亲和分离技术讲稿.ppt

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1、关于亲和分离技术第一页，讲稿共一百零二页哦第六章 亲和分离技术6.1 亲和萃取6.2 亲和沉淀6.3 亲和膜技术6.4 分子印迹分离技术6.5 亲和反胶团萃取技术第二页，讲稿共一百零二页哦6.1 亲和萃取亲和萃取n 亲和萃取简介 n 亲和配基高聚物的合成 n 亲和分配的影响因素和亲和模型n 亲和分配的应用第三页，讲稿共一百零二页哦6.1.1 亲和萃取简介 萃萃取取是是一一种种常常见见的的生生化化分分离离技技术术，生生化化分分离离技技术术的的萃萃取取技技术术包包括括双双水水相相萃萃取取、反反胶胶团团萃萃取取等等。亲亲和和萃萃取取就就是是将将亲亲和和层层析析的的亲亲和和配配基基用用于于萃萃取取分分

2、离离中中，包括亲和双水相和亲和反胶团等。包括亲和双水相和亲和反胶团等。第四页，讲稿共一百零二页哦分离蛋白亲和配基体系白蛋白脂肪酸脂肪酸PEG/dextran碱性磷酸化酶Procion red HE-3GPEG/dextran,PEG/盐盐共脂肪酶（Colipase）卵磷脂卵磷脂LecithinPEG/dextran脱氢酶，激酶活性染料活性染料PEG/dextran,PEG/盐盐-2-巨球细胞Cu2+PEG/dextranS-23 骨髓瘤蛋白二硝基酚二硝基酚PEG/dextran3-氧代类固醇异构酶雌甾二醇雌甾二醇l lPEG/dextran胰蛋白酶对氨基苯咪对氨基苯咪PEG/dextran亲和

3、萃取简介常用的亲和配基、双水相体系和它们所对应分离的物质第五页，讲稿共一百零二页哦6.1.2 亲和配基高聚物的合成 亲亲和和双双水水相相中中亲亲和和配配基基可可固固定定在在上上相相高高聚聚物物或或下下相相高高聚聚物物上，甚至亲和配既可以以游离状态分配在体系中。上，甚至亲和配既可以以游离状态分配在体系中。一一般般配配基基固固定定在在上上相相高高聚聚物物上上，即即将将亲亲和和配配基基通通过过化化学学方法结合在方法结合在PEGPEG上。上。主要包括以下两种主要包括以下两种:PEG PEG 的活化的活化 亲和配基直接反应亲和配基直接反应第六页，讲稿共一百零二页哦6.1.3 亲和分配的影响因素和亲和模型

4、影响亲和分配的影响因素包括普通双水相的影响因素如PEG浓度，还有:配基浓度配基浓度 配基载体配基载体 染料配基染料配基 pH:pH:增加，效率降低增加，效率降低 温度温度:升高，效率降低升高，效率降低 盐浓度盐浓度 第七页，讲稿共一百零二页哦盐的种类添加盐时的添加盐时的log Klog K占不添加盐时的百分数（）占不添加盐时的百分数（）25mM63mM250mM磷酸钠（添加）100103甲酸钠，pH788醋酸钠，pH71059781丙酸钠，pH789Na2SO4988533KCl1048021Li2SO477Tris，pH776KI97691NaSCN67临苯二甲酸钾48NaClO442亲和分

5、配的影响因素和亲和模型盐对分配系数的影响第八页，讲稿共一百零二页哦亲和分配的影响因素和亲和模型体系中的目标蛋白质被配基分子饱和时第九页，讲稿共一百零二页哦亲和分配的影响因素和亲和模型整个过程的自由能变可以列成如下算式G5G1G2G3G1 第十页，讲稿共一百零二页哦有N个结合位点的蛋白质而言 亲和分配的影响因素和亲和模型 推导得目标蛋白质的结合位点不被配基聚合物饱和时第十一页，讲稿共一百零二页哦6.1.4 亲和分配的应用n 乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（LHDLHD）的亲和分配）的亲和分配 第十二页，讲稿共一百零二页哦6.1.4 亲和分配的应用n 葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸化脱氢酶（磷酸化脱氢酶（G6

6、PDHG6PDH）的纯化）的纯化第十三页，讲稿共一百零二页哦6.1.4 亲和分配的应用n 葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸化脱氢酶（磷酸化脱氢酶（G6PDHG6PDH）的纯化）的纯化第十四页，讲稿共一百零二页哦6.2 亲和沉淀分离技术亲和沉淀分离技术n 亲和沉淀的原理n 亲和沉淀聚合物和亲和配基 亲和沉淀可逆性聚合物亲和沉淀可逆性聚合物 亲和沉淀亲和配基亲和沉淀亲和配基 n 亲和沉淀的展望第十五页，讲稿共一百零二页哦6.2.1 亲和沉淀的原理亲和沉淀的机理：亲和沉淀的机理：加到含有目标分子得溶液中配体的连接特异性结合目标分子形成亲和沉淀目标分子解离亲和沉淀原理图亲和沉淀(Affinity preci

