克隆基因的表达讲稿.ppt

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1、关于克隆基因的表达第一页，讲稿共五十七页哦第五章第五章 克隆基因的表达克隆基因的表达第一节第一节 基因表达的基本条件基因表达的基本条件第二节第二节 原核表达载体的构建原核表达载体的构建第三节第三节 克隆基因在植物细胞中的表达克隆基因在植物细胞中的表达第二页，讲稿共五十七页哦第一节第一节 基因表达的基本条件基因表达的基本条件1、基因表达的基本过程、基因表达的基本过程2、有效转录的基本条件、有效转录的基本条件3、正确翻译的基本条件、正确翻译的基本条件4、影响克隆基因表达效率的因素、影响克隆基因表达效率的因素第三页，讲稿共五十七页哦1、基因表达的基本过程、基因表达的基本过程第四页，讲稿共五十七页哦1

2、、基因表达的基本过程、基因表达的基本过程 基因的表达主要涉及到两个过程：转录和翻译。基因的表达主要涉及到两个过程：转录和翻译。首先，目的基因通过转录首先，目的基因通过转录(transcription)形成形成mRNA（信使（信使RNA,messenger RNA)；然然后后，tRNA（转转运运RNA,transfer RNA）将将各各种种氨氨基基酸酸运运送送到到核核糖糖体体并并按按照照mRNA的的密密码码子子顺顺序序将将各各种种氨氨基基酸酸连连接接成成特特定定的的氨氨基基酸酸序序列列(translation)最最终终得得到到基基因因的的表表达达产产物物（蛋白质）。（蛋白质）。第五页，讲稿共五十

3、七页哦第一节第一节 基因表达的基本条件基因表达的基本条件1、基因表达的基本过程、基因表达的基本过程2、有效转录的基本条件、有效转录的基本条件3、正确翻译的基本条件、正确翻译的基本条件4、影响克隆基因表达效率的因素、影响克隆基因表达效率的因素第六页，讲稿共五十七页哦Transcription(转录转录):making an RNA copy of a DNA sequence.RNA polymerase opens the part of the DNA to be transcribed.Only one strand of DNA(the template strand,antisense

4、 strand)is transcribed.转录的具体过程转录的具体过程第七页，讲稿共五十七页哦转录的具体过程转录的具体过程Antisense strand第八页，讲稿共五十七页哦有效转录的基本条件有效转录的基本条件Groups of genes coding for related proteins are arranged in units known as operons.An operon consists of an operator,promoter,regulator,and structural genes.The regulator gene codes for a rep

5、ressor protein that binds to the operator,obstructing the promoter of the structural genes.The regulator does not have to be adjacent to other genes in the operon.If the repressor protein is removed,transcription may occur.半乳糖苷酶半乳糖苷酶渗透酶渗透酶转乙酰基酶转乙酰基酶第九页，讲稿共五十七页哦第十页，讲稿共五十七页哦Operons are either inducibl

6、e or repressible according to the control mechanism.Seventy-five different operons controlling 250 structural genes have been identified for E.coli.Both repression and induction are examples of negative control since the repressor proteins turn off transcription.第十一页，讲稿共五十七页哦第十二页，讲稿共五十七页哦 启动子（启动子（pr

7、omoter）：在基因序列中，标志着转录起始的可被：在基因序列中，标志着转录起始的可被RNA聚聚合酶识别的位点合酶识别的位点(DNA区段区段)，一般位于基因的上游。，一般位于基因的上游。终止子（终止子（terminator）：位于基因的编码序列之外（一般在下游）：位于基因的编码序列之外（一般在下游）的一段标志着转录停止的的一段标志着转录停止的RNA聚合酶识别位点。聚合酶识别位点。有效转录的基本条件有效转录的基本条件Prokaryotic gene regulation differs from eukaryotic regulation,but since prokaryotes are mu

8、ch easier to work with,we focus on prokaryotes at this point.Promoters are sequences of DNA that are the start signals for the transcription of mRNA.Terminators are the stop signals.mRNA molecules are long(500-10,000 nucleotides).第十三页，讲稿共五十七页哦第一节第一节 基因表达的基本条件基因表达的基本条件1、基因表达的基本过程、基因表达的基本过程2、有效转录的基本条件

