【精品】分子克隆工具酶精品ppt课件.ppt

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1、分子克隆工具酶Chapter7 分子克隆工具酶分子克隆工具酶1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(特异性切割特异性切割)2.甲基化酶甲基化酶(DNA分子的甲基化分子的甲基化)3.DNA聚合酶聚合酶(合成合成DNA)4.其他分子克隆工具酶其他分子克隆工具酶(细胞破壁、细胞破壁、核酸纯化等核酸纯化等)第一节第一节 限制性内切酶限制性内切酶1.限制与修饰现象限制与修饰现象2.限制酶的发现限制酶的发现3.命名：命名：4.宿主宿主属名属名第一个字母第一个字母(大写大写)5.+种名种名头两个字母头两个字母(小写小写)6.+菌株菌株号号7.+罗马序号罗马序号一、限制与修饰一、限制与修饰the 1st suc

2、h enzyme foundEscherichia coli Species categoryR13strainHow to name a restriction endonuclease?EcoRI限制性内切核酸酶的命名限制性内切核酸酶的命名名名 称称 属名属名 种名种名 株名株名 序数序数 来源菌株来源菌株EcoRI E co R I Escherichia coli RHindIII H in d III Haemophilus influenzaeHindII H in d II Haemophilus influenzaeHindI H in d I Haemophilus infl

3、uenzaeREBASE(The Restriction Enzyme Database)http:/New England Biolabsds-DNA结构结构:切口切口,缺口缺口,断口断口缺口缺口(gap)切口切口(nick)断口断口(cut)3HO P53HO P51、限制酶识别序列的长度、限制酶识别序列的长度 一一般般4-8bp，常常见见6bp，当当识识别别序序列列为为4或或者者6bp时时，他他们们可可识识别别的的序序列列在在完完全全随随机机的的情情况况下下，平平均均每每44=256和和46=4096bp中中会会出出现现一一个个识识别别位点。位点。2、限制酶识别序列的结构、限制酶识别序列

4、的结构 一般为回文对称结构一般为回文对称结构 EcoRI：G AATTC CTTAA G3、限制酶切割的位置：大多在内部，也有在外部、限制酶切割的位置：大多在内部，也有在外部二、限制酶识别的序列二、限制酶识别的序列 nConsider a linear DNA molecule with 6 copies of GAATTC:nit will be cut into 7 fragments which could be separated by the gel electrophoresis.(The largest fragment)(The smallest fragment)digest

5、ion of a DNA fragment with endonuclease EcoRIA given molecule will generate a characteristic series of pattern when digested with a set of different enzymes.e.g.the combination of EcoRI+HindIIIUse of multiple REs allows different regions of a DNA molecule to be isolated1、匹配黏端、匹配黏端(matched end)识识别别位位

6、点点为为回回文文对对称称结结构构，产产生生的的末末端端为为匹匹配配黏黏端端(黏黏性性末末端端，cohesive end)，形成的两个末端是相同的，也是互补的。形成的两个末端是相同的，也是互补的。2、平末端、平末端(Blunt end)在在回回文文对对称称轴轴上上同同时时切切割割DNA的的两两条条链链，则产生平末端。则产生平末端。三、限制酶切割产生的末端三、限制酶切割产生的末端(1)Restriction enzymes differ in the recognition specificity:target sites are different.(2)Restriction enzymes

7、differ in the length they recognized,and thus the frequencies differ.Differences of REs(3)Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate:blunt/flush ends(平末端平末端),sticky/staggered ends(粘性末端粘性末端).(4)Restriction enzymes differ in the cleavage activity.Differences of REssticky en

8、ds(粘性末端粘性末端)blunt ends(平末端平末端)Recognition sequences and cut sites of various endonucleasesCleavage of an EcoRI site.The 5 protruding ends are said to be“sticky”because they readily anneal through base-pairing to DNA molecules cut with the same enzyme许许多多限限制制酶酶切切割割DNA产产生生非非对对称称突突出出端端。当当识识别别序序列列为为非非对对

