固相膜免疫测定.ppt

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1、关于固相膜免疫测关于固相膜免疫测定定现在学习的是第1页，共28页第十一章第十一章固相膜免疫分析技术固相膜免疫分析技术现在学习的是第2页，共28页l掌握：掌握：免疫印迹试验免疫印迹试验l熟悉：熟悉：胶体金免疫技术的方法学胶体金免疫技术的方法学种类与原理种类与原理l了解：了解：胶体金与免疫金的制备、胶体金与免疫金的制备、其他膜载体免疫分析技术其他膜载体免疫分析技术现在学习的是第3页，共28页一一 概述概述二二 免疫层析试验免疫层析试验三三 免疫渗滤试验免疫渗滤试验四四 斑点酶联免疫吸附试验斑点酶联免疫吸附试验五五 免疫印迹试验免疫印迹试验六六 影响固相膜免疫试验的主要因素影响固相膜免疫试验的主要因

2、素七七 固相膜免疫分析技术的临床应用固相膜免疫分析技术的临床应用现在学习的是第4页，共28页概述概述l固相膜免疫分析技术固相膜免疫分析技术(solid phase membrane-based immunoassay)l特点特点:以以微孔膜微孔膜作为固相载体作为固相载体 多孔性多孔性,非共价键高度吸附抗原或抗体非共价键高度吸附抗原或抗体 易于漂洗易于漂洗现在学习的是第5页，共28页第二节第二节 免疫层析试验免疫层析试验免疫层析试验原理：免疫层析试验原理：以以NCNC膜膜等为固相载体，等为固相载体，样品样品溶液借助毛细作用溶液借助毛细作用在层析条上在层析条上泳动泳动，同时样品中的待测物与层析材，

3、同时样品中的待测物与层析材料上待测物的受体（料上待测物的受体（抗原或抗体）发生高特异性、抗原或抗体）发生高特异性、高亲和性的免疫反应高亲和性的免疫反应，层析过程中，层析过程中免疫复合物被富集免疫复合物被富集或截留或截留在层析材料的一定区域，通过在层析材料的一定区域，通过目测或仪器目测或仪器检测检测标记物，在短时间内得到直观的实验结果。标记物，在短时间内得到直观的实验结果。现在学习的是第6页，共28页l毛细作用l是指浸润液体在细管里升高的现象和不浸润液体在细管里降低的现象现在学习的是第7页，共28页第二节第二节 免疫层析试验免疫层析试验免疫层析试验分为：免疫层析试验分为：l胶体金免疫层析试验（胶

4、体金免疫层析试验（ICAICA）l荧光免疫层析试验（荧光免疫层析试验（GICAGICA）现在学习的是第8页，共28页 二、二、测定模式测定模式（一）胶体金免疫层析试验（一）胶体金免疫层析试验l1、双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原l2 2、竞争法测小分子抗原、竞争法测小分子抗原l3 3、间接法测抗体、间接法测抗体 现在学习的是第9页，共28页l胶体金免疫层析试验胶体金免疫层析试验A AG GC CB B双抗体夹心法测大分子抗原双抗体夹心法测大分子抗原（阳性，（阳性，2个条带）个条带）现在学习的是第10页，共28页l胶体金免疫层析试验胶体金免疫层析试验A AG GC CB B竞争法测小分子抗原

5、（阴性，竞争法测小分子抗原（阴性，2个条带）个条带）现在学习的是第11页，共28页 三三 技术要点技术要点l操作要点：操作要点：（1 1）将试剂条标记线一端浸入待测标本中）将试剂条标记线一端浸入待测标本中2-5s,2-5s,或或在标本加样处加一定量待检标本在标本加样处加一定量待检标本,平放于水平桌平放于水平桌面上面上（2 2）在）在5-205-20分钟内观察结果分钟内观察结果结果判断结果判断 夹心法：阴性夹心法：阴性:1:1条棕红色指控条带条棕红色指控条带 阳性阳性:出现出现2 2条棕红色条带条棕红色条带 无棕红色条带出现为试剂失效无棕红色条带出现为试剂失效竞争法：竞争法：阴性阴性:出现出现2

6、 2条棕红色条带。条棕红色条带。阳性阳性:1:1条棕红色指控条带条棕红色指控条带现在学习的是第12页，共28页 第三节第三节 免疫渗滤试验免疫渗滤试验1 1 原理原理l在在硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜为载体并为载体并包被了抗原或抗包被了抗原或抗体体的渗滤装置中，的渗滤装置中，依次滴加标本、免疫金及依次滴加标本、免疫金及洗涤液洗涤液，因微孔滤膜贴置于吸水材料上故，因微孔滤膜贴置于吸水材料上故溶液流经渗滤装置时与膜上的抗原或抗体溶液流经渗滤装置时与膜上的抗原或抗体快速结合并起到浓缩作用，达到检测目的。快速结合并起到浓缩作用，达到检测目的。2 2 方法类型方法类型双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原间接