9、、有效转录的基本条件3、正确翻译的基本条件、正确翻译的基本条件4、影响克隆基因表达效率的因素、影响克隆基因表达效率的因素第十四页，讲稿共五十七页哦The Genetic Code To code for the 20 essential amino acids a genetic code must consist of at least a 3-base set(triplet)of the 4 bases.If one considers the possibilities of arranging four things 3 at a time(4X4X4),we get 64 poss

10、ible code words,or codons(a 3-base sequence on the mRNA that codes for either a specific amino acid or a control word).The genetic code was broken by Marshall Nirenberg and Heinrich Matthaei,a decade after Watson and Cricks work.The genetic code consists of 61 amino-acid coding codons and three term

11、ination codons,which stop the process of translation.The genetic code is thus redundant(degenerate in the sense of having multiple states amounting to the same thing),with,for example,glycine coded for by GGU,GGC,GGA,and GGG codons.正确翻译的基本条件正确翻译的基本条件第十五页，讲稿共五十七页哦The genetic code第十六页，讲稿共五十七页哦Messenge

12、r RNA(mRNA)is the blueprint for construction of a protein.Transfer RNA(tRNA)is the truck delivering the proper amino acid to the site at the right time.tRNA will form a cloverleaf structure due to complementary base pairing.At the top of the large loop are three bases,the anticodon,which is the comp

13、lement of the codon.There are 61 different tRNAs,each having a different binding site for the amino acid and a different anticodon.第十七页，讲稿共五十七页哦Ribosomes are the organelle(in all cells)where proteins are synthesized.They consist of two-thirds rRNA and one-third protein.Ribosomes consist of a small(i

14、n E.coli,30S)and larger(50S)subunits.The length of rRNAdiffers in each.The 30S unit has 16S rRNA and 21 different proteins.The 50S subunit consists of 5S and 23S rRNA and 34 different proteins.The smaller subunit has a binding site for the mRNA.The larger subunit has two binding sites for tRNA第十八页，讲

15、稿共五十七页哦Translation is the process of converting the mRNA codon sequences into an amino acid sequence.The initiator codon(AUG)codes for the amino acid N-formylmethionine(f-Met).No translation occurs without the AUG codon.f-Met is always the first amino acid in a polypeptide chain,although frequently

16、it is removed after translation.The intitator tRNA/mRNA/small ribosomal unit is called the initiation complex.The larger subunit attaches to the initiation complex.After the initiation phase the message gets longer during the elongation phase.第十九页，讲稿共五十七页哦New tRNAs bring their amino acids to the ope

17、n binding site on the ribosome/mRNA complex,forming a peptide bond between the amino acids.The complex then shifts along the mRNA to the next triplet,opening the A site.The new tRNA enters at the A site.When the codon in the A site is a termination codon,a releasing factor binds to the site,stopping

18、 translation and releasing the ribosomal complex and mRNA.Often many ribosomes will read the same message,a structure known as a polysome forms.In this way a cell may rapidly make many proteins.第二十页，讲稿共五十七页哦正确翻译的基本条件正确翻译的基本条件1 1、具备起始密码子、具备起始密码子2 2、具备终止密码子、具备终止密码子3 3、具有正确的阅读框、具有正确的阅读框第二十一页，讲稿共五十七页哦基基

19、因因表表达达的的基基本本过过程程第二十二页，讲稿共五十七页哦第一节第一节 基因表达的基本条件基因表达的基本条件1、基因表达的基本过程、基因表达的基本过程2、有效转录的基本条件、有效转录的基本条件3、正确翻译的基本条件、正确翻译的基本条件4、影响克隆基因表达效率的因素、影响克隆基因表达效率的因素第二十三页，讲稿共五十七页哦4、影响克隆基因表达效率的因素、影响克隆基因表达效率的因素 一般而言，所用启动子的强度、一般而言，所用启动子的强度、DNA的转录其始序列、密码子的的转录其始序列、密码子的选择、选择、mRNA的二级结构、转录的终止、基因的拷贝数等都会在一定程的二级结构、转录的终止、基因的拷贝数等