9、称称序序列列时时，切切割割的的DNA产产物物的的末末端端是是 不不 同同 的的，如如 BbvC，它它 的的 识识 别别 切切 割割 位位 点点CCTCAGC GGAGTCG有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几种是非对称的。如种是非对称的。如Acc，它的识别切割位点如，它的识别切割位点如下，下，GTAT/CGAC CATA/GCTG3、非对称突出末端、非对称突出末端(1)同序同切酶同序同切酶这些酶识别序列和切割位置都相同。这些酶识别序列和切割位置都相同。Hind与与Hinc 识别切割位点为识别切割位点为 GTYRAC(Y为为C或或T，R为为A或或G

10、)Hpa与与 Hap 识别切割位点为识别切割位点为 CCGG Mob与与 Sau3A识别切割位点为识别切割位点为 GATC 4、同裂酶、同裂酶(isoschizomer)：识别相同序列的：识别相同序列的限制酶称为同裂酶，但切割位点可能不同。限制酶称为同裂酶，但切割位点可能不同。(2)同序异切酶同序异切酶 Kpn 和和 Acc65 识别的序列是相同的，但它们识别的序列是相同的，但它们的切割位点不同，分别为：的切割位点不同，分别为：Kpn：GGTACC Acc65：GGTACC4、同裂酶、同裂酶(isoschizomer)(3)“同功多位同功多位”许多识别简并序列的限制酶包含许多识别简并序列的限制

11、酶包含了另一种限制酶的功能了另一种限制酶的功能。如如 EcoR识别和切割位点为识别和切割位点为 GAATTC Apo 识别和切割位点为识别和切割位点为 RAATTY后者可识别前者的序列。后者可识别前者的序列。4、同裂酶、同裂酶(isoschizomer)(4)其它有些限制酶识别的序列有交叉其它有些限制酶识别的序列有交叉。如在如在 pUC 系列质粒的多克隆位点中有一个系列质粒的多克隆位点中有一个Sal位点（识别切割位点为位点（识别切割位点为 GTCGAC），该位），该位点也可被点也可被 Acc位点（识别切割位点为位点（识别切割位点为 GTMKAC）和）和Hinc位点（识别切割位点为位点（识别切割

12、位点为GTYRAC）切割。）切割。4、同裂酶、同裂酶(isoschizomer)5、同尾酶、同尾酶(isocaudarner)不同的不同的 限制酶切割限制酶切割DNA产生的末端是相同的，产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可产生相同的黏性末端。且是对称的，即它们可产生相同的黏性末端。BamH I:G GATCCBgl II :A GATCT6、归位内切酶归位内切酶(homing endonuclease)内含子编码的内切酶。内含子编码的内切酶。1、限限制制酶酶切切割割DNA时时对对识识别别序序列列两两端端的的非非识识别别序列有长度的要求。序列有长度的要求。2、酶酶单单位位：在在适适合合的的缓

13、缓冲冲液液及及温温度度下下，在在20l反反应应体体系系中中反反应应1h，使使1gDNA完完全全消消化化所所需需要的酶量。要的酶量。3、在在设设计计PCR引引物物时时，如如果果要要在在末末端端引引入入酶酶切切位位点点，就就需需要要考考虑虑加加上上一一些些满满足足酶酶切切要要求求的的碱碱基基数目。数目。四、四、DNA末端长度对限制酶切割的影响末端长度对限制酶切割的影响 对对同同一一底底物物中中的的有有些些位位点点表表现现出出偏偏爱爱性性切切割割，导导致致其其对对不不同同位位置置的的同同一一个个识识别别序序列列表表现现出不同的切割效率。出不同的切割效率。1、酶切位点对酶的敏感性不同，、酶切位点对酶的

14、敏感性不同，2、在在切切割割相相同同量量的的不不同同DNA时时所所需需要要的的酶酶量是不同的。量是不同的。五、位点偏爱五、位点偏爱(site preference)1.缓冲液：缓冲液：pH、Mg2+、DTT、BSA2.反应温度：大多数反应温度：大多数373.反应时间：反应时间：1-2h4.终终止止酶酶切切的的方方法法：EDTA、加加热热、苯苯酚酚抽提去除蛋白、试剂盒纯化抽提去除蛋白、试剂盒纯化DNA。六、酶切反应条件六、酶切反应条件 在在极极端端非非标标准准条条件件下下，限限制制酶酶能能切切割割与与识识别别序列相似的序列。序列相似的序列。1、引引起起星星星星活活性性的的因因素素：甘甘油油浓浓度

