年，星期五API-MS的四种工作模式的特点：的四种工作模式的特点：(1)电喷雾电喷雾(ESI)：离子化过程应用电场来产生带电液滴，然后：离子化过程应用电场来产生带电液滴，然后 通过离子蒸发将分析物离子送入通过离子蒸发将分析物离子送入MS分析。分析。(2)气动辅助电喷雾：具有上述电喷雾的特点，但最初的液滴气动辅助电喷雾：具有上述电喷雾的特点，但最初的液滴 形成是由辅气形成是由辅气(如如N2)帮助雾化的结果。帮助雾化的结果。(3)大气压化学大气压化学(碰撞碰撞)电离：利用一种气态化学反应，气体溶剂

31、电离：利用一种气态化学反应，气体溶剂 (如如CH4)作为化学离子源来电离样品。作为化学离子源来电离样品。(4)解吸电喷雾电离解吸电喷雾电离 DESI)：是在2004年所發展出來的新电离法。利用探針產生帶電液滴，接著利用高速氮氣流的攜帶來撞擊分析物表面，而從分析物表面所形成的離子再進入質譜儀作分析。第28页，共82页，编辑于2022年，星期五电喷雾的电离机理电喷雾的电离机理图图6.7 电喷雾原理示意图电喷雾原理示意图第29页，共82页，编辑于2022年，星期五电喷雾的电离机理电喷雾的电离机理(1)小分子离子蒸发机理：在喷针针头与施加电压的电极之间形成小分子离子蒸发机理：在喷针针头与施加电压的电极

32、之间形成 强电场该电场使液体带电，带电的液体在电场的作用下向带相强电场该电场使液体带电，带电的液体在电场的作用下向带相 反电荷的电极运动，并形成带电的液滴，由于小雾滴易分散，反电荷的电极运动，并形成带电的液滴，由于小雾滴易分散，比表面增大，在电场中迅速蒸发，结果使带电雾滴表面单位面比表面增大，在电场中迅速蒸发，结果使带电雾滴表面单位面 积的场强度高达积的场强度高达10 x108 V/cm2，从而产生液滴的，从而产生液滴的“爆裂爆裂”。重。重复该过程，最终产生分子离子。复该过程，最终产生分子离子。(2)大分子带电残基机理：首先也是电场使溶液带电而离子化，结大分子带电残基机理：首先也是电场使溶液带

33、电而离子化，结 果形成带电雾滴，带电的雾滴在电场作用下运动并迅速去溶，果形成带电雾滴，带电的雾滴在电场作用下运动并迅速去溶，溶液中分子所带电荷在去溶时被保留在分子上，结果形成离子溶液中分子所带电荷在去溶时被保留在分子上，结果形成离子 化的分子。化的分子。第30页，共82页，编辑于2022年，星期五ESI电离的一个主要特点是可以在大气压下蒸发样电离的一个主要特点是可以在大气压下蒸发样品，离子化过程温和，产生碎片极少，是一种软电品，离子化过程温和，产生碎片极少，是一种软电离方法。离方法。ESI通常可以得到多电荷分子离子，这对通常可以得到多电荷分子离子，这对于测量大分子意义重大。由于大分子可以带于测

34、量大分子意义重大。由于大分子可以带10100以上电荷，因此，其质荷比大大降低，可用普通质以上电荷，因此，其质荷比大大降低，可用普通质量测定范围的质谱仪进行生物大分子分析。量测定范围的质谱仪进行生物大分子分析。第31页，共82页，编辑于2022年，星期五图图6.8 电喷雾离子化过程示意图电喷雾离子化过程示意图第32页，共82页，编辑于2022年，星期五电喷雾的一般理论电喷雾的一般理论ESI放电电压放电电压(V0)与表面张力与表面张力(Ts)、毛细管半径、毛细管半径(r)及及针尖与采样板间距离针尖与采样板间距离(h)的关系可用下式表示：的关系可用下式表示：(6.1)在实验中虽然并不用它来进行计算，

