免疫学检测技术及在食品中的应用讲稿.ppt

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1、关于免疫学检测技术及在食品中的应用第一页，讲稿共六十二页哦o利用免疫学技术可以检测细菌、真菌、病毒、利用免疫学技术可以检测细菌、真菌、病毒、寄生虫、各种毒素、蛋白寄生虫、各种毒素、蛋白o还可检测激素、药物残留、抗生素及其他生还可检测激素、药物残留、抗生素及其他生理活性物质理活性物质第二页，讲稿共六十二页哦1酶免疫技术酶免疫技术ELISA检测技术检测技术第三页，讲稿共六十二页哦ELISAo全称：酶联免疫吸附测定（酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay）第四页，讲稿共六十二页哦p将抗原抗体的特异性与酶反应的敏感性相结将抗原抗体的特异性与酶反应的敏感性

2、相结合，使得食品在未经分离提取的前提下，即合，使得食品在未经分离提取的前提下，即能进行定性或定量检测能进行定性或定量检测p广泛用于细菌、真菌、病毒、寄生虫、各种广泛用于细菌、真菌、病毒、寄生虫、各种毒素等大分子蛋白，以及激素、农兽药残留、毒素等大分子蛋白，以及激素、农兽药残留、抗生素能小分子物质的检测抗生素能小分子物质的检测第五页，讲稿共六十二页哦可检测标本类型广泛可检测标本类型广泛体液：体液：血清、血浆、胸腹水、灌洗液、脑脊液血清、血浆、胸腹水、灌洗液、脑脊液分泌物：分泌物：唾液唾液排泄物：排泄物：尿液、粪便等尿液、粪便等细胞培养上清细胞培养上清组织匀浆组织匀浆第六页，讲稿共六十二页哦1.1

3、 ELISA 的发展历程的发展历程o免疫酶标记技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后免疫酶标记技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后发展起来的一大新型的血清学技术。发展起来的一大新型的血清学技术。o1966年，年，Nakane和和Avrameas等分别报道用酶代替荧等分别报道用酶代替荧光素标记抗体，建立了酶标抗体技术用于生物组织中抗原的光素标记抗体，建立了酶标抗体技术用于生物组织中抗原的定位和鉴定。定位和鉴定。o1971年，年，Engvall，Van Weemen 等报道了酶联免等报道了酶联免疫吸附试验，从而建立了酶标抗体的定量检测技术疫吸附试验，从而建立了酶标抗体的定量检测技术o目前

4、，免疫酶标记技术已成为免疫诊断、检测和分子生物目前，免疫酶标记技术已成为免疫诊断、检测和分子生物学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。第七页，讲稿共六十二页哦ELISA板板酶标仪酶标仪测吸光度测吸光度第八页，讲稿共六十二页哦ELISAELISA是一种是一种免疫免疫测定技术：基于抗原抗体反应测定技术：基于抗原抗体反应酶联酶联：抗原或抗体的：抗原或抗体的酶标记酶标记吸附吸附：抗原或抗体的：抗原或抗体的固相化固相化测定测定：加入酶反应的底物后，被酶催化成为加入酶反应的底物后，被酶催化成为有色产物有色产物，产物的量产物的量与标与标本中本中受检物质的量受检物质的量直接相

5、关，采用酶标仪进行测定直接相关，采用酶标仪进行测定1.2 解解释：酶联免疫吸附免疫吸附测定定第九页，讲稿共六十二页哦第十页，讲稿共六十二页哦间接法间接法夹心法夹心法竞争法竞争法捕获法捕获法1.3 类类 型型第十一页，讲稿共六十二页哦酶酶抗抗抗抗体体酶标记酶标记抗抗体抗抗体抗体抗体抗原抗原固相载体固相载体1.将抗原包被在固相载体上。将抗原包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗抗体，则结再加入酶标记抗抗体，则结合为抗原合为抗原-抗体抗体-酶标记抗抗体酶标记抗抗体复合物。复合物。4.酶催化底物并显色。酶催化底物并显

