基因修饰神经干细胞 [人神经营养素-3基因修饰的神经干细胞] .docx

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1、基因修饰神经干细胞 人神经营养素-3基因修饰的神经干细胞 摘要 目的：探讨移植表达人神经养分素-3（human neurotrophin-3，hNT-3）基因的神经干细胞（neural stem cells， NSCs）对缺血性脑损伤大鼠海马区内源性NSCs的增殖、分化的影响。方法：建立大鼠缺血再灌注脑损伤模型，在术后第7天将转染hNT3基因的神经干细胞（NSCs- hNT3），移植到大鼠纹状体半暗带。比照组移植一般NSCs或生理盐水。然后腹腔注射BrdU对新增殖的细胞进行标记，再行免疫荧光双标染色对NSCs的增殖及分化进行检测。结果：与比照组比较，NSCs-hNT3移植后，能显著增加大鼠缺血

2、侧海马齿状回（denate gyrus， DG）BrdU+细胞数（P=0.037，P=0.004， respectively），其中90%以上为BrdU与DCX染色双阳性（BrdU+/DCX+）的未成熟神经元。且与生理盐水组比较，一般NSCs移植后，缺血侧海马DG区BrdU+/DCX+细胞数也显著增加（P=0.004）。结论：NSCs移植对大鼠缺血侧海马DG区内源性NSCs增殖有促进作用，新增殖的细胞主要向神经元方向分化；经hNT-3基因修饰， NSCs的治疗作用得以加强，并有助于神经功能的改善。 关键词 神经干细胞；慢病毒载体；转基因；神经养分素-3；脑缺血 应用干细胞移植技术来治疗中风等神

3、经系统疾病的基础探讨已取得肯定进展。但到目前为止，还没有干脆证据表明移植细胞能和宿主的神经网络建立有功能的突触联系1。近年来，探讨方向已转向促进中枢神经系统（central nervous system， CNS）内源性NSCs的增殖、存活及向神经元方向分化1。本探讨旨在进一步探讨细胞移植后对大鼠海马区内源性细胞增殖及向神经元方向的分化的影响。 1材料和方法 1.1 试验动物及器械 孕14天Sprague-Dawley大鼠1只及雄性Sprague-Dawley大鼠（体重230g250g）由汕头高校医院试验动物中心供应。15ml离心管（Corning，Mexico）， 低温离心机（Lock-So

4、ng，北京路科顺高新技术有限公司），一次性200目尼龙细胞筛（BD Falcon，美国），24孔培育板（Corning，美国）， 25cm2细胞培育瓶（Corning，美国），CO2恒温培育箱（Thermo forma 3110 series， 美国），倒置荧光显微镜（Leica，德国），手术显微镜（Leica，德国），立体定向仪（江湾II型-C）。 1.2 试验试剂 干细胞培育液：DMEM/F12培育液（Gibco，美国），添加b-FGF（20ng/ml，Cytolab/Peprotech Asia，美国）、EGF 20ng/ml，Cytolab/Peprotech Asia，美国），1%浓

5、度的N2和2%浓度的B27添加剂（Invitrogen，美国），谷氨酰胺（2mmol/ml，Hyclone， 美国）、青霉素（10u/ml， Gibco ，美国）、链霉素（10mg/ml， Gibco ，美国）。4保存。0.25%胰蛋白酶（Gibco ，美国），胎牛血清（Invitrogen，美国）； 10%水合氯醛（Sigma-Aldrich） ； 表达hNT3基因的慢病毒载体（LV/ hNT-3，上海吉凯基因化学技术有限公司构建）。 1.3 神经干细胞分别、培育及hNT-3基因修饰 从孕14天Sprague-Dawley胎鼠海马组织提取NSCs，进行体外无血清培育、扩增和纯化 2。经免疫荧

6、光Nestin染色鉴定后，取第五代的神经干细胞球，用0.125%的胰蛋白酶消化和机械吹打的方法，使神经球分散成35个细胞一簇；4离心1000rpm5min，吸走上清，再用干细胞培育液洗涤细胞两次；用干细胞培育液重悬细胞，以1105 cells /500µl/孔接种于24孔板，置37，5%CO2培育箱中培育；34h后，各孔以最佳感染复数 （multiplicity of infection， MOI）为10的比例加入LV/ hNT-3稀释液100µl， 10h后置换出病毒液，培育条件不变。已转染hNT-3基因的NSCs命名为NSCs-hNT3。 1.4 大鼠缺血再灌注模型