20、都会在一定程度上影响到转基因的表达。度上影响到转基因的表达。a.启动子的结构对表达效率的影响启动子的结构对表达效率的影响 大多数大肠杆菌启动子都含有两种保守区大多数大肠杆菌启动子都含有两种保守区,即即-10区区(位于转录其位于转录其始位点上游始位点上游5-10bp，故称为，故称为-10区，序列为区，序列为5-TTGACA)和和-35区区(位位于转录起始位点上游于转录起始位点上游25bp处，一般有处，一般有10bp组成，故称为组成，故称为-35区，区，5-TATAAT)。当然，实际的启动子中很少具备与上述序列完全一致的。当然，实际的启动子中很少具备与上述序列完全一致的区域，但是研究表明，启动子的

21、这两个区域与上述保守序列的相似区域，但是研究表明，启动子的这两个区域与上述保守序列的相似程度越高，该启动子的表达能力也就越强。另外，这两个保守区间程度越高，该启动子的表达能力也就越强。另外，这两个保守区间的距离也是影响启动子强度的重要因素，即这个间距越是接近于的距离也是影响启动子强度的重要因素，即这个间距越是接近于17bp，启动子的活性就越强。，启动子的活性就越强。第二十四页，讲稿共五十七页哦b.翻译起始序列对表达效率的影响翻译起始序列对表达效率的影响 mRNA的有效翻译依赖于核糖体和其的稳定结合，的有效翻译依赖于核糖体和其的稳定结合，大肠杆菌的大肠杆菌的mRNA序列中，核糖体的结合位点是起始

22、密码序列中，核糖体的结合位点是起始密码子子AUG和其上游的和其上游的SD序列。所谓序列。所谓SD序列序列就是由就是由Shine-Dalgarno首先提出的一种位于位于起始密码子上游的一段保守首先提出的一种位于位于起始密码子上游的一段保守序列，为细菌核糖体有效结合和翻译起始所必需。一般序列，为细菌核糖体有效结合和翻译起始所必需。一般SD序序列的长度约为列的长度约为3-9bp，位于起始密码子上游，位于起始密码子上游3-11碱基的位置，碱基的位置，它与它与16S核糖体核糖体RNA的的3端互补，控制了翻译的起始。端互补，控制了翻译的起始。-AGGAGGUXXXAUG-AGGAGGUXXXAUG-mRN

23、AAUUCCUCCACUAG-AUUCCUCCACUAG-16S rRNA3 末端末端第二十五页，讲稿共五十七页哦c.启动子与克隆基因间的距离对基因表达的影响启动子与克隆基因间的距离对基因表达的影响 研究表明启动子和目的基因间的距离对基因的表达效研究表明启动子和目的基因间的距离对基因的表达效率影响很大，所以在构建新的表达载体时要考虑到这仪因素率影响很大，所以在构建新的表达载体时要考虑到这仪因素的影响。另外，在克隆基因的末端要就近插入有效的终止子的影响。另外，在克隆基因的末端要就近插入有效的终止子序列，否则会导致细胞能量的大量消耗，或是形成不应有的序列，否则会导致细胞能量的大量消耗，或是形成不应

24、有的二级结构，最终影响的目的基因的表达效率。二级结构，最终影响的目的基因的表达效率。PromoterSDATGGeneTerminatorTAAmRNA第二十六页，讲稿共五十七页哦第五章第五章 克隆基因的表达克隆基因的表达第一节第一节 基因表达的基本条件基因表达的基本条件第二节第二节 原核表达载体的构建原核表达载体的构建第三节第三节 克隆基因在植物细胞中的表达克隆基因在植物细胞中的表达第二十七页，讲稿共五十七页哦第二节第二节 原核表达载体的构建原核表达载体的构建一、原核表达真核基因的困难一、原核表达真核基因的困难二、构建原核表达载体的策略二、构建原核表达载体的策略三、常用于原核表达载体的启动子

25、三、常用于原核表达载体的启动子第二十八页，讲稿共五十七页哦一、原核表达真核基因的困难一、原核表达真核基因的困难1.细菌的细菌的RNA聚合酶不识别真核基因的启动子；聚合酶不识别真核基因的启动子；2.真核基因转录的真核基因转录的mRNA缺乏缺乏SD序列，在原核细胞序列，在原核细胞中不能结合到核糖体上；中不能结合到核糖体上；3.真核基因一般含有内含子，而原核细胞没有象真核真核基因一般含有内含子，而原核细胞没有象真核细胞那样的转录后加工系统，所以细胞那样的转录后加工系统，所以mRNA中的内含中的内含子部分不能被切除，不能形成成熟的子部分不能被切除，不能形成成熟的RNA，也就不，也就不能表达出有功能的真