6、色。（1）间接法）间接法第十二页，讲稿共六十二页哦间接法间接法测抗体测抗体洗洗涤涤洗洗涤涤洗洗涤涤待测抗体待测抗体酶标抗抗体酶标抗抗体病原体病原体抗体抗体的检测而进行传染病的诊断的检测而进行传染病的诊断第十三页，讲稿共六十二页哦（2）双抗体夹心法双抗体夹心法固相载体固相载体抗体抗体抗原抗原酶酶抗体抗体酶标记抗体酶标记抗体1.将抗体包被在固相载体上。将抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗原，则结合如样品中含有抗原，则结合为抗原抗体复合物。为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗体，则结合再加入酶标记抗体，则结合为抗体为抗体-抗原抗原-酶标记抗体复合酶标记抗体复合物。物。4.酶催化底物并显色。酶催

7、化底物并显色。第十四页，讲稿共六十二页哦夹心法夹心法测抗原测抗原 洗洗涤涤洗洗涤涤洗洗涤涤待测抗原待测抗原在临床检验中，此法适用于检验各种在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原蛋白质等大分子抗原，例如，例如HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg、AFPAFP、hCGhCG等等第十五页，讲稿共六十二页哦产品举例产品举例o氟苯尼考（氟苯尼考（FF）ELISA快速检测试剂盒快速检测试剂盒（Green Spring）o可用于动物组织（肌肉、肝脏）、尿液、血可用于动物组织（肌肉、肝脏）、尿液、血清、蜂蜜、肠衣、牛奶以及水产品等样品中清、蜂蜜、肠衣、牛奶以及水产品等样品中氟苯尼考药物残留的

8、检测。氟苯尼考药物残留的检测。o人金黄色葡萄球菌肠毒素人金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)ELISA 检检测试剂盒测试剂盒第十六页，讲稿共六十二页哦（3）酶标抗原竞争法）酶标抗原竞争法固相载体固相载体抗体抗体抗原抗原酶酶酶标记抗原酶标记抗原1.将抗体包被在固相载体上。将抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗原，则优先竞争如样品中含有抗原，则优先竞争结合抗体，结合结合抗体，结合为抗原抗体复合物。为抗原抗体复合物。3.同时加入酶标记抗原，抗原没有同时加入酶标记抗原，抗原没有结合的位点酶标记抗原去占据，则结合的位点酶标记抗原去占据，则结合为酶标记抗原结合为酶标记抗原-抗体复合物。抗体复合物。4.酶催化底

9、物并显色。酶催化底物并显色。抗原抗原第十七页，讲稿共六十二页哦竞争法竞争法测小分子抗原测小分子抗原洗洗涤涤洗洗涤涤待测抗原待测抗原酶标抗原酶标抗原小分子激素、药物等小分子激素、药物等ELISAELISA测定多用此法。测定多用此法。第十八页，讲稿共六十二页哦4 捕获法示意图捕获法示意图酶酶抗体抗体酶标记酶标记 抗体抗体抗原抗原抗抗体抗抗体固相载体固相载体抗体抗体1.将抗抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合为抗抗体-抗体复合物。3.加入抗原及酶标记抗体，则结合为抗抗体-抗体-抗原-酶标记抗体复合物。4.酶催化底物并显色。第十九页，讲稿共六十二页哦固相抗固相抗IgM特特异异IgM非非特

10、特异异IgM标本标本特特异异抗抗原原抗抗原原特特异异酶酶标标抗抗体体底底物物此法常用于病毒性感染的早期诊断。此法常用于病毒性感染的早期诊断。捕获法捕获法第二十页，讲稿共六十二页哦1.4 1.4 操作流程操作流程第二十一页，讲稿共六十二页哦o将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为包被将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为包被(coating)(coating)。o 蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附物理吸附结合的，结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。疏水基团间的作用。o大分子蛋

11、白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。故更易吸附到固相载体表面。（1 1）包被包被第二十二页，讲稿共六十二页哦包被的条件包被的条件 pH9.6 pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液 pH7.2pH7.2的磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液 pH7-8pH7-8的的Tris-HCLTris-HCL缓冲液。缓冲液。o 加入包被液后，在加入包被液后，在4-84-8冰箱中放置过夜，冰箱中放置过夜，3737中保中保温温2 2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，变化，每批材料需通

12、过实验与酶结合物的浓度协调选定。每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml10ng/ml-20ug/ml。第二十三页，讲稿共六十二页哦（2 2）封）封 闭闭o封闭封闭(blocking)(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥白质充填这些空隙，从而排斥ELISAELISA后的步骤中干扰物后的步骤中干扰物质的再吸附。质的再吸附。o常用封闭剂：常用封闭剂：0.05%-0.