7、pitation)是将生物专一性识别与沉淀分离相结合的纯化技术。第十六页，讲稿共一百零二页哦亲和沉淀的优点n溶溶液液中中进进行行，无无扩扩散散传传质质阻阻力力和和结结合合时时的的空空间间位位阻阻，亲亲和和结结合合速度快，结合充分；速度快，结合充分；n 亲和配基裸露在溶液中，配基利用率高；亲和配基裸露在溶液中，配基利用率高；n 利用成熟的离心或过滤技术回收沉淀，易于规模放大利用成熟的离心或过滤技术回收沉淀，易于规模放大 n 亲和沉淀法可用于高粘度或含微粒的料液中目标产物亲和沉淀法可用于高粘度或含微粒的料液中目标产物 的纯化，可在分离操作的初期进行，这对目标分子是的纯化，可在分离操作的初期进行，这

8、对目标分子是 极其有利的：因为粗料液中通常含有对目标产物有害极其有利的：因为粗料液中通常含有对目标产物有害 的杂质（如蛋白酶）。快速、有效地将目标产物分离的杂质（如蛋白酶）。快速、有效地将目标产物分离 出来，有利于提高产品的质量和收率出来，有利于提高产品的质量和收率第十七页，讲稿共一百零二页哦亲和沉淀机理 n 一次作用亲和沉淀一次作用亲和沉淀 (primary-effect precipitation)n 二次作用亲和沉淀二次作用亲和沉淀 (secondary-effect precipitation)亲和沉淀的机理分为两种 第十八页，讲稿共一百零二页哦 一次作用亲和沉淀n水水溶溶性性化化合合

9、物物分分子子偶偶联联有有两两个个或或两两个个以以上上的的亲亲和和配配基基，即即双双配配基基(bis-ligand)bis-ligand)和多配基和多配基(polyligand)polyligand)n通通过过与与多多价价蛋蛋白白质质(multivalent multivalent protein)protein)支支联联，在在适适当当的的条条件下，形成较大的支联网络而沉淀。件下，形成较大的支联网络而沉淀。n一一次次作作用用亲亲和和沉沉淀淀作作用用机机理理与与抗抗原原抗抗体体的的沉沉淀淀作作用用相相似似。存存在在着配基与蛋白质的结合部位的最优化使沉淀率最高。着配基与蛋白质的结合部位的最优化使沉淀

10、率最高。第十九页，讲稿共一百零二页哦n一一次次作作用用亲亲和和沉沉淀淀虽虽然然简简单单，但但仅仅适适用用于于多多价价、特特别别是是4 4价价以以上的蛋白质上的蛋白质n要求配基与目标分子的亲和结合常数较高要求配基与目标分子的亲和结合常数较高n沉沉淀淀条条件件难难于于掌掌握握，并并且且沉沉淀淀的的目目标标分分子子与与配配基基的的分分离离需需要要凝凝胶胶过过滤滤等等难难于于大大规规模模应应用用的的附附加加工工具具，实实用用上上存存在在较较大大难难度。度。n另另外外，在在一一次次作作用用亲亲和和沉沉淀淀这这常常用用的的多多配配基基染染料料有有配配基基自自交交联联(ligandself-assoliat

11、ion)ligandself-assoliation)的的现现象象，成成为为交交联联网网络络形形成成的的竞竞争争机机制制，从从而而阻阻碍碍了了沉沉淀淀的的生生成成。所所以以人人们们更更多多是是采采用二次作用亲和沉淀。用二次作用亲和沉淀。一次作用亲和沉淀第二十页，讲稿共一百零二页哦 二次作用亲和沉淀 n制备亲和沉淀介质制备亲和沉淀介质:利用在利用在物理场物理场如如pHpH、离子强度、温离子强度、温度等度等改变时溶解度下降、发生可逆性沉淀的改变时溶解度下降、发生可逆性沉淀的水溶性聚合水溶性聚合物物为载体为载体固定亲和配基。固定亲和配基。n亲和介质结合目标分子后，通过亲和介质结合目标分子后，通过改变

12、物理场改变物理场使使介质与介质与目标分子共同沉淀目标分子共同沉淀的方法称为二次作用亲和沉淀。的方法称为二次作用亲和沉淀。n离心或过滤回收沉淀，即可除去未沉淀的杂蛋白。离心或过滤回收沉淀，即可除去未沉淀的杂蛋白。n沉淀清洗后加入洗脱剂即可纯化目标产物。沉淀清洗后加入洗脱剂即可纯化目标产物。第二十一页，讲稿共一百零二页哦二次亲和沉淀分离蛋白质示意图第二十二页，讲稿共一百零二页哦6.2.2亲和沉淀聚合物和亲和配基 典型的亲和沉淀有以下步骤：亲和沉淀介质的制备亲和沉淀介质的制备 将亲和沉淀介质加入含有目标蛋白质或酶的粗液中将亲和沉淀介质加入含有目标蛋白质或酶的粗液中 聚合物亲和配基目标蛋白的沉淀聚合物