26、核蛋白；能表达出有功能的真核蛋白；4.表达的真核蛋白在原核细胞中很不稳定，容易被表达的真核蛋白在原核细胞中很不稳定，容易被细菌蛋白酶降解破坏。细菌蛋白酶降解破坏。第二十九页，讲稿共五十七页哦二、构建原核表达载体的策略二、构建原核表达载体的策略1.将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列的序列的下游，使得真核基因处于原核调控体系中。下游，使得真核基因处于原核调控体系中。2.采用真核基因的采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的基因，序列作为构建表达载体的目的基因，这样就解决了原核细胞没有这样就解决了原核细胞没有RNA剪接功能的问题。剪接功能的问

27、题。3.构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后面，构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，这样翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降解，最后可以将融就可以避免被原核蛋白酶的识别和降解，最后可以将融合多肽切除。合多肽切除。第三十页，讲稿共五十七页哦三、常用于原核表达的启动子三、常用于原核表达的启动子1.Lac启动子启动子 是是-半乳糖苷半乳糖苷酶酶编码编码基因基因LacZ的转录的调控的转录的调控序列，该启动子可以被序列，该启动子可以被IPTG诱导，所以在培养基中加入该诱导，所以在培养基中加入该安慰

28、诱导物就可以诱导目的基因的表达。安慰诱导物就可以诱导目的基因的表达。2.Trp启动子启动子 是编码参与色氨酸生物合成的几种酶的基因簇是编码参与色氨酸生物合成的几种酶的基因簇的上游调控序列，可以被色氨酸抑制，但可以被的上游调控序列，可以被色氨酸抑制，但可以被-吲哚丙吲哚丙烯酸（烯酸（-IAA）诱导。）诱导。3.Tac启动子启动子 是一种由是一种由Lac和和Trp启动子杂合而成的启动子，其强启动子杂合而成的启动子，其强度得到了很大的提高，也可被度得到了很大的提高，也可被IPTG诱导表达。诱导表达。4.PL启启动动子子 是是负责负责DNA分子转录的启动子之一，是一种极分子转录的启动子之一，是一种极强

29、的启动子。强的启动子。第三十一页，讲稿共五十七页哦第五章第五章 克隆基因的表达克隆基因的表达第一节第一节 基因表达的基本条件基因表达的基本条件第二节第二节 原核表达载体的构建原核表达载体的构建第三节第三节 克隆基因在植物细胞中的表达克隆基因在植物细胞中的表达第三十二页，讲稿共五十七页哦第三节第三节 克隆基因在植物细胞中的表达克隆基因在植物细胞中的表达一、真核基因表达的特点一、真核基因表达的特点二、用于植物表达的启动子类型二、用于植物表达的启动子类型三、三、Ti质粒及农杆菌介导的植物遗传转化质粒及农杆菌介导的植物遗传转化第三十三页，讲稿共五十七页哦真核基因表达的特点真核基因表达的特点1.一条成熟

30、的一条成熟的mRNA只能翻译成一条多肽，不存在象原核生物只能翻译成一条多肽，不存在象原核生物那样的多基因操纵子模式；那样的多基因操纵子模式；2.基基因因转转录录调调节节区区很很大大，而而且且往往往往远远离离启启动动子子达达几几百百个个甚甚至至上上千千个个碱碱基基，它它们们并并不不直直接接影影响响RNA聚聚合合酶酶与与启启动动子子区区的的结结合合，而而是是通通过过改改变变基基因因5上上游游区区DNA的的构构型来影响型来影响RNA聚合酶与启动子区的结合；聚合酶与启动子区的结合；3.mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作，合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作，而且通常都有复杂的成熟