13、5%0.05%-0.5%的的BSA;10%BSA;10%的小牛血清或的小牛血清或1%1%明胶明胶;脱脂奶粉脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（比较价廉，可以高浓度使用（5%5%）。）。o 所有的所有的ELISAELISA固相均需封闭。固相均需封闭。第二十四页，讲稿共六十二页哦（3 3）加样）加样o在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加样步聚次加样步聚o即加样本，加酶结合物，加底物。即加样本，加酶结合物，加底物。o加样时应将所加物加在加样时应将所加物加在LEISALEISA板孔的底部，避免加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。孔壁上部，并注意不可溅出，不可产

14、生气泡。第二十五页，讲稿共六十二页哦（4 4）保）保 温温o抗原抗体完成反应的保温过程称为温育抗原抗体完成反应的保温过程称为温育o应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。于两块板同时测定。第二十六页，讲稿共六十二页哦（5 5）洗涤）洗涤o洗涤在洗涤在ELISAELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。败。oELSIAELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。洗涤：达到分离游离的和结合的酶

15、标记物的目的。o清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。o可以说在可以说在ELISAELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。操作中，洗涤是最主要的关键技术。第二十七页，讲稿共六十二页哦(6)(6)显色显色o显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的育反应。反应的温度

16、和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。提高温度有助于加速显色进行。第二十八页，讲稿共六十二页哦 酶酶o在在ELISAELISA中，可以采用的有中，可以采用的有HRPHRP，APAP，葡萄糖氧化，葡萄糖氧化酶，酶，-D-D-半乳糖苷酶和脲酶等。半乳糖苷酶和脲酶等。oHRPHRP（辣根过氧化物酶）（辣根过氧化物酶）是一种糖蛋白，含糖量是一种糖蛋白，含糖量约为约为18%18%，分子量为，分子量为4400044000，是一种复合酶，由主，是一

17、种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。是一种卟啉蛋白质。第二十九页，讲稿共六十二页哦底物底物oHRPHRP的底物的底物o DH2+H2O2 D+2H2OoDH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。物。oDH2如：邻苯二胺如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺、四甲基联苯胺(TMB)等。等。第三十页，讲稿共六十二页哦oOPDOPD氧化后的产物呈氧化后的产物呈橙红色橙红色，用酸终止酶反应，用酸终止酶反应后，在后，在492nm492nm处有最高吸收峰，灵敏度高处有最高吸收峰，灵

18、敏度高oTMBTMB经经HRPHRP作用后共产物显作用后共产物显蓝色蓝色。TMBTMB性质较稳定，性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与可配成溶液试剂，只需与H H2 2O O2 2溶液混和即成应用溶液混和即成应用液。酶反应终止后，液。酶反应终止后，TMBTMB产物由蓝色呈黄色，可产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为在比色计中定量，最适吸收波长为450nm450nm。第三十一页，讲稿共六十二页哦1.5ELISA 影响因素影响因素固相固相载体：体：ELISA ELISA 中最常用的是聚苯乙中最常用的是聚苯乙烯或聚或聚氯乙乙烯微量反微量反应板。板。抗原：可溶性、抗原：可溶性、优质、稳定的

19、制定的制剂，纯度和免疫原性要高。度和免疫原性要高。试验样品：血清、血品：血清、血浆或其他体液，均可作或其他体液，均可作为 ELISA ELISA 的的试验样品。品。结合物：合物：酶结合物要求合物要求稳定，具有很高的定，具有很高的酶活性，抗原或抗体的特异性，活性，抗原或抗体的特异性，产量高及成本低。量高及成本低。底物：各种底物：各种酶都有都有对底物的底物的特异性特异性，不同种，不同种类的的酶要求有不同的底物。要求有不同的底物。作用作用时间：加底物后：加底物后终止止时间？结果判断果判断:ELISA:ELISA 的的试验结果可用肉眼果可用肉眼观察察颜色反色反应的深浅作出判断，也可用的深浅作出判断，也

