第十一章 种质离体保存精选文档.ppt

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1、第十一章种质离体保存本讲稿第一页，共三十一页11.211.2常低温和低温保存常低温和低温保存11.111.1种质常温保存种质常温保存11.311.3超低温保存超低温保存主要内容主要内容本讲稿第二页，共三十一页本讲稿第三页，共三十一页具有世界先进水具有世界先进水平的国家种质资平的国家种质资源库源库国家种质资源库内景一角国家种质资源库内景一角国家国家种质种质资源资源库内库内景景本讲稿第四页，共三十一页国家种质库国家种质库是全国作物种质资源长期保存与是全国作物种质资源长期保存与研究中心。该库在美国洛克菲勒基金会和国研究中心。该库在美国洛克菲勒基金会和国际植物遗传资源委员会的部分资助下，于际植物遗传资

2、源委员会的部分资助下，于19861986年年1010月在中国农业科学院落成，隶属于月在中国农业科学院落成，隶属于作物品种资源研究所。作物品种资源研究所。由试验区、种子入库前处理操作区、保存区由试验区、种子入库前处理操作区、保存区三部分组成三部分组成 。种质贮藏条件为：温度。种质贮藏条件为：温度-181181，相对湿度，相对湿度50%50%。本讲稿第五页，共三十一页国家种质库保存对象是国家种质库保存对象是农作物及其近缘野生植物种质资农作物及其近缘野生植物种质资源，这些资源是以种子作为种质的载体，其种子可耐低源，这些资源是以种子作为种质的载体，其种子可耐低温和耐干燥脱水。国家种质库在接纳到种子后，

3、需对种温和耐干燥脱水。国家种质库在接纳到种子后，需对种子进行清选、生活力检测、干燥脱水等入库保存前处理，子进行清选、生活力检测、干燥脱水等入库保存前处理，然后密封包装存入冷库。入库保存种子的初始发芽率一然后密封包装存入冷库。入库保存种子的初始发芽率一般要求高于般要求高于90%，种子含水量干燥脱水至，种子含水量干燥脱水至5%7%，大豆大豆8%。根据科学家估算，在上述贮藏条件下，一。根据科学家估算，在上述贮藏条件下，一般作物种子寿命可保存般作物种子寿命可保存50年以上。年以上。本讲稿第六页，共三十一页国家种质库的任务：国家种质库的任务：1.负责全国农业植物种质资源的长期保存，以及部分负责全国农业植

4、物种质资源的长期保存，以及部分粮食作物种质资源的中期保存。粮食作物种质资源的中期保存。2.进行低温库种质安全保存基础理论的研究，发展进行低温库种质安全保存基础理论的研究，发展库存种质安全保存的预警、监测及更新等技术。库存种质安全保存的预警、监测及更新等技术。3.研究无性繁殖作物、顽拗型种子作物等特殊种质的研究无性繁殖作物、顽拗型种子作物等特殊种质的中长期离体保存理论和技术，探索和发展种质资源中长期离体保存理论和技术，探索和发展种质资源新的保存方法与技术。新的保存方法与技术。本讲稿第七页，共三十一页保存对象：保存对象：凡能通过种子繁殖维持物种遗凡能通过种子繁殖维持物种遗传完整性的各类植物种质资源

5、，都可保存传完整性的各类植物种质资源，都可保存到国家种质库，其种子应是耐低温和耐干到国家种质库，其种子应是耐低温和耐干燥类型，即正常型种子（燥类型，即正常型种子（orthodox orthodox seedsseeds）。）。本讲稿第八页，共三十一页 入国家种质库保存种质的基本要求入国家种质库保存种质的基本要求提供每份种质材料的背景信息资料，如品种名称、提供每份种质材料的背景信息资料，如品种名称、学名（科、属、种的拉丁文）、原产地、繁育条件学名（科、属、种的拉丁文）、原产地、繁育条件及种植时间；及种植时间；每份送交材料须提供一定数量的种子，一般每份送交材料须提供一定数量的种子，一般3000至至