31、和剪接过程；而且通常都有复杂的成熟和剪接过程；4.基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强子序基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强子序列存在。列存在。第三十四页，讲稿共五十七页哦真核基因转录起始位点上游序列的特点真核基因转录起始位点上游序列的特点 特点特点起始位点起始位点上游调控区上游调控区其它调控区其它调控区 原核生物原核生物嘌呤和嘧啶都能起始转嘌呤和嘧啶都能起始转录录范围小，范围小，-10区，区，-30到到-70区为正调控区，区为正调控区，+10到到-20区为负调控区为负调控区；区；有有TTGACA区区(-30-40）参与调控。）参与调控。真核生物真核生物有有“帽子帽子”结构专

32、一性（嘧啶结构专一性（嘧啶腺苷酸嘧啶），只有嘌呤腺苷酸嘧啶），只有嘌呤（A为主）才能起始转录为主）才能起始转录范围大，范围大，TATAA/TA区位于区位于-20到到-30，-40到到-110区为上游区为上游激活区；激活区；除了有对应的除了有对应的CAAT区外，区外，还有还有GC区和增强子。区和增强子。第三十五页，讲稿共五十七页哦基因转录起始位点上游序列的比较基因转录起始位点上游序列的比较TTGACATATAATPuPy-35区区-30-70正调控区正调控区-20负调控区负调控区+1-10区区GC区区.CAAT区区TATAAA T PuAPy-40-110+1-20-30增强子增强子CCGCCC

33、或或GGGCGG或或GGCCAATCT T A原核原核真核真核第三十六页，讲稿共五十七页哦第三节第三节 克隆基因在植物细胞中的表达克隆基因在植物细胞中的表达一、真核基因表达的特点一、真核基因表达的特点二、用于植物表达的启动子类型二、用于植物表达的启动子类型三、三、Ti质粒及农杆菌介导的植物遗传转化质粒及农杆菌介导的植物遗传转化第三十七页，讲稿共五十七页哦驱动转基因表达的启动子类型驱动转基因表达的启动子类型天然诱导天然诱导型启动子型启动子组织特异性表达组织特异性表达诱导型表达诱导型表达化学诱导型化学诱导型调控体系调控体系组织特异组织特异型启动子型启动子组成型表达组成型表达花椰采花叶病毒花椰采花叶

34、病毒(CaMV)35S启动子启动子水稻肌动蛋白水稻肌动蛋白1(actin 1)act1启动子启动子 第三十八页，讲稿共五十七页哦表达组织表达组织启动子来源启动子来源目的植物目的植物作者作者花药花药烟草烟草Ta29烟草烟草 油菜油菜Mariani（1990）种子种子菜豆植物凝集素基因菜豆植物凝集素基因PHA-LtobaccoAltabella（1990）叶片叶片PEPC（Pepcarboxylase Gene of Maize）maizeKozial（1993）韧皮部韧皮部水稻蔗糖合酶基因水稻蔗糖合酶基因RSs1tobaccoShi（1994）果实果实ovary tissue（patent）to

35、matoMartineau（1995）胚乳胚乳玉米淀粉合酶基因玉米淀粉合酶基因GBSmaizeRussell（1997）根系根系发根农杆菌的发根农杆菌的rolD启动子启动子番茄番茄Varvara（2001）髓部髓部玉米玉米pGL2riceDatta（1998）部分用于植物遗传转化的组织特异性启动子部分用于植物遗传转化的组织特异性启动子第三十九页，讲稿共五十七页哦RSuS1启动子的组织特异性表达启动子的组织特异性表达35S-GusRSP1/2-Gus第四十页，讲稿共五十七页哦 化学诱导型调控系统是指可被某些化学物质诱导而表达启化学诱导型调控系统是指可被某些化学物质诱导而表达启动或表达关闭的转基因

36、调控系统。和植物天然的诱导型启动子动或表达关闭的转基因调控系统。和植物天然的诱导型启动子相比，该类系统的应用更加灵活和自由，人们可以根据需求在相比，该类系统的应用更加灵活和自由，人们可以根据需求在转基因作物生长的任何时期对转基因的表达进行调控。转基因作物生长的任何时期对转基因的表达进行调控。作为理想的化学诱导物必须具备以下特性：第一，作为理想的化学诱导物必须具备以下特性：第一，化学诱导物要对转基因诱导的专一性高，在受体作物中化学诱导物要对转基因诱导的专一性高，在受体作物中其本身含量低且对受体作物无毒害作用；第二，对环境其本身含量低且对受体作物无毒害作用；第二，对环境友好，且造价不高；第三，诱导