13、亲和配基目标蛋白的沉淀:通过降低聚合物的通过降低聚合物的 溶解度来实现溶解度来实现聚合物发生可逆性沉淀的方法：pHpH、温度、离子强度的改变温度、离子强度的改变 金属离子的添加金属离子的添加 水溶性有机溶剂的添加等水溶性有机溶剂的添加等选用何种方法取决于使用的配基载体，有时几种方法联合使用第二十三页，讲稿共一百零二页哦典型的亲和沉淀有以下步骤（续）：离心或过滤使沉淀分离，使目标蛋白就从杂蛋白中分离心或过滤使沉淀分离，使目标蛋白就从杂蛋白中分 离出来离出来 目标分子的解离：目前所采用的洗脱方式于亲和层析所目标分子的解离：目前所采用的洗脱方式于亲和层析所 使用的方法大致相同，如改变使用的方法大致相

14、同，如改变pHpH值或离子强度来降低目值或离子强度来降低目 标成为与配基的亲和作用力。标成为与配基的亲和作用力。配基的回收：如果目标蛋白的洗脱是在介质与目标蛋白配基的回收：如果目标蛋白的洗脱是在介质与目标蛋白 复合物不溶的状态下进行，配基可重新使用；否则，需复合物不溶的状态下进行，配基可重新使用；否则，需 要采取凝胶过滤等方法分离要采取凝胶过滤等方法分离第二十四页，讲稿共一百零二页哦n亲亲和和沉沉淀淀的的有有机机聚聚合合物物，主主要要是是可可逆逆性性沉沉淀淀聚聚合合物物即即亲亲和和载载体体(affinity carrier)affinity carrier)或或可逆性溶解聚合物可逆性溶解聚合物

15、n可可逆逆性性溶溶解解聚聚合合物物SISSIS（Soluble Soluble and and Insoluble Insoluble PolymersPolymers）溶溶解解和和非非溶溶解解状状态态可可随随环环境境参参数数如如pHpH、温温度度等等的的变变化化发发生生可可逆逆变化，因此可用于酶或蛋白质的亲和沉淀。变化，因此可用于酶或蛋白质的亲和沉淀。n可可逆逆性性溶溶解解聚聚合合物物可可以以直直接接和和蛋蛋白白质质结结合合发发生生亲亲和和沉沉淀淀，但但有有时需要将亲和配基结在可逆性溶解聚合物上。时需要将亲和配基结在可逆性溶解聚合物上。亲和沉淀可逆性聚合物第二十五页，讲稿共一百零二页哦二次亲

16、和沉淀选择可逆性聚合物的原则：n 包含包含活性基团活性基团，以便亲和配基能够结合；，以便亲和配基能够结合；n 不能和亲和配基强烈结合，不能和亲和配基强烈结合，以免配基不能和目标分子作用；以免配基不能和目标分子作用；n 在一定条件下可以发生在一定条件下可以发生明显的可逆性的沉淀和溶解；明显的可逆性的沉淀和溶解；n 分子量分子量分布窄；分布窄；n 可形成可形成紧密的沉淀；紧密的沉淀；n 易回收易回收，有一定循环操作次数；，有一定循环操作次数；n 廉价易得廉价易得亲和沉淀可逆性聚合物第二十六页，讲稿共一百零二页哦(1)天然的可逆性溶解聚合物 目前所使用的天然亲和配基载体主要是脱乙酰壳聚糖(chito

17、san)和藻酸盐(alginate):n Chitosan Chitosan在在pHpH低于低于6 6时是可溶性的时是可溶性的，升高，升高pHpH值则会发生值则会发生 沉淀沉淀n 藻酸盐是藻酸盐是D D甘露糖醛酸和甘露糖醛酸和L L葡萄糖醛酸的线性多聚葡萄糖醛酸的线性多聚 物，在物，在二价阳离子如二价阳离子如CuCu2+2+的存在下或的存在下或pHpH低于低于2 2的条件下的条件下 形成沉淀形成沉淀 第二十七页，讲稿共一百零二页哦nSenstadSenstad和和MattiassonMattiasson将将大大豆豆胰胰蛋蛋白白酶酶抑抑制制剂剂(soy soy bean bean trypsin

18、 trypsin inhibitor,STI)inhibitor,STI)共共价价偶偶联联到到亲亲和和配配基基载载体体ChitosanChitosan上，制成亲和沉淀介质上，制成亲和沉淀介质n结合胰蛋白酶结合胰蛋白酶(trypsin)trypsin)n用用0.10.1M M的的NaOHNaOH调调节节溶溶液液PHPH值值至至8.58.5，介介质质与与胰胰蛋蛋白白酶酶一一起起沉沉淀，离心淀，离心n用用0.10.1M M的的glycine-glycine-盐盐酸酸缓缓冲冲液液清清洗洗，胰胰蛋蛋白白酶酶与与配配基基STISTI解解离离（此时（此时PHPH约约2.52.5），胰蛋白酶收率为），胰蛋白酶

19、收率为8686。n研研究究表表明明，为为了了使使沉沉淀淀更更完完全全，应应适适当当延延长长时时间间，因因为为亲亲和和作作用进行很快，但用进行很快，但沉淀步骤相对来说要缓慢得多。沉淀步骤相对来说要缓慢得多。(1)天然的可逆性溶解聚合物(应用pH 敏感性)第二十八页，讲稿共一百零二页哦n孙孙彦彦等等人人研研制制了了含含有有共共轭轭二二炔炔结结构构单单元元的的磷磷脂脂酰酰乙乙醇醇胺胺型型聚聚合脂质体合脂质体(Polymerized Liposome,PLS)Polymerized Liposome,PLS)。n磷磷脂脂酰酰乙乙醇醇胺胺的的水水悬悬浮浮液液在在超超声声波波处处理理下下形形成成0.1-0