6、5000粒特殊情况可适当减少，但不应少于粒特殊情况可适当减少，但不应少于1500粒；粒；应是当季新种植收获的种子，发芽率一般要求应是当季新种植收获的种子，发芽率一般要求85%以上。种子无明显病虫损害，未受损伤和拌用药物或以上。种子无明显病虫损害，未受损伤和拌用药物或包衣处理；包衣处理；本讲稿第九页，共三十一页送交时包装的要求：送交或邮寄种子要妥善包装，送交时包装的要求：送交或邮寄种子要妥善包装，每份材料包装袋内和袋外都应有标签，标明品种名每份材料包装袋内和袋外都应有标签，标明品种名称、统一编号保存单位编号。包装要结实牢固、防称、统一编号保存单位编号。包装要结实牢固、防漏、防潮、防混杂、防散包，

7、以避免种子在送交或邮漏、防潮、防混杂、防散包，以避免种子在送交或邮寄途中受损；寄途中受损；送交种子要清选干净，去除破碎粒、虫蚀粒、无胚送交种子要清选干净，去除破碎粒、虫蚀粒、无胚粒、秕粒、瘦小粒、杂粒等，杂质不得超过粒、秕粒、瘦小粒、杂粒等，杂质不得超过2%；送交时种子含水量的要求：禾谷类不得超过送交时种子含水量的要求：禾谷类不得超过13%；蛋白质类与油脂类种子含水量应更低一些。蛋白质类与油脂类种子含水量应更低一些。有其他情况可与国家种质库预先联系。有其他情况可与国家种质库预先联系。本讲稿第十页，共三十一页江苏镇江桑树圃江苏镇江桑树圃呼和浩特牧草圃呼和浩特牧草圃浙江杭州茶树圃浙江杭州茶树圃国国

8、家家种种质质圃圃（包括试管苗库）（包括试管苗库）本讲稿第十一页，共三十一页中国野生苎麻种质中国野生苎麻种质基因库在江西建成基因库在江西建成两位市民在江西宜春市中国两位市民在江西宜春市中国野生苎麻种质基因库参观野生苎麻种质基因库参观。本讲稿第十二页，共三十一页种质是种质是指亲代通过生殖细胞或体细胞传递给指亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质。子代的遗传物质。植物种质保存是植物种质保存是利用天然或人工创造的适宜利用天然或人工创造的适宜环境，使个体中所含有的遗传物质保持遗传环境，使个体中所含有的遗传物质保持遗传完整性，有高的活力，能通过繁殖将其遗传完整性，有高的活力，能通过繁殖将其遗传特性传

9、递下去。特性传递下去。种质保存方式：种质保存方式：原地保存和异地保存。原地保存和异地保存。前者通过建立自然保护区和天然公园里实前者通过建立自然保护区和天然公园里实现，后者通过植物园、种质园、种子库及现，后者通过植物园、种质园、种子库及离体保存来实现。离体保存来实现。本讲稿第十三页，共三十一页 本讲稿第十四页，共三十一页离体保存：离体保存：将组织和细胞培养中的外植体或试管将组织和细胞培养中的外植体或试管苗贮存在使其抑制生长，缓慢生长或无生长的条苗贮存在使其抑制生长，缓慢生长或无生长的条件下，达到长期保存的方法。件下，达到长期保存的方法。离体保存的优点：离体保存的优点：1、解解决决一一些些无无性性

10、繁繁殖殖作作物物种种质质资资源源在在低低温温下下长长期期保存问题，可有效避免资源的丢失。保存问题，可有效避免资源的丢失。2、节节省省土土地地和和劳劳动动力力，保保存存方方法法简简单单，花花费费少少，且能在保存中脱毒。且能在保存中脱毒。3、在在提提供供利利用用时时，可可快快速速繁繁殖殖，也也有有利利于于国国际际国国内内种质交换。种质交换。本讲稿第十五页，共三十一页一一、常温保存常温保存在常温（在常温（205）下，通过改变培养基中某些培养物质的浓下，通过改变培养基中某些培养物质的浓度，改变培养的环境条件，可达到保存目的。度，改变培养的环境条件，可达到保存目的。方法：方法：改变培养基无机盐的浓度，主