7、法测特异性抗体间接法测特异性抗体现在学习的是第13页，共28页三、试剂盒组成和技术要点三、试剂盒组成和技术要点 渗滤装置渗滤装置胶体金标志物胶体金标志物洗涤液洗涤液AgAg参照品参照品现在学习的是第14页，共28页技术要点：技术要点：1 1、平放反应板，于小孔内滴加含待测、平放反应板，于小孔内滴加含待测AgAg标本标本1-21-2滴滴，与膜上的，与膜上的AbAb反应而结合在膜上反应而结合在膜上2 2、于小孔内滴加胶体金标记、于小孔内滴加胶体金标记AbAb试剂试剂1-21-2滴，使胶滴，使胶体金标记体金标记AbAb与结合在膜上的与结合在膜上的AgAg反应反应3 3、于小孔内滴加洗涤液、于小孔内滴

8、加洗涤液2-32-3滴，待完全渗入，洗滴，待完全渗入，洗去未结合的胶体金标记去未结合的胶体金标记AbAb。4 4、结果观察：、结果观察：阳性阳性 膜中央有淡红色或红色斑点膜中央有淡红色或红色斑点 现在学习的是第15页，共28页第四节第四节.斑点酶免疫吸附斑点酶免疫吸附试验试验 (Dot-ELISA)(Dot-ELISA)现在学习的是第16页，共28页l技术要点：技术要点：1 1、抗原包被、抗原包被 NCNC膜吸附力强，包被后封闭。膜吸附力强，包被后封闭。2 2、抗原抗体反应、抗原抗体反应 抗原抗体反应后再加二抗抗原抗体反应后再加二抗3 3、确定酶结合物最佳稀释度、确定酶结合物最佳稀释度阴性样品

9、不显色，阳性显色最强时的酶结合物稀释度阴性样品不显色，阳性显色最强时的酶结合物稀释度4 4、显色反应、显色反应 pH值值5.8-6.0时反应最灵敏时反应最灵敏强阳性蓝黑色斑点强阳性蓝黑色斑点 弱阳性淡绿色半点弱阳性淡绿色半点现在学习的是第17页，共28页l方法学评价：方法学评价：1 1、NCNC吸附力强，吸附力强，灵敏度较灵敏度较ELISAELISA高高6 68 8倍；倍；2 2、可同时检测多种抗体；、可同时检测多种抗体；3 3、操作简便不需特殊仪器设备、操作简便不需特殊仪器设备4 4、吸附抗原（抗体）或已有结果的、吸附抗原（抗体）或已有结果的NCNC膜可长期保存，不影响期活性。膜可长期保存，

10、不影响期活性。现在学习的是第18页，共28页 第五节第五节.免疫印迹试验免疫印迹试验 （immunoblot test,IBT）l免疫印迹试验免疫印迹试验将凝胶电泳的高分辨率与抗原抗体反将凝胶电泳的高分辨率与抗原抗体反应的高特异性结合应的高特异性结合.又称又称Western blot.是检测蛋白质特性、表达及分布的一是检测蛋白质特性、表达及分布的一种最常用的方法。种最常用的方法。l蛋白免疫印迹试验蛋白免疫印迹试验l重组免疫印迹试验重组免疫印迹试验现在学习的是第19页，共28页 二二 Western blot技术要点技术要点 :1.1.抗原印迹与包被抗原印迹与包被（SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶

11、电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳）电转移电转移 2.2.抗原抗体反应抗原抗体反应 （间接法）（间接法）3.3.检测检测现在学习的是第20页，共28页lSDS-PAGESDS-PAGE 抗原等蛋白样品经抗原等蛋白样品经SDSSDS处理后带阴处理后带阴电荷，在聚丙烯胺凝胶中从阴极向阳极电荷，在聚丙烯胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）色后才显出电泳区带）现在学习的是第21页，共28页现在学习的是第22页，共28页l电转移电转移 将在凝胶中已经分离的条带转移至将在凝胶中

12、已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V100V）和大电流（和大电流（1-2A1-2A），通电），通电45min45min转移即转移即可完成。此分阶段分离的蛋白质条带肉可完成。此分阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。眼仍不可见。现在学习的是第23页，共28页现在学习的是第24页，共28页l酶免疫定位酶免疫定位 将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜依次与特异性抗体和酶标第二抗体作依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。阳性反应的反应底物，使区带染色。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGESDS-PAGE加加入的分子量标准，确定各组分的分子入的分子量标准，确定各组分的分子量。量。现在学习的是第25页，共28页免免 疫疫 印印 迹迹 法法 现在学习的是第26页，共28页现在学习的是第27页，共28页感谢大家观看现在学习的是第28页，共28页