7、（tMCAO）建立及细胞移植 参考Pringle等的方法，建立大鼠tMCAO模型3，右侧大脑中动脉阻断时间为2h。tMCAO模型建立后7d，选取神经损害程度评分4 （Neurological Severity Scores，NSS）为89分的大鼠，随机分为NSCs-hNT3治疗组、NSCs治疗组及生理盐水比照组，各组动物数均为6个（最终纳入试验数）。细胞治疗组分别移植NSCs-hNT3或NSCs 2 00，000 cells/10µl，生理盐水比照组注射10µl生理盐水。详细方法参照文献报道2。 1.7 BrdU标记及标本取材 三组大鼠，在细胞移植7天后起先腹腔注射Br

8、dU（50 mg/kg， b.i.d，共6天），对内源性新增殖的细胞进行标记。在最终一次注射结束后24h内（细胞移植后第14天），完成NSS评分后，处死动物取材。详细是：以10水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，用冰生理盐水和4%多聚甲醛经心脏灌洗固定后，取出脑标本，4%多聚甲醛4下后固定24h，30蔗糖脱水48h。标本用冰冻切片机行冠状位连续冰冻切片，片厚20 µm。切片取材部位为背侧海马区（冠状缝后3.0 mm-4.5 mm）。切片收集到24孔板内，浸泡在冻存液内-20保存备用。每隔5张取1张切片用于免疫荧光组织化学染色，对体内新增殖的细胞及其分化进行检测。 1.8 免疫荧光双标染色 取

9、24孔板，孔内预先加入TBS。将冰冻切片从冻存液内取出放入板孔内，行抗BrdU/DCX双标染色。详细如下：（a） TBS洗3次，每次5min；（b） 50%甲酰胺/2SSC在65条件下作用2h；（c） 吸去液体后用2SSC洗2次，每次5min；（d） 2N的HCl 37处理10 min；（e） 0.1M的硼酸缓冲液室温下10min，TBS洗3次，每次5min；（f） 3%H2O2 37处理10 min ，蒸馏水洗3min，TBS洗5min；（g） 用含5%羊血清、0.1%BSA、0.1%TritonX-100的TBS在37C封闭30min；（h） 吸去封闭液，加入小鼠抗BrdU IgG （1：

10、100）与兔抗DCX IgG （1：100），将脑片漂移在上述抗体中，4C孵育过夜；（i） TBS洗3次后， 各孔内加入用封闭液稀释的FITC标记的羊抗鼠和TRITC标记的羊抗兔的二抗混合液（1：100）。室温暗盒中作用40min后，各孔再加入0.1%的DAPI进行细胞核染色，接着作用10min；（j）TBS洗3次后用毛笔把脑片裱贴在载玻片上，并用 50%甘油封片，置荧光显微镜下视察，参考Baldauf 5方法对海马齿状回SGZ和SCZ区域800µm范围进行细胞计数、照相。用 Image plus 6.0图像处理软件来处理和分析图像。 1.9 统计学处理 试验数据以XS表示，组间细

11、胞计数先应用Kruskal-Walis法进行差异性检验，再用Mann-Whitney U检验进行两两比较。应用统计软件SPSS 17.0进行统计分析。 2结果 2.1 神经干细胞培育及鉴定 原代培育57天， 即形成悬浮生长的神经球（图1），免疫荧光Nestin染色阳性，在荧光显微镜下视察呈绿色（图2）。 图1倒置显微镜下视察呈悬浮生长的神经干细胞球 图2荧光显微镜下视察呈绿色的 Nestin 染色阳性的神经干细胞球 2.2 免疫荧光染色 图3免疫荧光染色 各组大鼠缺血侧海马DG区新增殖的BrdU+细胞（红色）、DCX+细胞（绿色）及非特异性细胞核DAPI染色（蓝色）。其中 A-E 为NSCs-

12、hNT3治疗组，A1-E1为 NSCs治疗组；A2-E2为生理盐水比照组。D、D1及D2分别为对应组别的融合图像，BrdU+/DCX+的细胞显示为黄色。E、E1及E2分别为对应组别融合图像的局部放大，箭头所示为BrdU+/DCX+细胞，即海马DG区新增殖并已向神经元方向分化的内源性细胞。Bars=100µm 图4各组缺血侧海马DG区增殖细胞数比较。 *表示组间比较，统计学差异显著（P90%的新增殖细胞为BrdU+/DCX+细胞（黄色）。三组之间BrdU+/DCX+细胞数也存在统计学差异（ X2=13.93， P=0.001），组间两两比较结果与BrdU+细胞数比较结果相一样（图4）