35、但却可以定性地在实验中虽然并不用它来进行计算，但却可以定性地帮助理解电喷雾的条件。帮助理解电喷雾的条件。第33页，共82页，编辑于2022年，星期五ESI产生多电荷离子，在电离过程中，喷雾中颗粒带产生多电荷离子，在电离过程中，喷雾中颗粒带电荷数电荷数q为：为：(6.2)式中：式中：表示溶液的表面张力常数表示溶液的表面张力常数 o表示介电常数表示介电常数 rs表示液滴的半径表示液滴的半径电喷雾离子一般每多电喷雾离子一般每多1000相对分子质量可以多带一相对分子质量可以多带一个电荷。个电荷。第34页，共82页，编辑于2022年，星期五影响影响ESI过程的因素过程的因素由于电喷雾过程非常复杂，影响因

36、素有：由于电喷雾过程非常复杂，影响因素有：(1)离子化与否主要与被分析分子的离子化与否主要与被分析分子的pKa值和溶液的值和溶液的 pH有关；有关；(2)喷雾状态与表面张力和黏度有关，另外，与是否喷雾状态与表面张力和黏度有关，另外，与是否 有气动辅助喷雾也有关有气动辅助喷雾也有关(喷雾量较大时喷雾量较大时)；(3)去溶好坏与干燥气体的温度和流量有关，并与溶去溶好坏与干燥气体的温度和流量有关，并与溶 剂的蒸发热剂的蒸发热 Hvap有关；有关；(4)离子的解吸与它的溶解热离子的解吸与它的溶解热(气态气态)有关；有关；(5)气相反应与质子亲和势和电荷交换速度有关。气相反应与质子亲和势和电荷交换速度有

37、关。第35页，共82页，编辑于2022年，星期五ESI电离的优点：电离的优点：(1)被检测分子变成气相离子时没有受到外部能量的激发，因被检测分子变成气相离子时没有受到外部能量的激发，因而不会发生裂解，没有碎片峰，因此谱图解析相对简单；而不会发生裂解，没有碎片峰，因此谱图解析相对简单；(2)对于多级质谱，通过碰撞诱导裂解（对于多级质谱，通过碰撞诱导裂解（CID）可以产生碎片，）可以产生碎片，从而提供分子的结构信息。电喷雾质谱不仅能够产生多电荷离从而提供分子的结构信息。电喷雾质谱不仅能够产生多电荷离子、对某些极性物质电离效率高（对蛋白质接近子、对某些极性物质电离效率高（对蛋白质接近100%），而）

38、，而且具有软电离等特性，因而成为极性化合物（包括溶液中的离且具有软电离等特性，因而成为极性化合物（包括溶液中的离子），热稳定性差和高分子量化合物分析最有效的工具之一。子），热稳定性差和高分子量化合物分析最有效的工具之一。(3)在常规电喷雾电离技术中，喷雾过程容易形成较大液滴，液在常规电喷雾电离技术中，喷雾过程容易形成较大液滴，液滴中的样品分子不能完全离子化，因而降低了样品的利用率和滴中的样品分子不能完全离子化，因而降低了样品的利用率和质谱检测灵敏度。近几年发展起来的纳升电喷雾方法质谱检测灵敏度。近几年发展起来的纳升电喷雾方法(Nanospray)，采用内径为，采用内径为10 m左右的喷针，样品

39、注入到喷针左右的喷针，样品注入到喷针的喷口，在喷口前端产生喷雾，喷雾液滴比常规电喷雾产生的的喷口，在喷口前端产生喷雾，喷雾液滴比常规电喷雾产生的小小100倍，这样可以使样品被充分利用，并有效离子化。与常规倍，这样可以使样品被充分利用，并有效离子化。与常规电喷雾电离技术相比，电喷雾电离技术相比，Nanospray流量极低，样品消耗量极少，流量极低，样品消耗量极少，灵敏度可以达到灵敏度可以达到fmol。第36页，共82页，编辑于2022年，星期五图图6.9 电喷雾质谱仪电喷雾质谱仪第37页，共82页，编辑于2022年，星期五图图6.10 典型的电喷雾质谱图典型的电喷雾质谱图第38页，共82页，编辑