15、度过过高高，酶过量，离子强度低，酶过量，离子强度低，pH过高等。过高等。2、抑抑制制方方法法：减减少少甘甘油油浓浓度度，减减少少酶酶的的用用量量，提提高高离离子子强强度度，降降低低pH，保保证证反反应应体体系无有机溶剂等。系无有机溶剂等。七、星星活性七、星星活性(star activity)l部部分分切切割割双双链链DNA的的酶酶也也可可以以消消化化单单链链，但切割效率不同或降低。但切割效率不同或降低。l某某些些限限制制酶酶只只切切割割双双链链DNA中中的的一一条条链链，产产生生单单链链缺缺口口，即即切切口口酶酶，命命名名时时在在前前面面加上一个加上一个N。八、单链八、单链DNA的切割的切割

16、1、将将产产生生的的5突突出出末末端端补补平平后后，再再连连接接可可产产生生新新的酶切位点。的酶切位点。2、同同尾尾末末端端的的连连接接：不不同同的的同同尾尾酶酶切切割割DNA产产生生的的末末端端再再相相互互连连接接时时，可可产产生生新新的的酶酶切切位位点点，同同时原来的酶切位点消失。时原来的酶切位点消失。3、平末端连接产生新的酶切位点、平末端连接产生新的酶切位点Pvu II(CAGCTG)+EcoR V(GATATC)Mbo I:GATC九、酶切位点的引入九、酶切位点的引入 1、外部因素、外部因素(可预见和控制可预见和控制)反反应应条条件件、底底物物纯纯度度、酶酶量量、反反应应体体积积、反反

17、应时间等应时间等2、内部因素、内部因素星星星星活活性性、底底物物甲甲基基化化和和底底物物的的构构象象(切切割割线性线性DNA和超螺旋和超螺旋DNA的活性差异的活性差异)十、影响酶活性的因素十、影响酶活性的因素 第二节第二节 甲基化酶甲基化酶1、Dam甲基化酶甲基化酶在在GATC序列中的腺嘌呤序列中的腺嘌呤N6位置引入甲基。位置引入甲基。某某些些限限制制酶酶的的识识别别位位点点含含GATC序序列列，对对Dam甲甲基基化的化的DNA敏感，不能切割相应的序列。敏感，不能切割相应的序列。一一般般哺哺乳乳动动物物DNA不不会会在在腺腺嘌嘌呤呤N6上上甲甲基基化化，因因此不受影响。此不受影响。当当需需要要

18、在在这这些些敏敏感感位位点点完完全全切切割割DNA时时，可可利利用用dam型型E.coli扩增并提取扩增并提取DNA。一、甲基化酶的种类一、甲基化酶的种类(methylase)2、Dcm甲甲基基化化酶酶。识识别别CCAGG或或CCTGG序序列列，在在第第二二个个胞胞嘧嘧啶啶C的的C5位位置置引引入入甲甲基基。受受Dcm甲甲基基化化作作用用影影响响的的酶酶有有EcoRII(CCWGG)，但但其其同裂酶不受影响，因其切点不同。同裂酶不受影响，因其切点不同。3、EcoK I甲甲基基化化酶酶，其其识识别别位位点点少少，识识别别AAC(N)6GTGC和和GCAC(N)6GTT序序列列中中A的的N6位置。

19、位置。4、Sss I甲甲基基化化酶酶，来来源源于于原原核核螺螺原原体体，可可使使CG序列中的序列中的C在在C5位置上甲基化。位置上甲基化。一、甲基化酶的种类一、甲基化酶的种类(methylase)二、依赖于甲基化的限制系统二、依赖于甲基化的限制系统1、E.coli：McrA，McrBC和和Mrr，识识别别序序列列不不同同，但但只只识识别别经经过过甲甲基基化化的的序序列列，都都限制由限制由CG甲基化酶甲基化酶(M.SssI)作用的作用的DNA。McrA：限制：限制HpaII甲基化修饰的位点。甲基化修饰的位点。McrBC：限制两套半位点：限制两套半位点(G/A)m5C。Mrr：限制：限制m6A。三