11、要降低。改变培养基无机盐的浓度，主要降低。培养基里添加甘露醇，蔗糖等物质。培养基里添加甘露醇，蔗糖等物质。培养基中添加植物生长调节剂培养基中添加植物生长调节剂降低培养环境的氧含量降低培养环境的氧含量步骤：步骤：在保存材料上覆盖一层矿物油如石蜡、硅酮在保存材料上覆盖一层矿物油如石蜡、硅酮油或液态石油。降低培养环境的氧分压。油或液态石油。降低培养环境的氧分压。本讲稿第十六页，共三十一页二二、常低温和低温保存、常低温和低温保存 常常低低温温（15-0）和和低低温温（0-50 ）保保存存，还还可可辅辅以以改改变变培培养养基基成成分分和和培培养养条条件件，以以减减缓缓材材料料的的生生长长速速度减缓继代时

12、间，故又称为最小生长法。度减缓继代时间，故又称为最小生长法。根根据据植植物物对对温温度度的的耐耐受受力力确确定定其其抑抑制制生生长长的的保保存存温温度度。在在低低 温温保保存存时时还还可可以以结结合合低低压压来来取取得得更更好好的的效效果果主主要要通通过过降降低低培培养养物物周周围围的的大大气气压压，也也可可以以通通过过在在正正常常的的气气压压下下加加入入惰惰性性气气体体而而降降低低氧氧分分压压。低低气气压压和和低低氧氧压压都都可可抑抑制植物的生长，但不会导致培养物表现型上的差异。制植物的生长，但不会导致培养物表现型上的差异。本讲稿第十七页，共三十一页三三、超低温保存、超低温保存 也叫冷冻保存

13、。主要是指在液氮（也叫冷冻保存。主要是指在液氮（-196 ）的超）的超低温下使细胞代谢和生长处于基本停止的状态，低温下使细胞代谢和生长处于基本停止的状态，在适宜的条件下可迅速繁殖，生出新的植株，并在适宜的条件下可迅速繁殖，生出新的植株，并保持原来的遗传特性。保持原来的遗传特性。本讲稿第十八页，共三十一页（1）冰冻保护剂）冰冻保护剂渗透型抗冻剂：渗透型抗冻剂：二甲亚砜（二甲亚砜（DMSO）、）、乙二醇乙二醇、乙酰胺、丙二醇、甘油。乙酰胺、丙二醇、甘油。特特点点：多多属属低低分分子子中中性性物物质质，在在溶溶液液中中易易结结合合水水分分子子，发发生生水水合合作作用用，使使溶溶液液的的的的粘粘性性增

14、增加加而而减减少少水水的结晶过程，达到保护的目的。的结晶过程，达到保护的目的。非非渗渗透透型型抗抗冻冻剂剂：聚聚乙乙烯烯吡吡咯咯烷烷酮酮（pvp）、蔗蔗糖糖、葡葡 聚聚 糖糖、聚聚 乙乙 二二 醇醇 等等 为为 非非 渗渗 透透 型型 抗抗 冻冻 剂剂 特特点点：可可溶溶于于水水，但但不不能能进进入入细细胞胞，可可在在特特定定的的温温度度下下降降低低溶溶质质（电电解解质质）浓浓度度，从从而而起起到到保保护护作用。作用。本讲稿第十九页，共三十一页（2）保存液）保存液组成部分：组成部分：电解质平衡盐溶液电解质平衡盐溶液 高高渗渗溶溶液液：选选用用葡葡萄萄糖糖、甘甘露露醇醇、蔗蔗糖糖等等作作为高渗剂