40、于2022年，星期五6.3液相色谱质谱联用液相色谱质谱联用作为化学领域最强有力的分离分析技术之一，自上世纪作为化学领域最强有力的分离分析技术之一，自上世纪70年代以年代以来，液相色谱来，液相色谱(LC)，特别是高效液相色谱（，特别是高效液相色谱（HPLC）得到了迅速）得到了迅速的发展，无论在色谱基础理论，还是在仪器性能方面都得到了很的发展，无论在色谱基础理论，还是在仪器性能方面都得到了很大程度的提高和完善。随着应用领域的不断拓展，大程度的提高和完善。随着应用领域的不断拓展，LC在环境分在环境分析、生化分析、医药分析和药物质量控制等方面的应用也越来越析、生化分析、医药分析和药物质量控制等方面的应

41、用也越来越广泛，尤其是随着生命科学研究的不断深入，广泛，尤其是随着生命科学研究的不断深入，LC已经成为一种已经成为一种极为重要和必不可少的分离分析手段。极为重要和必不可少的分离分析手段。LC虽然在复杂样品分析中显示出很高的分离效率，而且定量准虽然在复杂样品分析中显示出很高的分离效率，而且定量准确，但其确，但其定性分析能力却较为薄弱定性分析能力却较为薄弱，通常仅仅是根据各组分的，通常仅仅是根据各组分的保留特性来定性，这在复杂样品分析中，尤其在未知组分的定性保留特性来定性，这在复杂样品分析中，尤其在未知组分的定性分析中具有一定的难度（可信度差和无标准品）。分析中具有一定的难度（可信度差和无标准品）

42、。6.3.1 概述概述第39页，共82页，编辑于2022年，星期五然而，随着一些新的定性分析手段的出现，尤其是质谱仪器的然而，随着一些新的定性分析手段的出现，尤其是质谱仪器的发展，对一些组分相对简单的样品进行定性分析已经变得比较发展，对一些组分相对简单的样品进行定性分析已经变得比较容易。容易。质量是物质的固有特征之一质量是物质的固有特征之一，质谱分析中，表现为不同荷质比，质谱分析中，表现为不同荷质比的化合物对应不同的离子谱峰，由此，根据质谱分析结果可以的化合物对应不同的离子谱峰，由此，根据质谱分析结果可以获得被分析物的分子量，从而实现对各物质进行定性分析，另获得被分析物的分子量，从而实现对各物

43、质进行定性分析，另外，离子谱峰的强度与其所代表的化合物含量有一定关系，所外，离子谱峰的强度与其所代表的化合物含量有一定关系，所以，利用这一点可以对各物质进行半定量分析。以，利用这一点可以对各物质进行半定量分析。质谱分析虽然具有灵敏度高、鉴别能力强等优点，但是由于离质谱分析虽然具有灵敏度高、鉴别能力强等优点，但是由于离子抑制效应等的影响在复杂样品定性分析中却具有一定困难。子抑制效应等的影响在复杂样品定性分析中却具有一定困难。由此可以看出，如果把由此可以看出，如果把LC分离和质谱分析有机结合起来，充分分离和质谱分析有机结合起来，充分发挥它们各自的优点，取长补短，就可以有效的对复杂样品进发挥它们各自

44、的优点，取长补短，就可以有效的对复杂样品进行定性和定量分析，因此，行定性和定量分析，因此，LC-质谱联用技术逐渐被广大科研质谱联用技术逐渐被广大科研工作者所关注。工作者所关注。第40页，共82页，编辑于2022年，星期五液相色谱液相色谱-质谱联用技术的研究始于质谱联用技术的研究始于20世纪世纪70年代，年代，90年代以后，由于大气压电离技术的出现和成功年代以后，由于大气压电离技术的出现和成功应用以及质谱本身的发展，液相色谱与质谱的联应用以及质谱本身的发展，液相色谱与质谱的联用得到了极大的重视和发展。液相色谱用得到了极大的重视和发展。液相色谱-质谱联用质谱联用技术将液相色谱的技术将液相色谱的高分

45、离效能和质谱的高灵敏度高分离效能和质谱的高灵敏度及较强的结构解析能力及较强的结构解析能力有机的结合在一起，样品有机的结合在一起，样品经过液相色谱分离后，借助质谱分析结果进行鉴经过液相色谱分离后，借助质谱分析结果进行鉴定，开辟了复杂样品分离和检测的新天地。定，开辟了复杂样品分离和检测的新天地。第41页，共82页，编辑于2022年，星期五串联质谱（串联质谱（MS/MS，Tandem MS,MSn）技术是）技术是质谱分析中的重要联用技术，不仅可以给出样品质谱分析中的重要联用技术，不仅可以给出样品分子量的相关信息，而且还可以给出有关样品结分子量的相关信息，而且还可以给出有关样品结构的丰富信息。串联质谱