20、、甲基化对限制酶酶切的影响三、甲基化对限制酶酶切的影响1.修饰酶切位点修饰酶切位点2.主主要要使使酶酶切切位位点点甲甲基基化化，而而不不受受限限制制性性核酸内切酶的切割。核酸内切酶的切割。3.2.产生新的酶切位点产生新的酶切位点4.有有些些酶酶是是依依赖赖甲甲基基化化的的限限制制酶酶，因因此此甲甲基化后可产生新的酶切位点。基化后可产生新的酶切位点。第三节第三节 DNA聚合酶聚合酶DNA polymerase主主 要要 功功 能能：催催 化化DNA的合成的合成l真核生物五种：真核生物五种：、l原核生物三种：原核生物三种：DNA聚合酶聚合酶I,II和和III1、活活性性：大大肠肠杆杆菌菌DNA聚聚

21、合合酶酶I为为单单链链多多肽肽，相相对对分分子子质质量量为为109103，有有三三种种活活性性：53 DNA聚聚合合酶酶活活性性，53 外外切切核核酸酸酶酶活活性性，35 外切核酸酶活性外切核酸酶活性。交交换换反反应应：如如果果只只有有一一种种dNTP存存在在，3 5外外切切核核酸酸酶酶活活性性将将从从3-OH端端降降解解DNA，然然后后在在该该位位置置发发生生一一系系列列连连续续的的合合成成和和外外切切反反应应，直直到到露出与该露出与该dNTP互补的碱基。互补的碱基。一、大肠杆菌聚合酶一、大肠杆菌聚合酶I(1)利利用用大大肠肠杆杆菌菌DNA聚聚合合酶酶I的的53外外切切核核酸酸酶酶活活性性，

22、可可用用切切口口平平移移法法标标记记DNA，用用作作杂杂交探针。交探针。方方法法：在在Mg2存存在在下下用用DNaseI处处理理双双链链DNA模模板板，产产生生少少量量切切口口，在在切切口口处处，利利用用DNA聚聚合合酶酶I的的53外外切切核核酸酸酶酶活活性性使使切切口口沿沿53平平移移，同同时时产产生生的的切切口口可可作作为为DNA聚聚合合酶酶I催催化化合合成成DNA的的引引物物。合合成成过过程程中中，标标记记的的dNTP不不断断加加入入到到DNA链链上上，可可作作为为杂杂交探针。交探针。2、大肠杆菌、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I的用途的用途(2)用于用于cDNA克隆中第二链合成克隆中第二链

23、合成利利用用聚聚合合酶酶活活性性。但但已已被被淘淘汰汰，改改用用Klenow酶或反转录酶。酶或反转录酶。(3)对对3突出末端的突出末端的DNA作末端标记作末端标记利利用用交交换换反反应应。现现改改用用T4或或T7 DNA聚聚合合酶。酶。2、大肠杆菌、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I的用途的用途二、二、Klenow DNA聚合酶聚合酶是是大大肠肠杆杆菌菌DNA聚聚合合酶酶I经经蛋蛋白白酶酶裂裂解解后后，从从全全酶酶中中除除去去53外外切切酶酶活活性性的的肽肽段段后后的的大大片片段段肽肽段段，其其聚聚合合活活性性和和35外外切切酶酶活活性性不不受受影影响响，相相对对分分子子质质量量为为76103。可利

24、用基因工程生产。可利用基因工程生产。(1)补补平平DNA的的3凹凹端端。(利利用用DNA聚聚合合酶酶活活性性，要要加加足足够够的的dNTP，如如带带标标记记，则则可可进进行行末末端端标标记记)(2)抹抹平平DNA的的3凸凸端端。(3-5外外切切核核酸酸酶酶活活性性，切切除除3凸凸端端，要要加加足足够够的的dNTP。T4和和T7 DNA聚合酶可替代聚合酶可替代)(3)通过置换反应对通过置换反应对DNA进行末端标记进行末端标记(4)随机引物标记随机引物标记(聚合酶活性聚合酶活性)(5)其他用途，如测序，其他用途，如测序，cDNA合成第二链。合成第二链。Klenow DNA聚合酶作用聚合酶作用三、三