20、可用分分光光度光光度计作精确作精确测定。定。试验的重复性（精确度）的重复性（精确度）：通常用：通常用变异系数异系数来表示。来表示。第三十二页，讲稿共六十二页哦思考：如何研发商品化的思考：如何研发商品化的ELISA试剂盒？试剂盒？需要什么原料，得到哪些组分，摸清需要什么原料，得到哪些组分，摸清哪些条件，才能够进行组装？哪些条件，才能够进行组装？第三十三页，讲稿共六十二页哦2 2免疫胶体金技术免疫胶体金技术（胶体金试纸条检测技术、胶体金层析）（胶体金试纸条检测技术、胶体金层析）第三十四页，讲稿共六十二页哦大肠杆菌大肠杆菌O157:H7快速检测快速检测试纸（胶体金）试纸（胶体金）第三十五页，讲稿共六

21、十二页哦2.1 2.1 简简 介介 胶胶体体金金试试纸纸条条诊诊断断是是采采用用胶胶体体金金免免疫疫层层析析技技术术研研制制而而成成，该该技技术术是是9090年年代代初初在在免免疫疫渗渗滤滤技技术术的的基基础础上上建建立立的的一一种种简简易易快快速速的的免免疫疫学学检检测测技技术术，最最先先用用于于人人绒绒毛毛膜膜促促性性腺腺激激素素（HCGHCG）的的测测定定和和乙型肝炎病毒表面抗原（乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAgHBsAg）等检测。等检测。第三十六页，讲稿共六十二页哦p胶胶体体金金（Colloidal Colloidal goldgold）是是氯氯金金酸酸（HAuClHAuCl4 4）的

22、的水水溶溶胶胶，氯氯金金酸酸在在还还原原剂剂的的作作用用下下，聚聚合合成成特特定定大大小小的的金金颗颗粒粒，并并由由于于静静电电作作用用成成为为一一种种稳稳定的胶体状态。故称胶体金定的胶体状态。故称胶体金第三十七页，讲稿共六十二页哦用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒也就是不同颜色的胶体金颗粒质量好的胶体金：溶液呈红色，胶体金颗粒为球形，质量好的胶体金：溶液呈红色，胶体金颗粒为球形，大小均一，无棱角。大小均一，无棱角。质量差的胶体金：溶液呈紫色，大小不一，形状各异。质量差的胶体金：溶液呈紫色，大小不一，形状各异。胶体

23、金的质量判定标准胶体金的质量判定标准第三十八页，讲稿共六十二页哦p胶体金标记的原理：胶体金标记的原理：p胶胶体体金金在在碱碱性性条条件件下下带带负负电电荷荷，与与蛋蛋白白质质分分子子的的正电荷基团静电吸引而形成牢固结合。正电荷基团静电吸引而形成牢固结合。p胶胶体体金金标标记记，实实质质上上是是蛋蛋白白质质等等高高分分子子被被吸吸附附到到胶体金颗粒表面的包被过程。胶体金颗粒表面的包被过程。p标标记记物物在在相相应应的的配配体体处处大大量量聚聚集集时时，肉肉眼眼可可见见红红色色或或粉粉红红色色斑斑点点，因因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中 第三十九页，讲

24、稿共六十二页哦2.22.2胶体金试纸条诊断技术的原理胶体金试纸条诊断技术的原理 以以硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜为为载载体体，利利用用了了微微孔孔膜膜的的毛毛细细血血管管作作用用，滴滴加加在在膜膜条条一一端端的的液液体体慢慢慢慢向向另另一一端端渗渗移移，通通过过抗抗原原抗抗体体结结合合，并并利利用用胶胶体体金呈现颜色（红色）反应，检测抗原金呈现颜色（红色）反应，检测抗原/抗体。抗体。第四十页，讲稿共六十二页哦检测线检测线质控线质控线吸收垫吸收垫样品垫样品垫硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜胶体金垫胶体金垫背衬背衬（底板）（底板）胶体金试纸条示意图胶体金试纸条示意图第四十一页，讲稿共六十二页哦 2.3 分类分

25、类o间接法间接法-测抗体测抗体o双抗夹心法双抗夹心法-测大分子抗原测大分子抗原-食品中沙门氏菌的检测食品中沙门氏菌的检测o竞争法竞争法-测小分子抗原测小分子抗原-食品中瘦肉精、黄曲霉毒素的检测食品中瘦肉精、黄曲霉毒素的检测第四十二页，讲稿共六十二页哦沙门氏菌单克隆抗体沙门氏菌单克隆抗体可能含有沙可能含有沙门氏菌的样门氏菌的样品品（1）双抗夹心法检测抗原）双抗夹心法检测抗原测大分子抗原测大分子抗原沙门氏菌多沙门氏菌多克隆抗体克隆抗体抗抗体抗抗体第四十三页，讲稿共六十二页哦第四十四页，讲稿共六十二页哦（2）思考）思考o竞争法的原理？竞争法的原理？o检测线喷的是纯化的抗原，与待检测线喷的是纯化的抗原