37、效率要高，其工作浓度友好，且造价不高；第三，诱导效率要高，其工作浓度低且不是常用的化学物质；第四，方便于喷洒或蘸根处低且不是常用的化学物质；第四，方便于喷洒或蘸根处理。理。化学诱导型表达调控系统的原理化学诱导型表达调控系统的原理第四十一页，讲稿共五十七页哦用于转基因表达诱导物的分子式用于转基因表达诱导物的分子式Molecules used for the chemical induction of transgene expression in plants.TetracyclineDexamethasoneEthanolRH-5992第四十二页，讲稿共五十七页哦化学诱导型表达调控系统的原理化

38、学诱导型表达调控系统的原理 一般来说，化学诱导调控系统都包含一般来说，化学诱导调控系统都包含两个转录单元。第一个转录单元由一个组两个转录单元。第一个转录单元由一个组成型启动子（通常为成型启动子（通常为35S启动子）驱动一个启动子）驱动一个对特定化学成分敏感的转录调控因子构成；对特定化学成分敏感的转录调控因子构成；第二个转录单元由多拷贝的转录因子结合第二个转录单元由多拷贝的转录因子结合位点、微型植物启动子（通常为截短的位点、微型植物启动子（通常为截短的35S启动子）和目的基因串联而成。启动子）和目的基因串联而成。第四十三页，讲稿共五十七页哦A去抑制型去抑制型B失活型失活型第四十四页，讲稿共五十七

39、页哦第三节第三节 克隆基因在植物细胞中的表达克隆基因在植物细胞中的表达一、真核基因表达的特点一、真核基因表达的特点二、用于植物表达的启动子类型二、用于植物表达的启动子类型三、三、Ti质粒及农杆菌介导的植物遗传转化质粒及农杆菌介导的植物遗传转化第四十五页，讲稿共五十七页哦 人人们们很很早早就就发发现现双双子子叶叶植植物物常常发发生生一一种种冠冠瘿瘿瘤瘤病病，该该病病在在法法国国、东东欧欧和和意意大大利利的的葡葡萄萄和和果果树树上上曾曾大大面面积积发发生生。1907年年Smith和和Townsent等等首先发现这种冠瘿瘤首先发现这种冠瘿瘤病是由根癌农杆菌病是由根癌农杆菌引发的。引发的。农杆菌的农杆

40、菌的Ti质粒与植物遗传转化质粒与植物遗传转化第四十六页，讲稿共五十七页哦农杆菌的农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化质粒与植物遗传转化1974年年Zaenen等等在在根根癌癌农农杆杆菌菌内内发发现现并并分分离离了了一一种种与与肿肿瘤诱导有关的大型质粒（大于瘤诱导有关的大型质粒（大于200kb），称为），称为Ti质粒。质粒。1977年年Chilton等等在在研研究究农农杆杆菌菌侵侵染染后后形形成成的的植植物物肿肿瘤瘤细细胞胞时时，用用分分子子杂杂交交发发现现在在肿肿瘤瘤细细胞胞中中存存在在着着农农杆杆菌菌Ti质质粒粒的的一一个个片片段段，称称为为T-DNA（Transfer-DNA）。实实验验表表明明

41、，T-DNA转转移移到到植植物物细细胞胞后后整整合合进进植植物物基基因因组组中中并并得得以以表表达达，从从而而导导致致了了冠冠瘿瘿瘤瘤的的发发生生。进进一一步步研研究究发发现现，整整合合到到植植物物基基因因组组中中的的T-DNA可可以以通通过过减减数数分分裂裂稳稳定定地地传传给给植植物物的的后后代代，Ti质质粒粒的的上上述述特特性性成成为为农农杆杆菌菌介介导导法法植物遗传转化的重要基础。植物遗传转化的重要基础。第四十七页，讲稿共五十七页哦Ti质质粒粒为为根根癌癌农农杆杆菌菌核核外外的的一一种种环环状状双双链链DNA分分子子，长长约约200Kb。其其中中含含有有一一段段称称为为T-DNA的的可可