46、（构的丰富信息。串联质谱（MS/MS）技术包括三）技术包括三个过程：即用来进行质量分离的第一级质谱个过程：即用来进行质量分离的第一级质谱（MS1），碰撞活化离解和用来进行质谱检测的），碰撞活化离解和用来进行质谱检测的第二级质谱（第二级质谱（MS2）。其中碰撞活化离解是使运）。其中碰撞活化离解是使运动中的离子和中性惰性气体进行碰撞、继而发生动中的离子和中性惰性气体进行碰撞、继而发生碰撞活化离解的过程。碰撞活化离解的过程。第42页，共82页，编辑于2022年，星期五另外，液相色谱与单级质谱联用（另外，液相色谱与单级质谱联用（LC-MS）虽然已经具有足够高的灵敏度，但是仅能提虽然已经具有足够高的灵敏

47、度，但是仅能提供分子量信息，而液相色谱与多级质谱联用供分子量信息，而液相色谱与多级质谱联用（LC-MS/MS）则可提供分子结构的信息，）则可提供分子结构的信息，此外，通过此外，通过MS/MS的选择反应控制模式的选择反应控制模式(SRM)或多反应检测模式或多反应检测模式(MRM)可以提高可以提高信噪比，在复杂样品分析时仍可达到很高的信噪比，在复杂样品分析时仍可达到很高的灵敏度。灵敏度。第43页，共82页，编辑于2022年，星期五6.3.2 液相色谱液相色谱-质谱联用接口技术质谱联用接口技术例如例如HPLC与与MS接口的主要问题接口的主要问题（1）HPLC流出物如果全部流出物如果全部气化，可产生气

48、化，可产生5001000 mL/min的气体，而的气体，而MS采样仅能接受采样仅能接受1050 mL/min的气体；（的气体；（2）通用的气相电离方法一般不适用）通用的气相电离方法一般不适用于于HPLC分离后的化合物（具有热不稳定性、极性和较高分子分离后的化合物（具有热不稳定性、极性和较高分子量）。量）。为实现液相色谱与质谱的联用，需要解决液相色谱流动相对为实现液相色谱与质谱的联用，需要解决液相色谱流动相对质谱工作条件的影响的问题，为此可以通过以下两个途径实质谱工作条件的影响的问题，为此可以通过以下两个途径实现：现：一是发展不同接口以协调一是发展不同接口以协调LC和和MS的不同要求；的不同要求

49、；二是改进液相色谱技术，如发展微柱液相色谱，减少进入质二是改进液相色谱技术，如发展微柱液相色谱，减少进入质谱流动相的量，改进质谱的离子化方法，使它们两者之间逐谱流动相的量，改进质谱的离子化方法，使它们两者之间逐渐靠近。渐靠近。第44页，共82页，编辑于2022年，星期五液相色谱液相色谱-质谱联用的实现，质谱联用的实现，接口技术接口技术一度成为其发展一度成为其发展的瓶颈。在接口研制方面，前后共发展了的瓶颈。在接口研制方面，前后共发展了20多种技术，多种技术，其中主要有直接导入接口（其中主要有直接导入接口（DLI）、移动带接口）、移动带接口（MB）、热喷雾接口（）、热喷雾接口（ES）、粒子束接口（

50、）、粒子束接口（PB）、）、和快原子轰击（和快原子轰击（FAB）等，但这些技术都不同程度的）等，但这些技术都不同程度的存在一些方面的限制和缺陷。近几年来，随着一系列存在一些方面的限制和缺陷。近几年来，随着一系列质谱软电离技术的实现和发展，尤其是随着大气压离质谱软电离技术的实现和发展，尤其是随着大气压离子化接口子化接口(API)技术和基体辅助激光解吸离子化接口技术和基体辅助激光解吸离子化接口（MALDI）技术的不断成熟和完善，液相色谱）技术的不断成熟和完善，液相色谱-质谱质谱联用技术不仅得到了突破性的进展，而且在生命科学联用技术不仅得到了突破性的进展，而且在生命科学中的应用也得到了前所未有的拓展