15、。为高渗剂。营养液：营养液：氨基酸、核甘类、葡萄糖。氨基酸、核甘类、葡萄糖。本讲稿第二十页，共三十一页（3）材料的预备和预处理）材料的预备和预处理材料的生长状态和年龄的选择材料的生长状态和年龄的选择培养细胞处于旺盛的对数分裂期培养细胞处于旺盛的对数分裂期液体悬浮培养细胞以液体悬浮培养细胞以57天天 抗冻能力强，抗冻能力强，固体培养的愈伤组织以固体培养的愈伤组织以912天为宜天为宜 存活率高野外存活率高野外生长的植物的芽（冬天低温锻炼）生长的植物的芽（冬天低温锻炼）本讲稿第二十一页，共三十一页预预培培养养：在在冰冰冻冻保保存存前前的的预预培培养养中中加加入入提提高高抗抗寒寒力力的的物物质质如如：

16、梨梨糖糖醇醇、脱脱落落酸酸等等，或或将将培培养养基基的的糖浓度提高，这样可以提高存活率。糖浓度提高，这样可以提高存活率。冰冰冻冻保保护护剂剂：由由于于一一些些冰冰冻冻保保护护剂剂的的成成分分有有毒毒性性，冰冰冻冻保保护护剂剂预预处处理理必必须须在在0 下下进进行行处处理理时时间不能太长，一般不超过间不能太长，一般不超过1h。本讲稿第二十二页，共三十一页（4）超低温保存操作）超低温保存操作快速冷冻法快速冷冻法 慢速冷冻法慢速冷冻法 分步冷冻法分步冷冻法 脱水干燥法脱水干燥法 化冻操作化冻操作再培养再培养 生活力和存活力的测定生活力和存活力的测定荧光素双醋酸酯染色法荧光素双醋酸酯染色法FAD 氯化

17、三苯四氮唑法氯化三苯四氮唑法TTC本讲稿第二十三页，共三十一页快速冷冻法：快速冷冻法：适用于培养物细胞体能小，胞质浓、适用于培养物细胞体能小，胞质浓、含水量低、液泡化程度低的材料。将植物材料从含水量低、液泡化程度低的材料。将植物材料从0 0或其他预处理温度直接投入液氮罐中，降温速度为或其他预处理温度直接投入液氮罐中，降温速度为10001000/minmin以上。这种快速降温可使细胞内的水在迅以上。这种快速降温可使细胞内的水在迅速越过速越过-140-140这一冰晶形成的危险温度期后，细胞内这一冰晶形成的危险温度期后，细胞内的水形成的水形成“玻璃化玻璃化”状态，不会对细胞产生破坏状态，不会对细胞产

18、生破坏作用。作用。本讲稿第二十四页，共三十一页慢慢速速冷冷冻冻法法：适适用用于于含含有有大大液液泡泡的的成成熟熟细细胞胞，这这种种细细胞胞含含水水量量高高，在在慢慢速速降降温温过过程程中中，可可以以使使细细胞胞内内的的水水有有充充足足的的时时间间不不断断地地渗渗到到细细胞胞外外结冰而避免在细胞内结冰。结冰而避免在细胞内结冰。将将植植物物材材料料以以0.10.11010/minmin的的降降温温速速度度从从0 0降降到到-100-100左左右右，而而后后立立即即浸浸入入液液氮氮罐罐中中或或以以同样的速度连续降温至同样的速度连续降温至-196-196。本讲稿第二十五页，共三十一页1、先慢速降温，以

19、、先慢速降温，以0.54/minmin的速度将的速度将材料慢速降温至材料慢速降温至-40，停留一段时间后，停留一段时间后，是材料充分脱水，然后投入液氮迅速冷冻。是材料充分脱水，然后投入液氮迅速冷冻。2、把材料在、把材料在0预处理后，逐级通过不同预处理后，逐级通过不同的低温温度一段时间，然后投入液氮管。的低温温度一段时间，然后投入液氮管。本讲稿第二十六页，共三十一页脱脱水水干干燥燥法法：将将培培养养材材料料的的含含水水量量降降到到一一定定程程度度，在在进进入入液液氮罐中，这样可使植物免遭冻死。氮罐中，这样可使植物免遭冻死。无无菌菌气气流流中中干干燥燥、硅硅胶胶干干燥燥、21212929烘烘箱箱内