20、.20.1-0.2mmmm的的球球形形液液泡泡状状磷磷脂脂双双分分子子膜膜，即即脂脂质质体体(liposome)liposome)，表表面面为为亲亲水水性性乙乙醇醇胺基团。胺基团。n该该脂脂质质体体溶溶液液在在紫紫外外线线照照射射下下可可发发生生聚聚合合反反应应，形形成成聚聚合合脂脂质质体体，即即PLSPLS。n向向PLSPLS溶溶液液加加入入NaClNaCl，当当NaClNaCl浓浓度度超超过过0.170.17mol/Lmol/L时时，在在渗渗透透压压作用下作用下PLSPLS发生快速完全的沉淀。发生快速完全的沉淀。n离心回收沉淀后向其中离心回收沉淀后向其中加入水或低浓度盐溶液加入水或低浓度盐

21、溶液，沉淀重新溶解。，沉淀重新溶解。(2)合成可逆性溶解聚合物(应用离子强度敏感性)第二十九页，讲稿共一百零二页哦可逆沉淀性聚合物可逆沉淀性聚合物聚合脂质体（聚合脂质体（polymerized liposome,PLS）n 第三十页，讲稿共一百零二页哦nPLSPLS具有在具有在盐的作用盐的作用下发生可逆性沉淀的性质。下发生可逆性沉淀的性质。n将将大大豆豆胰胰蛋蛋白白酶酶抑抑制制剂剂（STISTI共共价价偶偶联联PLSPLS的的表表面面，制制成成亲亲和和沉淀介质沉淀介质STISTIPLSPLS。n加加入入猪猪胰胰提提取取液液中中，用用0.10.1M M的的NaClNaCl沉沉淀淀，离离心心，并并

22、用用0.010.01M M的的NaOHNaOH洗脱胰蛋白酶。洗脱胰蛋白酶。n结结果果表表明明，此此法法亲亲和和沉沉淀淀的的胰胰蛋蛋白白酶酶收收率率在在8080以以上上，纯纯化化倍倍数达到数达到8 8，比活达到，比活达到1300013000U/mgU/mg，接近纯酶的水平。接近纯酶的水平。nPLSPLS的的优优点点是是，在在很很宽宽的的PHPH值值范范围围内内和和有有机机溶溶解解中中均均表表现现出出良良好好的的稳稳定定性性，经经配配基基修修饰饰后后具具有有很很好好的的蛋蛋白白质质亲亲和和沉沉淀淀特特性性：蛋白质吸附容量大，无非特异性吸附。蛋白质吸附容量大，无非特异性吸附。(2)合成可逆性溶解聚合

23、物(应用离子强度敏感性)第三十一页，讲稿共一百零二页哦可逆沉淀性聚合物可逆沉淀性聚合物 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺第三十二页，讲稿共一百零二页哦n亲亲和和配配基基载载体体Eudragit Eudragit S-100S-100，它它是是甲甲基基丙丙烯烯酸酸(methacrylic methacrylic acid)acid)和甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸甲酯(methyl methacrylate)methyl methacrylate)的聚合物。的聚合物。nEudragit Eudragit S-100S-100在在PHPH低低于于5 5时时发发生生可可逆逆性性沉沉淀淀；在在(NHNH4 4)2 2

24、SOSO4 4或或PEG8000PEG8000存在的情况下，沉淀发生的存在的情况下，沉淀发生的PHPH值相对高一些。值相对高一些。nEudragitEudragit与与亲亲和和配配基基染染料料Cibucron Cibucron BlueBlue的的复复合合物物Eudragit-Eudragit-Cibacron Cibacron BlueBlue在在CaCa2+2+存存在在的的条条件件下下，温温度度达达到到4040，在在任任何何PHPH值范围内都会发生可逆性沉淀。值范围内都会发生可逆性沉淀。n这这就就扩扩大大了了EudragitEudragit的的应应用用范范围围，尤尤其其是是对对那那些些在在

25、酸酸性性条条件件容容易变性的酶类。易变性的酶类。(2)合成可逆性溶解聚合物第三十三页，讲稿共一百零二页哦 亲和沉淀的亲和配基 n在在很很多多情情况况下下，亲亲和和沉沉淀淀时时将将亲亲和和配配基基固固定定在在可可逆逆性性溶溶解解聚聚合合物物上上，亲亲和和沉沉淀淀的的亲亲和和配配基基和和亲亲和和层层析析的的配配基基没没有有太太大大差差异异，包包括括生生物物专专一一性性配配基基如如辅辅酶酶、蛋蛋白白质质A A及及非非专专一一性性亲和配基如染料、金属离子等。亲和配基如染料、金属离子等。n采采用用双双金金属属离离子子螯螯和和的的双双功功能能试试剂剂，将将金金属属离离子子固固定定在在一一些些可可以以固固定