13、。 3探讨 Parkinson，s病、中风及脊髓损伤等神经系统常见疾病是由神经元和神经胶质细胞结构和功能缺失所致，干细胞移植治疗神经系统疾病的探讨已取得肯定进展。但缺憾的是，由于诸多因素的影响，移植的干细胞及其在宿主CNS内的子代细胞，大多数会在短期内死亡1，7，8，而且干细胞在体内自行分化成神经元的比例低，是影响疗效提高的重要因素。且到时目前为止，并没有获得移植细胞与宿主神经网络建立突触联系的准确证据。近来，基于干细胞治疗神经系统疾病的探讨热点，已转向促进CNS内源性NSCs增殖并向神经元方向分化，防止其凋亡，并整合到神经网络中，进而促进神经系统功能和神经网络重塑9。 利用干细胞携带目的基因

14、到达损伤部位或病灶局部，以达到修复损伤、治疗疾病的目的， 是目前干细胞探讨的另一个热点 10，11，12。以NSCs作为基因治疗的细胞载体，来治疗中枢神经系统疾病，具有其特殊的优点。NSCs不仅具有自我更新和多方向分化潜能，而且具有低免疫原性，以及向病灶和损伤部位敏锐的趋化性，移植基因修饰的NSCs， 一方面不仅可以突破血脑屏障的限制，在病变或损伤部位通过表达目的基因来发挥治疗作用。另一方面有望解决基因治疗的靶向性问题。而且与干脆体内法（in vivo）比较，可以降低基因治疗过程中病毒载体产生的免疫毒性反应。其次，NSCs移植到体内后，存活的时间比骨髓间充质干细胞、脐血干细胞等长，满意基因长期

15、表达的须要。此外，与其它载体细胞如成纤维母细胞不同，NSCs移植能分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞13 。移植基因修饰的NSCs治疗中枢神经系统疾病，有望获得细胞移植和基因治疗的双重疗效。 在海马DG区， 内源性NSCs增殖主要发生在脑缺血后第一周，到第2、3周则已复原至至正常比照水平。新增殖的细胞存活可达3周 7，8。本探讨中，我们在大鼠缺血再灌注脑损伤发生1周后，将NSCs-hNT3移植到大鼠纹状体半暗带，比照组移植一般NSCs或生理盐水。我们发觉，在细胞移植2周后（脑缺血3周后），生理盐水比照组缺血侧海马区仅少许BrdU+细胞，与相关文献报道一样。而与之比较，NSCs治疗组缺血侧

16、海马SGZ区BrdU+/DCX+细胞显著增加（P=0.004），提示大鼠体CNS内源性NSCs增殖因外源性NSCs移植而增加，这可能是因细胞移植后，分泌了一些可改善缺血局部的微环境的养分因子，对CNS内源性神经干细胞的增殖与存活发挥了促进作用。hNT-3是神经养分因子家族成员之一，具有介导NSCs存活的作用14，在中枢神经系统发育和损伤后修复过程中还能诱导干细胞向神经元方向分化15。正常生理状况下，hNT-3的表达维持在较低水平。但经基因hNT-3修饰的NSCs移植到大鼠CNS内，能够表达丰富的hNT3因子2。这可能是NSCs-hNT3移植后，缺性性脑损伤大鼠海马区内源性细胞增殖进一步显著增加

17、（P=0.037）的缘由之一。在海马DG区，免疫荧光染色示90% 的新增殖细胞为BrdU与DCX染色双阳性（BrdU+/DCX+），提示新生的NSCs主要向神经元方向分化，或许其中部分细胞已经分化成成熟的神经元，不过有待进一步探讨。 干细胞移植治疗CNS疾病，其作用机理困难，一般认为是通过分泌多种细胞因子及免疫调整物质起作用即所谓的“旁路作用机理（bystander mechanism）”1。利用基因技术手段，对干细胞进行基因修饰已是相对成熟的技术。但基因修饰的干细胞在表达生成特别细胞因子的同时，可能会使其它细胞因子的表达发生意想不到的改变。移植到宿主体内后，各种细胞因子的表达、调控及对CNS

18、的影响更为困难。对此，我们必需有醒悟的相识。 参考文献： 1Lindvall O， Kokaia Z. Stem cells for the treatment of neurological disorders J. Nature， 2006， 44： 1094-1096. 2Zhang ZH， Wang RZ， Wang RZ， et al. Transplantation of neural stem cells modified by human neurotrophin-3 promotes functional recovery after transient focal cere

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20、mbryonic stem cells overexpressing Bcl-2 promotes functional recovery after transient cerebral ischemia J. Neurobiol Dis， 2005，19： 183 193. 5Baldauf K， Reymann KG. Influence of EGF/bFGF treatment on proliferation， early neurogenesis and infarct volume after transient focal ischemia J. Brain Res， 200

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