25、、T4噬菌体噬菌体 DNA聚合酶聚合酶T4 phage DNA polymerase来来源源于于T4噬噬菌体感染的大肠杆菌，菌体感染的大肠杆菌，相相对对分分子子质质量量为为114103，活活性性与与Klenow DNA聚合酶相似，聚合酶相似，但但其其35外外切切核核酸酸酶酶活活性性强强200倍倍，且且不不从从单单链链DNA模模板板上上替替换换引引物物，常常用用于于诱诱变反应。变反应。四、四、T7噬菌体噬菌体 DNA聚合酶聚合酶来来源源于于T7噬噬菌菌体体感感染染的的大大肠肠杆杆菌菌，是是由由两两种种紧紧密密结结合合的的蛋蛋白白质质形形成成的的复复合合体体，一一种种是是噬噬菌菌体体基基因因5编编

26、码码的的蛋蛋白白，另另一一个个是是宿宿主主细细胞胞的的硫硫氧氧还还原蛋白。原蛋白。活活性性与与T4噬噬菌菌体体DNA聚聚合合酶酶和和Klenow DNA聚聚合合酶酶相相似似，但但其其35外外切切核核酸酸酶酶活活性性为为Klenow DNA聚聚合合酶酶1000倍倍，可可替替代代T4噬噬菌菌体体DNA聚合酶功能并可用于模板的引物延伸。聚合酶功能并可用于模板的引物延伸。五、耐热五、耐热 DNA聚合酶聚合酶在在高高温温下下具具有有活活性性的的DNA聚聚合合酶酶，来来自自嗜嗜高温的细菌，主要用于高温的细菌，主要用于PCR反应。反应。Taq DNA聚聚合合酶酶、Vent DNA聚聚合合酶酶、Pfu DNA

27、聚聚合合酶酶、Pwo DNA聚聚合合酶酶和和Tth DNA聚合酶。聚合酶。六、反转录酶六、反转录酶(reverse transcriptase)依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶，聚合酶，有有53合成合成DNA活性，活性，无无35外切酶活性。外切酶活性。来自来自AMV(禽成髓细胞瘤病毒禽成髓细胞瘤病毒)和和Mo-MLV(Moloney鼠鼠白白血血病病病病毒毒，又又称称M-MuLV)。具有具有53聚合酶活性和很强的聚合酶活性和很强的RNase H活性活性(特特异性水解异性水解DNA:RNA杂交链上杂交链上RNA链的磷酸链的磷酸二酯键，产生二酯键，产生5核苷酸，该酶对单链的核酸、核苷酸，该酶对单链

28、的核酸、双链双链DNA或双链或双链RNA没有作用没有作用)。cDNA合合成成起起始始：引引物物和和mRNA模模板板杂杂交交体体可可成成为为RNase H的的底底物物，模模板板的的降降解解和和cDNA的的合成相竞争。合成相竞争。反反应应终终止止:RNase H可可在在正正在在增增长长的的 DNA3端端切割模板，抑制切割模板，抑制cDNA的合成的合成。AMV反转录酶反转录酶RNase H缺缺陷陷型型莫莫洛洛尼尼氏氏鼠鼠白白血血病病病病毒毒(M-MuLV)反反转转录录酶酶是是一一种种RNA介介导导的的DNA聚合酶。聚合酶。该该酶酶能能以以RNA(合合成成cDNA时时)或或单单链链DNA做做模模板板由

29、由引引物物起起始始合合成成一一个个互互补补的的DNA链链。RNase H活活性性的的缺缺失失增增强强了了该该酶酶合合成长链成长链cDNAs的能力。的能力。M-MuLV反转录酶反转录酶反转录酶的活性反转录酶的活性1.5 53DNA聚聚合合酶酶活活性性(需需Mg2+)，即即以以RNA或或DNA为为模模板板及及带带3-OH的的RNA或或DNA引引物物合成合成DNA。2.53和和35外外切切核核酸酸酶酶活活性性，产产生生含含5磷磷酸及酸及3-OH的长的长420个碱基的核苷酸。个碱基的核苷酸。3.无无35外外切切核核酸酸酶酶校校正正作作用用，在在高高浓浓度度dNTP等等条条件件下下每每500个个碱碱基基