26、定金金属属离离子子的的二二聚聚物物如如poly-VI-VCLpoly-VI-VCL和和poly-VI-PIPAMpoly-VI-PIPAM。这这些些聚聚合合物物上上有有多多个个咪咪唑唑基基，可可以以结结合合金金属属离离子子CuCu2+2+。CuCu2+2+-poly-VI-NIPAMpoly-VI-NIPAM已已成成功功地地用用来来沉沉淀淀分分离离大大豆豆蛋蛋白白酶酶抑抑制制剂剂；CuCu2+2+-poly-VI-VCL-poly-VI-VCL可用于分离纯化乙酸脱氢酶。可用于分离纯化乙酸脱氢酶。第三十四页，讲稿共一百零二页哦poly-VI-NIPAM poly VI-VCL 亲和沉淀的亲和配基

27、 第三十五页，讲稿共一百零二页哦6.2.3 亲和沉淀的展望亲和沉淀是一种简单、高效的分离纯化技术，已在多种蛋白的分离纯化中应用。n pH敏感性亲和沉淀敏感性亲和沉淀n 热诱导亲和沉淀热诱导亲和沉淀n 离子强度敏感性的亲和沉淀离子强度敏感性的亲和沉淀n 亲和沉淀和其他技术的集成亲和沉淀和其他技术的集成n 制备规模的亲和沉淀制备规模的亲和沉淀第三十六页，讲稿共一百零二页哦 (1)pH敏感性亲和沉淀 pHpH敏敏感感性性聚聚合合物物本本身身带带有有电电荷荷，当当它它的的净净电电荷荷减减少少时时，溶溶解解度度降降低低而而发发生生沉沉淀淀，通通过过改改变变pHpH值值改改变变其其溶溶解解状状态态，以以此

28、此类类聚聚合合物物作作为为载载体体结结合合亲亲和和配配基基用用于于亲亲和和沉沉淀淀。pHpH敏敏感感性性聚聚合合物物包括：包括：n 天然可逆性聚合物：脱乙酰壳聚糖天然可逆性聚合物：脱乙酰壳聚糖(chitosan)chitosan)、藻酸盐藻酸盐 (alginate)alginate)、纤维素衍生物（纤维素衍生物（cellulosecellulose）；）；n 合成可逆性聚合物：丙烯酰胺、合成可逆性聚合物：丙烯酰胺、N-N-丙烯酰丙烯酰-p-p-氨基苯酸、氨基苯酸、N-N-丙烯酰丙烯酰-m-m-氨基苯酰胺的共聚物，甲基丙烯酸氨基苯酰胺的共聚物，甲基丙烯酸(methacrylic methacry

29、lic acid)acid)和甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸甲酯(methyl methacrylate)methyl methacrylate)的聚合的聚合 物，异丁烯酸物，异丁烯酸-异丁烯酸甲酯共聚物等异丁烯酸甲酯共聚物等第三十七页，讲稿共一百零二页哦 对对某某些些可可逆逆溶溶解解性性聚聚合合物物，通通过过改改变变温温度度可可改改变变溶溶解解度度。在在亲亲和和沉沉淀淀中中使使用用的的热热聚聚合合物物用用于于蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化时时，能能够够进进行行特特异异性性沉沉淀淀，称称为为热热诱诱导导亲亲和和沉沉淀淀。其其原原理理是是利利用用双双官官能能团团试试剂剂，其其中中一一部部分分功功能

30、能基基团团与与被被分分离离的的生生物物分分子子特特异异性性结结合合，另另一一部部分分功功能能基基团团在在介介质质性性质质尤尤其其是是温温度度变变化化后后能形成沉淀。能形成沉淀。(2)热诱导亲和沉淀第三十八页，讲稿共一百零二页哦n对对氨氨基基苯苯甲甲眯眯结结合合到到异异丙丙基基酰酰胺胺的的共共聚聚物物上上就就得得到到已已蛋蛋白白酶酶的的热热亲亲和和沉沉淀淀聚聚合合物物，将将这这种种沉沉淀淀剂剂加加入入胰胰蛋蛋白白酶酶提提取取液液中中形形成成以以蛋白酶蛋白酶-聚合物复合体聚合物复合体。n滤滤液液中中剩剩余余的的酶酶活活仅仅为为原原酶酶活活的的7%7%。过过滤滤得得到到沉沉淀淀复复合合物物，加加入入

31、缓缓冲冲液液中中加加热热，使使胰胰蛋蛋白白酶酶和和聚聚合合物物脱脱离离，得得到到分分离离纯纯化化的酶。的酶。n热热诱诱导导亲亲和和沉沉淀淀可可以以和和亲亲和和配配基基如如金金属属离离子子结结合合起起来来，如如Cu-IDA-PVCLCu-IDA-PVCL是是一一种种人人诱诱导导聚聚合合物物，可可用用于于乙乙酸酸脱脱氢氢酶酶的的分分离离纯化。纯化。(2)热诱导亲和沉淀（应用）第三十九页，讲稿共一百零二页哦(3)离子强度敏感性的亲和沉淀 此此类类聚聚合合物物在在很很宽宽的的pHpH范范围围内内对对有有机机溶溶剂剂表表现现出出良良好好的的稳稳定定性，性，当添加或除去盐是发生可逆性沉淀。当添加或除去盐是

