透明质酸酶说明书 透明质酸酶.docx

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1、透明质酸酶说明书 透明质酸酶 中图分类号：Q55文献标识码：E文章编号：1672-979X(2007)04-0074-03 1 透亮质酸酶及透亮质酸 透亮质酸酶 （hyaluronidase, HAase）是能使透亮质酸产生低分子化作用酶的总称。依据全国科学技术名词审定委员会公布的生物化学名词将hyaluronic acid译为透亮质酸，药学名词和药品的国家标准则将其称为玻璃酸，两者为同一种物质，故透亮质酸酶亦称为玻璃酸酶1。 依据来源和作用的不同，HAase分为3类：（1）睾丸型HAase，主要来源为动物睾丸、颌下腺和溶酶体等；（2）透亮质酸内-葡萄糖醛酸苷酶，来源为水蛭的唾液腺；（3）细菌

2、HAase，又称透亮质酸裂解酶，这是一种碱性糖蛋白，属内切糖苷酶，能催化透亮质酸及硫酸软骨素 A、C的-乙酰氨基己糖糖苷键水解2。依据最适pH值的不同将脊椎动物的HAase分为中性型和酸性型2类。最适pH为5左右者是中性型HAase，如睾丸、一些微生物、蛇和昆虫毒素所含的HAase；最适pH为3.54.0者，是酸性型HAase，如正常人血清、尿、肝脏含有的HAase，肿瘤组织中的HAase也是酸性型。 HAase的专一性水解底物-透亮质酸（HA）是一种糖胺聚糖（GAG，亦称黏多糖）。HA是由双糖单位重复连接构成的直链高分子多糖。其双糖单位中的D-葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺以-1,3糖苷键相连，分

3、子中2种单糖的摩尔比为1:1，双糖单位间则以-1,4糖苷键连接1-4。它是唯一不限于动物组织，并产生于细菌的糖胺聚糖，广泛存在于动物结缔组织的细胞外基质中，在胚胎、滑液、玻璃体、脐带、鸡冠等组织中尤为丰富。它在体内具有许多作用，如构成多种基质，调整渗透压，调控大分子物质转运，在细胞四周形成物理屏障等。 2HAase的基本性质 不同来源的HAase相对分子质量不同。牛睾丸及精液HAase相对分子质量为6.1104，蝎毒的为5.4104，尖吻蝮蛇的为3.3104，细菌的则高达151042。蜂毒中HAase的分子结构尚不完全清晰，但已知其相对分子质量约为(4.24.4)104，N端为精氨酸，分子中含

4、有18个酪氨酸和少量的丙氨酸、苏氨酸，无游离的巯基，分子中还含有半乳糖、果糖和甘露糖。从等电点看，全部动物毒中的HAase都是碱性的，这不同于睾丸的HAase（酸性蛋白）和细菌的HAase（中性蛋白）5。 3HAase的制备 由于现在市场上运用的HAase大多是从哺乳动物睾丸中提取的，现将从羊睾丸中提取HAase的传统工艺及目前探讨的热点从蛇毒提取 HAase的工艺做一简介。 3.1从羊睾丸中制备HAase的传统工艺 3.1.1提取簇新睾丸除去内外副睾，绞成糜浆，称取400 g倒入预先配制的冷醋酸液（水360 g，冰醋酸204 mL，l molL 盐酸40 mL）中，在5 以下提取4 h，吊滤

5、，得提取液。浆渣作2次提取，提取液量为第1次的1/3。 3.1.2盐析在不断搅拌下，每升提取液加入固体硫酸铵（工业用）210 g，完全溶解后静止1 h，用双层涤纶布袋吊滤过夜，得清液，不断搅拌。每升清液再加入固体硫酸铵290 g，完全溶解后静止1 h，吊滤过夜，得潮固体。 3.1.3精制将粗品溶于少量水中，装入透析袋，置入100 mL磷酸盐-柠檬酸缓冲液中，在10 左右透析24 h后过滤，得透析液，再冰浴冷却，加入15%磷酸钠(12H2O)0.5 mL，不断搅拌下缓缓加入20醋酸钙溶液0.3 mL，并用氢氧化钠液调pH至8.5，抽滤，滤液用盐酸调pH至7.0，冷冻干燥，得无热原HAase精品。

6、 3.2从蛇毒中制备取HAase的工艺 有人用凝胶过滤法从尖吻蛇毒中纯化出透亮质酸酶，并用SDS-PAGE法测得其相对分子质量为3.3104 6。以尖吻蝮蛇（A . acutus）蛇毒为原料，在4左右的低温下纯化得到HAase。步骤为：（1）CM-Sephadex C-50阳离子交换层析；（2）Sephadex G-75分子筛层析；（3）CM-Sephadex C-25阳离子交换层析。用SDS-PAGE法测得其相对分子质量为3.3104，等点聚焦测得等电点为10.3，并通过糖染色法证明HAase是糖蛋白3。 4HAase的应用 4.1麻醉协助剂 ISTA制药公司于2004年12月3日宣布，美国