30、会会有有一一个个错错误误的的掺入。掺入。七、末端转移酶七、末端转移酶(terminal ransferase)来来源源于于小小牛牛胸胸腺腺，是是存存在在于于前前淋淋巴巴细细胞胞及及分分化化早早期期的的类类淋淋巴巴样样细细胞胞内内的的一一种种DNA聚聚合合酶酶，不不依依赖赖于模板的于模板的DNA聚合酶。聚合酶。在在2价价阳阳离离子子存存在在下下，末末端端转转移移酶酶催催化化dNTP加加于于DNA分分子子的的3-OH端端。若若dNTP为为T或或C，首首选选Co2，若，若dNTP为为A或或G，首选，首选Mg2。可可在在cDNA或或载载体体的的3末末端端加加同同聚聚尾尾，便便于于克克隆隆，也也可可用用

31、标标记记的的rNTP、dNTP或或ddNTP来来标标记记DNA片段的片段的3末端。末端。第四节第四节 其他分子克隆工具酶其他分子克隆工具酶包包括括：SP6噬噬菌菌体体RNA聚聚合合酶酶、T4噬噬菌菌体体RNA聚合酶、聚合酶、T7噬菌体噬菌体RNA聚合酶。聚合酶。活活性性：识识别别DNA中中各各自自特特异异的的启启动动子子序序列列，并并沿沿此此DNA模模板板起起始始RNA的的合合成成，无无需需引物。引物。用途：体外合成用途：体外合成RNA分子，表达外源基因。分子，表达外源基因。一、依赖于一、依赖于DNA的的RNA聚合酶聚合酶二、连接酶二、连接酶(ligase)1.T4 DNA连接酶连接酶催催化化

32、DNA5磷磷酸酸基基与与3羟羟基基形形成成磷磷酸酸二二酯酯键键，反反应应底底物物为为黏黏端端、切切口口、平平末末端端的的RNA或者或者DNA。2.大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶需需NAD+的的参参与与，作作cDNA克克隆隆时时，不不会会将将RNA连接到连接到DNA，不连接，不连接RNA。3.Taq DNA连接酶连接酶在在两两个个核核苷苷酸酸之之间间进进行行连连接接反反应应，同同时时必必须须与与另另一一DNA链链形形成成杂杂交交体体，相相当当于于连连接接双双链链DNA中中的的缺缺口口，作作用用在在45-65，需需NAD+,主主要要用用于于在在PCR扩扩增增中中引引入入寡寡核苷酸。核苷酸。二、

33、连接酶二、连接酶(ligase)4.T4 RNA连接酶连接酶可可以以催催化化单单链链DNA或或RNA的的5磷磷酸酸与与另另一一单单链链DNA或或RNA的的3羟羟基基形形成成共共价价连连接接，用用于于标标记记RNA的的3末末端端、单单链链DNA或或RNA的连接等。的连接等。二、连接酶二、连接酶(ligase)三、三、T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶T4 polynucleotide kinase 是是一一种种磷磷酸酸化化酶酶，可可将将ATP的的-磷磷酸酸基基团团转转移移至至DNA或或者者RNA的的5末端末端:1.正正反反应应：将将ATP的的-磷磷酸酸基基团团转转移移至至无无磷磷酸酸的的DNA的的5末

34、末端端，用用于于对对缺缺乏乏5磷磷酸酸的的DNA进进行磷酸化。行磷酸化。2.交交换换反反应应：在在过过量量ATP存存在在的的情情况况下下，将将DNA的的5端端磷磷酸酸转转移移给给ADP,然然后后DNA从从ATP上上获获得得-磷酸而重新磷酸化。磷酸而重新磷酸化。四、碱性磷酸酶四、碱性磷酸酶Calf intestinal alkaline phosphatase,简简称称CIP或或CIAP，催化除去催化除去DNA或或RNA-5磷酸的反应，磷酸的反应，通通过过去去除除5磷磷酸酸基基团团，可可防防止止DNA片片段段自自连，或标记前去除连，或标记前去除DNA或或RNA的的5磷酸。磷酸。五、核酸酶五、核酸