32、发生可逆性沉淀。孙孙彦彦等等人人研研制制了了含含有有共共轭轭二二炔炔结结构构单单元元的的磷磷脂脂酰酰乙乙醇醇胺胺型型聚聚合合脂脂质质体体(Polymerized Polymerized Liposome,PLS)Liposome,PLS)具具有有这这种种性性质质，这这在在前前面面已经叙述过。已经叙述过。第四十页，讲稿共一百零二页哦 (4)亲和沉淀和其他技术的集成 n双水相萃取技术双水相萃取技术易于直接处理含细胞碎片的体系，可以和亲和沉易于直接处理含细胞碎片的体系，可以和亲和沉淀技术结合起来，提高分离效率。淀技术结合起来，提高分离效率。nKamihiraKamihira等人将亲和沉淀和双水相技术

33、结合等人将亲和沉淀和双水相技术结合分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质A An亲和沉淀的可逆溶解聚合物亲和沉淀的可逆溶解聚合物Eudragit S-100Eudragit S-100，以以免疫球蛋白免疫球蛋白IgGIgG为配基为配基nEudragitEudragit主要分配在上相，因此和蛋白主要分配在上相，因此和蛋白A A 结合的结合的EudragitEudragit分配分配在上相，分出上相后，在上相，分出上相后，调节调节pHpH使使EudragitEudragit沉淀，再将沉淀复沉淀，再将沉淀复合物解离便可得到蛋白合物解离便可得到蛋白A A，同时上相的聚合物可以重复使用。同时上相的聚合物可以重复使用

34、。具体过程如图所示。具体过程如图所示。第四十一页，讲稿共一百零二页哦第四十二页，讲稿共一百零二页哦制备规模的亲和沉淀(1)(1)T1T1中加入料液中加入料液(2)(2)调节温度至调节温度至44(3)(3)加入加入AMLAML和助滤剂和助滤剂(4)(4)调节温度至调节温度至3030进行沉淀进行沉淀(5)30(5)30下，在下，在F1F1中进行混合物的过滤，在中进行混合物的过滤，在T2T2中收集滤液中收集滤液(6)30(6)30下，用硫酸铵溶液洗涤滤饼，在下，用硫酸铵溶液洗涤滤饼，在T2T2中收中收集滤液集滤液(7)30(7)30下，用洗脱液洗涤滤饼，在下，用洗脱液洗涤滤饼，在T3T3中收集中收集

35、含有目标分子的洗脱液含有目标分子的洗脱液(8)(8)洗涤并回收洗涤并回收AMLAML和过滤助剂，重复利用和过滤助剂，重复利用第四十三页，讲稿共一百零二页哦6.3 亲和膜分离技术亲和膜分离技术n 亲和膜的原理及特点n 亲和膜的制备 膜材料和（基质）配基的选择膜材料和（基质）配基的选择 亲和膜的制备亲和膜的制备n 亲和膜分离的理论模型 吸附模型吸附模型 亲和膜过程传质模型亲和膜过程传质模型 n 亲和膜分离技术的影响因素n 亲和膜分离技术的应用第四十四页，讲稿共一百零二页哦6.3.1 亲和膜的原理和特点 亲和膜分离是将亲和分离技术和膜分离技术结合，它将亲亲和膜分离是将亲和分离技术和膜分离技术结合，它

36、将亲和配基结合在分离膜上，利用膜作为基质，对膜进行改性，再和配基结合在分离膜上，利用膜作为基质，对膜进行改性，再按照吸附、清洗、洗脱和再生的过程，对生物产品进行分离纯按照吸附、清洗、洗脱和再生的过程，对生物产品进行分离纯化。化。第四十五页，讲稿共一百零二页哦亲和膜分离亲和色谱原理利用膜固定亲和配基利用膜固定亲和配基利用层析介质利用层析介质固定亲和配基固定亲和配基过程一般为低压，可连续操作一般为低压，可连续操作低、中、高都有，低、中、高都有，一般为间歇式操作一般为间歇式操作设备板式、卷式、中空纤维式超板式、卷式、中空纤维式超滤或微滤膜滤或微滤膜填料一般在柱中进行填料一般在柱中进行速度快，扩散阻力

37、小快，扩散阻力小较慢，扩散阻力较大较慢，扩散阻力较大产物纯度相对较低纯度相对较低纯度很高纯度很高亲和膜和普通的亲和层析的比较 第四十六页，讲稿共一百零二页哦具有相同传质效率的亲和膜与亲和色谱装置参数 中空纤维亲和膜装填100m凝胶粒子的亲和色谱装置流体停留时间0.014min34.7min装置体积0.773dm31070dm3平均流速1.4dm3/min1.4dm3/min配基装填量1.9g1950g第四十七页，讲稿共一百零二页哦 膜多孔床上的配基和液流之间的扩散路径极短，传质速膜多孔床上的配基和液流之间的扩散路径极短，传质速率很高，可更有效的利用配基，所以大大加快了分离时间，率很高，可更有效

38、的利用配基，所以大大加快了分离时间，提高了分离效率。提高了分离效率。膜床的厚度一般较小，液流通过膜时的阻力也较小，膜床的厚度一般较小，液流通过膜时的阻力也较小，因此压降也较小，便于实现大规模的分离和连续、自动因此压降也较小，便于实现大规模的分离和连续、自动操作。操作。第四十八页，讲稿共一百零二页哦亲和膜的操作模式死端过滤模式死端过滤模式Dead-end mode错流过滤模式错流过滤模式Cross-flow moden 微孔亲和过滤膜n 亲和超滤膜 第四十九页，讲稿共一百零二页哦亲和膜的形状n 板式n 圆盘式n 中空纤维式 前两种较为简单，成本低，容量小，中空纤维前两种较为简单，成本低，容量小，