42、转转移移区区段段，当当农农杆杆菌菌侵侵染染寄寄主主细细胞胞后后，T-DNA可可以以从从农农杆杆菌菌转转移移到到寄寄主主细细胞胞内内并并整整合合到到寄寄主主细细胞胞的的基基因因组组中中。Ti质质粒粒的的这这一特性为农杆菌介导法植物转基因奠定了基础。一特性为农杆菌介导法植物转基因奠定了基础。T-DNA的的长长约约23Kb，在在其其两两端端各各有有一一个个25bp左左右右的的正正向向重重复复序序列列，称称之之为为T-DNA的的边边界界序序列列。在在不不同同的的农农杆杆菌菌Ti质质粒粒上上该该序序列列高高度度保保守守，一一般般认认为为右右端端重复序列对重复序列对T-DNA的转移起决定性作用。的转移起决

43、定性作用。农杆菌的农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化质粒与植物遗传转化第四十八页，讲稿共五十七页哦农农杆杆菌菌介介导导的的植植物物遗遗传传转转化化分分子子机机理理示示意意图图第四十九页，讲稿共五十七页哦影影响响农农杆杆菌菌介介导导法法水水稻稻转转基基因因的的因因素素共培养的条件（温度、激素和时间等）共培养的条件（温度、激素和时间等）植物愈伤组织的生理状态植物愈伤组织的生理状态受体作物的基因型受体作物的基因型用于转化的受体组织用于转化的受体组织农杆菌的活化状态农杆菌的活化状态农杆菌的菌种类型农杆菌的菌种类型愈伤组织诱导和植株再生的效率愈伤组织诱导和植株再生的效率转基因载体的类型转基因载体的类型第五十

44、页，讲稿共五十七页哦农杆菌介导法转基因的基本流程及优化策略农杆菌介导法转基因的基本流程及优化策略生理状态生理状态来源（盾片）来源（盾片）植物愈伤组织的诱导植物愈伤组织的诱导农杆菌的活化农杆菌的活化愈伤组织愈伤组织 农杆菌农杆菌的共培养的共培养抗性愈伤组织抗性愈伤组织获得及植株再生获得及植株再生菌菌 种种活化状态活化状态培养基成分培养基成分缩短组培时间缩短组培时间提高再生频率提高再生频率第五十一页，讲稿共五十七页哦2N6诱导愈伤诱导愈伤 7-10dN6-BA 预培养预培养 2-3d种子种子优化的农杆菌介导法水稻高效快速遗传转化体系优化的农杆菌介导法水稻高效快速遗传转化体系AB-AS 诱导诱导12

45、hAB培养基活化培养基活化12hYEP平板单菌落平板单菌落液体液体MS浸泡浸泡15min无生长素无生长素N6-AS共培养共培养 3dN6-H选择培养选择培养20d抗性愈伤组织的获得及植株再生抗性愈伤组织的获得及植株再生 30d62d70d第五十二页，讲稿共五十七页哦1 2N6愈伤诱导愈伤诱导2 N6-BA预培养预培养3 N6-H选择培养选择培养优化的农杆菌介导法水稻遗传转化过程优化的农杆菌介导法水稻遗传转化过程4 植植株株再再生生第五十三页，讲稿共五十七页哦第五章第五章 克隆基因的表达克隆基因的表达第一节第一节 基因表达的基本条件基因表达的基本条件第二节第二节 原核表达载体的构建原核表达载体的

46、构建第三节第三节 克隆基因在植物细胞中的表达克隆基因在植物细胞中的表达第五十四页，讲稿共五十七页哦第一节第一节 基因表达的基本条件基因表达的基本条件1、基因表达的基本过程、基因表达的基本过程2、有效转录的基本条件、有效转录的基本条件3、正确翻译的基本条件、正确翻译的基本条件4、影响克隆基因表达效率的因素、影响克隆基因表达效率的因素第五十五页，讲稿共五十七页哦第二节第二节 原核表达载体的构建原核表达载体的构建一、原核表达真核基因的困难一、原核表达真核基因的困难二、构建原核表达载体的策略二、构建原核表达载体的策略三、常用于原核表达载体的启动子三、常用于原核表达载体的启动子第五十六页，讲稿共五十七页哦感谢大家观看26.09.2022第五十七页，讲稿共五十七页哦