35、酶lBAL31核酸酶核酸酶(3外切核酸酶活性外切核酸酶活性)lS1核酸酶核酸酶(降解单链降解单链DNA或或RNA)l绿豆核酸酶绿豆核酸酶(降解单链降解单链DNA或或RNA)lRNase A(去除去除DNA样品中的样品中的RNA)lDNase(降解双链或单链降解双链或单链DNA)l外外切切核核酸酸酶酶(在在dsDNA 3羟羟基基逐逐一一去去除除单单核核苷酸苷酸)l核核糖糖核核酸酸酶酶H(水水解解DNA:RNA上上RNA上上的的磷磷酸酸二酯键二酯键)lRNase One(Promega公公司司开开发发在在所所有有4个个碱碱基基处切割磷酸二酯键处切割磷酸二酯键)六、核酸酶抑制剂六、核酸酶抑制剂RNa

36、se inhibitor为为RNase的的非非竞竞争争性性抑抑制制剂剂，以以非非共共价价方方式式结结合合在在RNase A类类的的酶上，其活性需要酶上，其活性需要DTT。主主要要应应用用于于cDNA合合成成的的反反应应中中，如如RT-PCR。七、琼脂糖酶七、琼脂糖酶Agarase是是一一种种琼琼脂脂糖糖水水解解酶酶，可可将将琼琼脂脂糖糖亚单位亚单位(新琼脂二糖新琼脂二糖)水解为新琼脂寡糖。水解为新琼脂寡糖。用用于于从从低低熔熔点点琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中分分离离纯纯化化大大片片段段DNA或或RNA片片段段。对对热热很很稳稳定定，反反应应时时不需要缓冲液。不需要缓冲液。八、八、DNA结合蛋白结合

37、蛋白1.单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(single strand binding protein,SSB)与与单单链链DNA结结合合，可可以以消消弱弱链链内内二二级级结结构构的的稳稳定定性性，从从而而加加速速互互补补多多核核苷苷酸酸的的重重新新退退火火，并并通通过过消消除除阻阻碍碍DNA聚聚合合酶酶前前进进的的链链内内二二级级结结构构，提提高高聚聚合合酶酶的的持持续续作用能力。作用能力。2.RecA蛋白蛋白来来自自大大肠肠杆杆菌菌，与与重重组组有有关关，可可与与单单链链DNA结结合合，还还可可促促进进dsDNA对对同同源源ssDNA的的吸吸收收作作用用，是一个依赖于是一个依赖于DNA的的AT

38、P酶酶3.拓扑异构酶拓扑异构酶主主要要来来自自小小牛牛胸胸腺腺，通通过过瞬瞬时时破破坏坏并并再再生生磷磷酸酸二二酯键，解除共价闭环酯键，解除共价闭环dsDNA中的超螺旋。中的超螺旋。八、八、DNA结合蛋白结合蛋白九、其他酶九、其他酶1.蛋蛋白白酶酶K(Proteinase K)。是是具具有有高高活活性性的的丝丝氨氨酸酸蛋蛋白白酶酶，由由霉霉菌菌产产生生。可可以以水水解解肽肽键键，尤尤其其适适合合水水解解羧羧基基末末端端至至芳芳香香族族氨氨基基酸酸和和中中性性氨氨基基酸酸之之间间的的肽肽键键，能能快快速速水水解解细细胞胞裂裂解解物物中中的的DNA酶酶和和RNA酶酶，有有利利于于DNA和和RNA的的纯纯化。化。2.溶溶菌菌酶酶。是是一一类类水水解解细细菌菌细细胞胞壁壁中中聚聚糖糖的的酶酶，用于破碎细胞。用于破碎细胞。作业及思考题作业及思考题1.限限制制性性内内切切酶酶可可划划分分为为哪哪几几个个类类型型，各各有有何特点？何特点？2.DNA聚合酶有哪些，分别有哪些作用？聚合酶有哪些，分别有哪些作用？