39、中空纤维式便于实现连续、自动、规模化操作式便于实现连续、自动、规模化操作第五十页，讲稿共一百零二页哦膜材料（基质）和配基的选择 亲和膜对基质材料的要求 (1)(1)惰性；惰性；(2)(2)具有亲水性；具有亲水性；(3)(3)物理、化学性质稳定，同时机械稳定性也好；物理、化学性质稳定，同时机械稳定性也好；(4)(4)多孔性，内外表面积大；多孔性，内外表面积大；(5)(5)具有足够多的可利用的化学基团；具有足够多的可利用的化学基团；(6)(6)非特异性吸附低；非特异性吸附低；(7)(7)适于成膜适于成膜6.3.2 亲和膜的制备第五十一页，讲稿共一百零二页哦 亲和膜的制备常用亲和膜基质材料n 脂族烃

40、类（聚乙烯，聚丙烯，聚丙烯氢）n 芳香族共聚物（聚碳酸酯，聚砜，聚醚砜）n 脂族聚酰胺（尼龙6，尼龙66）一些特殊的聚合物，如聚乙烯醇，纤维素和纤维素的一些特殊的聚合物，如聚乙烯醇，纤维素和纤维素的衍生物等衍生物等 第五十二页，讲稿共一百零二页哦膜材料制造商膜特性应用NalgeneMemtek Corp.圆形圆形,2.5cm,4.7cm,2.5cm,4.7cm,孔径孔径0.20.2,0.5,0.5,交联、结合交联、结合酶及血清白蛋白的酶及血清白蛋白的纯化纯化ActidickFMC Corp.圆形圆形,孔径孔径1 1,交联、包埋交联、包埋肽、蛋白质及酶的肽、蛋白质及酶的固载化固载化MemSep

41、1010Millipore圆形圆形,床体积床体积1.41.4ml,ml,孔径孔径1.21.2，结合蛋白结合蛋白A 6mgA 6mg单抗和多抗的分离单抗和多抗的分离MemSep 1010Millipore床体积床体积4.94.9ml,ml,蛋白蛋白A 28mgA 28mg单抗和多抗的分离单抗和多抗的分离NugelSeparation Corp.平板式平板式1010cmcm20cm,20cm,包埋、涂包埋、涂层、结合层、结合抗原、抗体、重组抗原、抗体、重组蛋白及酶的纯化蛋白及酶的纯化聚合物、硅胶聚合物、硅胶Biotechnology Inst.of Canada板式亲和超滤，结合型板式亲和超滤，结

42、合型胰蛋白酶和胰凝乳胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的纯化蛋白酶的纯化PolymerBiochemic板式板式1515cmcmcm,cm,结合孔径结合孔径0.20.22 2细胞生长剂，细胞生长剂，IgGIgG、干扰素纯化干扰素纯化（氨基苯甲醚）（氨基苯甲醚）Fiuka卷式（卷式（0.30.3cmcm3cm3cm），），结合孔结合孔径径0.20.2RNARNA、DNADNA转录，中转录，中性蛋白纯化性蛋白纯化Protrans大连化物所大连化物所板式板式1010cmcm10cm,10cm,结合孔径结合孔径0.20.20.50.5cmcm胰蛋白酶胰蛋白酶抑制剂的分离抑制剂的分离 第五十三页，讲稿共一百零二页哦

43、亲和膜的制备亲和配基n 特异性配基：只与其对应的分子特异性结合，如抗原、抗体、激素、激素受体等 常见的特异性配基：常见的特异性配基：肝素、伴刀豆蛋白肝素、伴刀豆蛋白A A、单克隆抗体、胰蛋白酶等单克隆抗体、胰蛋白酶等n 通用型配基：与某一类物质结合 常见的通用型配基：常见的通用型配基：NAD+NAD+、NADP+NADP+等辅酶；等辅酶；Cibacron Blue F3G-ACibacron Blue F3G-A、Procion Red H-3BProcion Red H-3B、Procion Procion Blue MX-3GBlue MX-3G等活性染料等活性染料 金属离子（金属离子（C

44、uCu2+2+、NiNi2+2+、FeFe2+2+、ZnZn2+2+）亲和膜的亲和配基一般可分为两类：特异性配基和通用型配基第五十四页，讲稿共一百零二页哦配基应用的膜生物特异性配基Protein AProtein A中空纤维膜，平板膜中空纤维膜，平板膜白细胞间介素白细胞间介素2 2受体受体中空纤维膜中空纤维膜肝素肝素聚合物聚合物/共聚物膜共聚物膜sartobindsartobind单克隆抗体单克隆抗体中空纤维中空纤维胰蛋白酶胰蛋白酶改性聚砜膜改性聚砜膜通用性配基Cibraon BlueCibraon Blue聚合物聚合物/共聚物膜共聚物膜sartobindsartobind，尼尼龙膜，壳聚糖膜