26、，与待检测抗原竞争检测抗原竞争o这种情况下的结果判定？这种情况下的结果判定？第四十五页，讲稿共六十二页哦2.4 2.4 胶体金快速诊断技术的特点胶体金快速诊断技术的特点 p简简捷捷快快速速：操操作作简简单单，一一般般只只要要5 5-10min-10min 就就会会出出结结果果，而而其其它它方方法法如如ELISAELISA需需要要1 1-2h-2h，PCR PCR 需要时间更长。需要时间更长。p结结果果易易于于判判定定：阴阴、阳阳性性呈呈色色很很明明显显，肉肉眼眼很很容易判断。容易判断。p特特异异性性好好：因因为为该该技技术术大大多多用用单单克克隆隆抗抗体体标标记记，这决定了它具有很好的特异性。

27、这决定了它具有很好的特异性。第四十六页，讲稿共六十二页哦2.5 2.5 技术分项技术分项样品垫样品垫吸水垫吸水垫粘性底板粘性底板NCNC膜膜胶体金垫胶体金垫干燥方法干燥方法抗原抗体生物原料抗原抗体生物原料胶体金制备胶体金制备标记技术标记技术溶液喷点溶液喷点溶液体系分析溶液体系分析装配装配 切条切条 包装包装第四十七页，讲稿共六十二页哦（1）金标垫与样品垫的处理）金标垫与样品垫的处理o1，金标垫裁剪成长，金标垫裁剪成长10，宽，宽8长条长条o2，样品垫裁剪成长，样品垫裁剪成长30，宽，宽2.5长条长条o3，将裁剪好的金标垫与样品垫，分别用金标垫处理，将裁剪好的金标垫与样品垫，分别用金标垫处理液与

28、样品垫处理液浸润，放入液与样品垫处理液浸润，放入37温箱中烘干储存温箱中烘干储存在干燥器中置在干燥器中置4冷库中备用。冷库中备用。第四十八页，讲稿共六十二页哦抗体抗体 AntibodyAntibody来源差异来源差异:鼠抗鼠抗,兔抗和羊抗兔抗和羊抗种类差异种类差异:单抗单抗,多抗多抗腹水的处理腹水的处理:饱和硫酸铵沉淀法饱和硫酸铵沉淀法特异性特异性:亲和层析柱亲和层析柱浓度浓度:浓缩浓缩溶解液溶解液:不含盐不含盐,例如例如PBPB（2 2）抗原抗体生物原料）抗原抗体生物原料抗原抗原 AntigenAntigen偶联抗原物质偶联抗原物质:BSA,OVA:BSA,OVA等等毒品检测来源毒品检测来源

29、:合成抗原合成抗原第四十九页，讲稿共六十二页哦（3 3）标记技术）标记技术 ConjugateConjugate容器硅化处理容器硅化处理金颗粒制备金颗粒制备 (负电负电)颜色与颗粒的关系颜色与颗粒的关系.最佳标记颗粒大小最佳标记颗粒大小40nm40nm.蛋白质最适用量测定蛋白质最适用量测定:盐析法盐析法第五十页，讲稿共六十二页哦（4）胶体金制作流程 1，向硅化过的三角瓶中加入向硅化过的三角瓶中加入100ml去离子水，再加入去离子水，再加入1ml浓度为浓度为1%的的氯金酸氯金酸 2,将三角瓶放入微波炉中加热，沸腾时取出，一次性迅速加入将三角瓶放入微波炉中加热，沸腾时取出，一次性迅速加入1850l