7、FDA已批准其单剂量小包装注射用绵羊透亮质酸酶（Vitrase）无菌液作为分散剂，可用于促进其它药物分散和汲取7。本品在眼科手术时常与局部麻醉药合用。 4.2促使皮下注射液快速扩散 HAase通过对黏多糖HA的解聚作用，能加速物质的扩散和汲取，促使皮下注射液或局部积贮的渗出液、血液等的扩散和汲取，是一种重要的药物扩散剂，还有消退血肿和水肿的作用，与其他注射液（如生理盐水、抗生素、肾上腺素等）合用，可促使皮下注射液快速汲取。 4.3用于肿瘤检测 目前对分别的肿瘤细胞和肿瘤间质细胞检测表明，肿瘤间质细胞只分泌HA，肿瘤细胞则能同时分泌HA和HAase，并且随肿瘤细胞侵袭性的增加而增加。此外，HA和

8、HAase在恶性肿瘤患者的体液（血清、腹水）和排泄物（唾液、尿液）中明显上升，经统计学分析具有很高的灵敏性和特异性，可作为志向的肿瘤标记物。Lokeshwar等8对513例尿样的分析表明，膀胱癌患者尿液中HA的含量是非膀胱癌患者2.56.5倍；G2，G3期膀胱癌患者尿液中的HAase含量是非膀胱癌患者的37倍。HA和HAase联合测定分析结果，其特异度和灵敏度分别达到84.4%和91.9%。最值得关注的是测定HA/HAase有助于及早发觉隐匿性肿瘤和复发肿瘤，及推断肿瘤的发展阶段。 4.4可促扩散、化痰消肿以及治疗肠粘连及青光眼 治疗青光眼运用HAase能加速和促进液体穿通组织屏障进入眼眶组织

9、，麻醉过程中勿需压迫眼球，避开了对视神经的压迫，并能避开眼球穿通伤患者眼内容物进一步脱出的危急。 4.5减轻缺血损伤，缩当心肌梗死范围 1959年Oliveira等首次用HAase减轻心肌梗死患者及狗的缺血损伤后，已有大量试验探讨及临床视察，证明此酶确能减轻缺血损伤和缩当心肌梗死范围。通常认为，HAase与促进底物供应和废物转运、减轻血管破坏和细胞水肿及增加侧循环等作用有关2。 4.6有助于受精 睾丸HAase存在精子的顶体中，受精时它能水解卵子的被膜，有助于精子的进入。来源于睾丸的HAase为异种蛋白质，有副作用如休克、睾丸变性萎缩等，现多不用。 5 影响HAase活性的因素 HAase的活

10、性受pH值、离子强度、蛋白质浓度、抑制剂、激烈剂等因素的影响。 5.1pH值对HAase活性的影响 重组HYAL1、正常人血清和尿HYAL1的最适pH为3.8，当pH4.5时活性消逝。膀胱癌HAase最适的pH为4.14.3，当pH为4.5时其活性降低到80%。正常组织的pH常为中性，可使酸性型HAase活性降低或失活，然而很多肿瘤组织释放大量的乳酸，形成酸性微环境，因此，酸性型HAase仅在癌组织中或其四周有活性9。 5.2离子强度对HAase活性的影响 一些阳离子浓度可影响HAase的活性。如高浓度的Na+，Mg2+，Fe2，Cu2+都可对HAase的活性产生抑制作用。 5.3蛋白质对HA

11、ase活性的影响 Maingonnat等10 报道，低浓度蛋白质如hyalu- mnectin（与HA特异性结合的糖蛋白）、牛血清白蛋白（BSA）或球蛋白、人血清白蛋白、转铁蛋白或血红蛋白均能提高HAase的活性。 5.4HAase的抑制剂和激烈剂 HAase活性受抑制剂和激烈剂的调整，抑制剂有抗组胺药物、水杨酸盐、肝素、双羟香豆素、维生素C和类黄酮等。激烈剂包括肾上腺素、组胺以及酸性磷酸酶。 参考文献 1凌沛学. 透亮质酸M. 北京：中国轻工业出版社，2000：1-2，36-37. 2吴梧桐. 生物技术制药M. 北京：高等教化出版社，2003：209-211. 3王敬旭. 透亮质酸及透亮质酸

12、酶在肿瘤生长和转移中作用的探讨进展J. 国外医学口腔医学分册，2004，31（6）：421-423. 4Kemparaju K, Girish K S. Snake venom hyaluronidase: a therapeutic targetJ. Cell Biochem Funct. 2006, 24(1):7-12. 5覃公允. 中国毒蛇学M. 南宁：广西科学技术出版社，1998： 167-168, 327-328. 6汪聪慧，马龙华. 蛇毒液中透亮质酸酶的电喷雾质谱测定J. 质谱学报，2002，20（3,4）：87-88. 7FDA批准单剂量包装的注射用绵羊透亮质酸酶J.世界临床药

13、物，2005，26（1）：3. 8Lokeshwar V B, Obek C, Pham H T, et a1. Urinary hyaluronic acid and hyaluronidase: markers for bladder cancer detection and evaluation of grade J. J Urol, 2000, l63 (1): 348-356. 9Furuya T, Yamagata S, Shimoyama Y, et a1. Biochemical characterization of glycyrrhizin as an effective inhibitor for hyaluronidases from bovine testisJ. Biol Pharm Bull, 1997, 20 (9): 973-977. 10 Maingonnat C, Victor R, Bertrand P, et a1. Activation and inhibition of human cancer cell hyaluronidase by proteinsJ. Anal Biochem, 1999, 268 (1): 30-34.