45、龙膜，壳聚糖膜IDA-CuIDA-Cu2+2+改性改性PEPE膜，聚合物膜，聚合物/共聚物膜共聚物膜sartobindsartobind，改性聚砜膜改性聚砜膜苯丙氨酸苯丙氨酸改性改性PEPE膜膜组氨酸或糖多菌素组氨酸或糖多菌素尼龙尼龙6666平板膜平板膜常见亲和膜配基第五十五页，讲稿共一百零二页哦间隔臂 在在分分离离生生物物大大分分子子时时，若若将将亲亲和和配配基基直直接接结结合合到到基基质质上上，由由于于欲欲分分离离生生物物大大分分子子的的立立体体构构型型使使它它很很难难接接近近介介质质上上的的配配基基产产生生亲亲和和相相互互作作用用，此此即即色色谱谱分分离离中中的的“空空间间位位阻阻”效效

46、应应。这这种种情情况况在在配配基基是是小小分分子子时时表表现现尤尤为为明明显显，为为了了克克服服这这种种障障碍碍，往往往往在在介介质质和和配配基基之之间间插插入入一一个个具具有有一一定定几几何何长长度度的的有有机机基基团团，即即间间隔隔臂臂，以以使使欲欲分分离离的的物物质质方方便便的的接接近近亲亲和和配配基基上上的的作作用位点。用位点。第五十六页，讲稿共一百零二页哦 对对于于一一个个理理想想的的间间隔隔臂臂，不不仅仅要要具具有有一一定定的的长长度度（至至少少要要含含3 3个个以以上上原原子子），而而且且要要求求其其自自身身不不带带任任何何电电荷荷，疏疏水水性性也也不不能能太太强强，不不带带任任

47、何何附附加加的的活活性性中中心心，以以避避免免对对分分离离物物产产生生非非特特异异性性相相互互作作用用。由由于于间间隔隔臂臂既既要要与与亲亲和和介介质质相相连连，又又要要与与配配基基相相接接，因因此此要要求求其其分分子子上上含含有有双双官官能能团团反反应应基基。间间隔隔臂臂长长度度一一般般以以5-5-5050nmnm较为适宜。较为适宜。常用的间隔臂是含2个活泼氨基的二胺类化合物，如乙二胺、丙二胺、己二胺、对苯二胺等。此外许多氨基酸和肽类化合物，由于其分子含有氨基、羧基、羟基、巯基等可反应的基团，也可用作间隔臂。间隔臂第五十七页，讲稿共一百零二页哦亲和膜的制备 很很多多膜膜材材料料不不能能直直接

48、接应应用用于于亲亲和和膜膜的的分分离离，必必须须改改性性后后才才可可以以使使用用。改改性性的的目目的的侧侧重重于于增增加加膜膜的的亲亲水水性性、生生物物相相容容性性，降降低低非非特特异异性性吸吸附附，同同时时膜膜应应具具有有良良好好的的机机械械强强度度、孔孔结结构构、渗渗透透性性和和均均匀匀的孔分布。改性的膜再接上亲和配基制备成亲和膜。的孔分布。改性的膜再接上亲和配基制备成亲和膜。亲和膜的制备主要分为三步亲和膜的制备主要分为三步:成膜、功能化、活化第五十八页，讲稿共一百零二页哦按机械先后顺序不同可分为以下两种途径：n 膜材料膜材料功能化的膜材料功能化的膜材料功能化的膜功能化的膜活化的膜活化的膜

49、n 膜材料膜材料包埋或结合亲和配基包埋或结合亲和配基功能化的膜功能化的膜亲和膜的制备 功能化，通过引用适当的基团，使膜改性；活化，引入基团使膜的活性增强、能与配基作用 具具体体采采用用哪哪一一种种途途径径更更好好，因因材材料料而而异异，一一般般认认为为活活化化在在成成膜膜后后机机械械更更好好一一些些，成成膜膜方方法法有有溶溶胶胶凝胶转化法，静电纺丝法凝胶转化法，静电纺丝法第五十九页，讲稿共一百零二页哦纤维素亲和膜的制备 由由于于纤纤维维素素膜膜分分子子上上有有许许多多羟羟基基，因因此此可可以以用用碳碳二二胺胺法法，氧化物法等羟基活化方法进行活化氧化物法等羟基活化方法进行活化,然后结合上亲和配基

50、。然后结合上亲和配基。商商振振华华等等用用3-3-氯氯-1,2-1,2-环环氧氧丙丙烷烷活活化化纤纤维维素素以以对对苯苯二二胺胺作作为为间间隔隔臂臂，然然后后偶偶合合牛牛血血清清白白蛋蛋白白活活性性染染料料作作配配基基，制制得得一一系系列列亲亲和和膜膜，并并用用于于-干干扰扰素素、白白蛋蛋白白、碱碱性性磷磷酸酸酯酯酶酶等等的的分分离离纯纯化化，效果良好。效果良好。第六十页，讲稿共一百零二页哦纤维素膜的交联和活性染料配基的固载化第六十一页，讲稿共一百零二页哦 聚聚酰酰胺胺膜膜可可以以先先用用酸酸水水解解改改性性，然然后后结结合合上上羟羟乙乙基基纤纤维维素素以以增增强强反反应应基基团团的的活活性性