30、浓度浓度1%柠檬酸三钠，摇动约柠檬酸三钠，摇动约20s（柠檬酸三钠经（柠檬酸三钠经0.22滤膜过滤）滤膜过滤）3,再将三角瓶放入微波炉中大火再将三角瓶放入微波炉中大火1分钟，调中火继续加热五分钟。分钟，调中火继续加热五分钟。4，拿出来冷却，待温度降至室温时用去离子水补足到，拿出来冷却，待温度降至室温时用去离子水补足到100ml,用用0.1M的的碳酸钾调节碳酸钾调节PH至略高于待标记蛋白的等电点，至略高于待标记蛋白的等电点，0.22过滤转移至硅化过过滤转移至硅化过的平底蓝盖瓶中。的平底蓝盖瓶中。第五十一页，讲稿共六十二页哦5 5，蓝盖瓶中放入搅拌子，搅拌，向金溶液中加入蛋白，蓝盖瓶中放入搅拌子，

31、搅拌，向金溶液中加入蛋白,标标记量为记量为2g/ml2g/ml，缓慢加入标记蛋白。，缓慢加入标记蛋白。6,6,搅拌搅拌,半小时后加入浓度为半小时后加入浓度为10%10%的的BSABSA至终浓度为至终浓度为0.2%0.2%，继续搅拌一小时。继续搅拌一小时。7 7，将标记好的溶液转至，将标记好的溶液转至50ml50ml离心管中，离心管中，3500rpm/min3500rpm/min，44离心离心30min.30min.弃去沉淀，收集上清。弃去沉淀，收集上清。第五十二页，讲稿共六十二页哦8 8，上清转入另外的，上清转入另外的50ml50ml离心管中，离心管中，7500rpm/min7500rpm/m

32、in，44离离心心30min,30min,弃上清收集沉淀。弃上清收集沉淀。9 9，用，用1/21/2原体积的洗涤液洗涤沉淀，原体积的洗涤液洗涤沉淀，7500rpm/min7500rpm/min，44离心离心30min,30min,弃上清收集沉淀。弃上清收集沉淀。1010，用十分之一原体积的重悬缓冲液重悬沉淀。，用十分之一原体积的重悬缓冲液重悬沉淀。1111，重悬后的胶体金转入硅化过的蓝盖瓶，重悬后的胶体金转入硅化过的蓝盖瓶。第五十三页，讲稿共六十二页哦（5）溶液喷点）溶液喷点-喷点溶液喷点溶液 Dispensing(BIODOT XYZ系列喷点仪器系列喷点仪器)oCT线溶液前处理线溶液前处理:

33、1.过滤过滤,0.2um孔径滤膜孔径滤膜2.离心离心1万转万转10分钟分钟o喷点过程喷点过程头尾去除头尾去除,喷点中的报废标志喷点中的报废标志oCT线喷点工艺线喷点工艺(BJQ3000喷头喷头)与接触划与接触划点点(FL1000XY喷头喷头)工艺比较工艺比较第五十四页，讲稿共六十二页哦（6）装配）装配切条切条包装包装Laminationo装配装配o切条切条(演示演示:BIODOT CM4000切切条机条机)刀的维护与清洁刀的维护与清洁底板选择底板选择(胶的影响胶的影响)o包装包装第五十五页，讲稿共六十二页哦（7）灵敏度问题）灵敏度问题o源头源头:抗原抗体免疫反应抗原抗体免疫反应o材料问题材料问

34、题NC膜膜o附加物质的解决办法附加物质的解决办法o假阳性的解决假阳性的解决o批内批内批间差批间差第五十六页，讲稿共六十二页哦（8）长期保存）长期保存o试纸失活试纸失活o加速稳定实验的设计与操作加速稳定实验的设计与操作第五十七页，讲稿共六十二页哦（9）实验研究的时间安排）实验研究的时间安排o上游上游 抗原抗体的制备抗原抗体的制备o中游中游 材料选择比较材料选择比较(包括上游产品和其他原料包括上游产品和其他原料)o下游下游 成品调试成品调试o工作接口的设计工作接口的设计oDeadline的制定的制定o关键步骤关键步骤:原料效价原料效价标记标记选膜选膜点样点样调试调试第五十八页，讲稿共六十二页哦Developing发展方向发展方向第五十九页，讲稿共六十二页哦标记技术的探索标记技术的探索顺磁粒子标记、量子点标记顺磁粒子标记、量子点标记 免疫反应信号转化为电子信号模式免疫反应信号转化为电子信号模式第六十页，讲稿共六十二页哦新的层析模式新的层析模式第六十一页，讲稿共六十二页哦感谢大家观看2022/9/26第六十二页，讲稿共六十二页哦