20、内真真空空干干燥燥法法等方法将含水量降到等方法将含水量降到27-40%27-40%。玻玻璃璃化化法法：用用高高浓浓度度的的复复合合玻玻璃璃化化保保护护剂剂使使样样品品脱脱水水减减轻轻机机械损伤和溶液效应，应用价值高。械损伤和溶液效应，应用价值高。包包埋埋脱脱水水法法：将将样样品品用用高高浓浓度度的的蔗蔗糖糖进进行行预预处处理理，包包埋埋到到海海藻酸胶中，避免了二甲亚砜和甘油的毒性。藻酸胶中，避免了二甲亚砜和甘油的毒性。本讲稿第二十七页，共三十一页 化冻操作化冻操作快速化冻：快速化冻：在在35354040温水中化冻温水中化冻慢速化冻：慢速化冻：在在0 0，2 23 3或室温下进行化冻或室温下进行

21、化冻注意事项：注意事项：1、操作轻，避免组织和细胞的机械损伤、操作轻，避免组织和细胞的机械损伤2、将冰冻样品试管插入温水浴中时，注意避免管口污、将冰冻样品试管插入温水浴中时，注意避免管口污染；染；3、试管内的冰一旦化冻后，要立即将试管移到、试管内的冰一旦化冻后，要立即将试管移到20-25的水浴中，并立即迅速进行洗涤和再培养。的水浴中，并立即迅速进行洗涤和再培养。本讲稿第二十八页，共三十一页再再培培养养：化化冻冻后后立立即即将将材材料料转转移移到到新新鲜鲜培培养养基基上上进进行行再再培培养养。在在这这过过程程中中可可以以观观测测细细胞胞的的增增生生数数量量，愈愈伤伤组组织织的的形形成成和和增增长

22、长情情况况，大大小小和和数数量量的的变变化化，新新植植株株分分化化的的能力等。能力等。荧荧光光素素双双醋醋酸酸酯酯（FADFAD）染染色色法法：先先配配制制0.1%0.1%的的荧荧光光素素材材料料，用用一一滴滴染染料料和和一一滴滴化化冻冻后后的的细细胞胞悬悬浮浮液液相相混混合合，分分别别置置于于普普通通光光学学显显微微镜镜（观观察察总总细细胞胞数数）和和紫紫外外荧荧光光显显微镜（观察活细胞数）下观察和计数。微镜（观察活细胞数）下观察和计数。TTCTTC法法（氯氯化化三三苯苯四四氮氮唑唑）：此此法法显显示示细细胞胞内内脱脱氢氢酶酶的的活活性性，脱脱氢氢酶酶使使TTCTTC还还原原生生成成一一种种

23、红红色色的的物物质质，作作为为检检验验活活细细胞的方法胞的方法 。本讲稿第二十九页，共三十一页本章要点本章要点1、理解种质的常温保存方法。、理解种质的常温保存方法。2、理解种质的常低温和低温保存方法。、理解种质的常低温和低温保存方法。3、掌握种质的超低温保存程序。、掌握种质的超低温保存程序。本讲稿第三十页，共三十一页作业题作业题1、传统的植物种植资源保存方式什么？有何局、传统的植物种植资源保存方式什么？有何局限性？限性？2、低温保存与超低温保存有何异同？、低温保存与超低温保存有何异同？3、在超低温保存中，采用哪些措施以尽量避免、在超低温保存中，采用哪些措施以尽量避免植物材料的伤害？植物材料的伤害？本讲稿第三十一页，共三十一页