动物细胞融合与单克隆抗体的制备精品.ppt

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1、动物细胞融合与单克隆抗体的制备精品现在学习的是第1页，共40页现在学习的是第2页，共40页一、动物细胞融合一、动物细胞融合有些细胞的融合是正常的生命活动。如精子有些细胞的融合是正常的生命活动。如精子与卵细胞的结合。与卵细胞的结合。两个细胞正在融合两个细胞正在融合 受精作用受精作用现在学习的是第3页，共40页(一一)动物细胞融合的概念动物细胞融合的概念 动物细胞融合也称细胞杂交动物细胞融合也称细胞杂交,是指两个或多个动是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。物细胞结合形成一个细胞的过程。（二）动物细胞融合的过程（二）动物细胞融合的过程与植物原生质体融合原理相同，方法类似。与植物原生质体融合

2、原理相同，方法类似。杂交细胞杂交细胞:融合后形成的具有原来两个或多个融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。细胞遗传信息的单核细胞。现在学习的是第4页，共40页.原理：原理：1、动物细胞融合的基本原理、动物细胞融合的基本原理是什么？是什么？2、动物细胞融合的诱导、动物细胞融合的诱导方式是什么？与植物细胞方式是什么？与植物细胞融合的诱导方式有什么不融合的诱导方式有什么不同？同？与植物原生质体融合的基本原理相同，与植物原生质体融合的基本原理相同，即细胞即细胞膜的流动性。膜的流动性。.诱导方式：诱导方式：物理法：物理法：电激、振动、离心电激、振动、离心化学法：化学法：聚乙二醇（聚乙二醇

3、（PEG）生物法：生物法：灭活的病毒灭活的病毒例如：仙台病毒例如：仙台病毒现在学习的是第5页，共40页仙台病毒仙台病毒紫外线紫外线丧失感染性丧失感染性（不感染细胞）（不感染细胞）保留融合活性保留融合活性（诱导细胞融合）（诱导细胞融合）现在学习的是第6页，共40页细胞细胞A A细胞细胞B杂交细胞杂交细胞灭活的病毒灭活的病毒物理法物理法化学法化学法现在学习的是第7页，共40页灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接细胞膜连接细胞融合，形成杂交细胞细胞融合，形成杂交细胞（细胞膜具有一定的流动性）（细胞膜具有一定的流动性）现在学习的是第

4、8页，共40页(三三)动物细胞融合的应用动物细胞融合的应用1.1.突破有性杂交方法的局限突破有性杂交方法的局限,使远缘杂交成为可能。使远缘杂交成为可能。2.2.成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。新品种培育等的重要手段。鼠鼠鸡、鼠鸡、鼠兔、鼠兔、鼠猴、人猴、人鼠、人鼠、人兔、兔、人人鸡、人鸡、人蛙、蛙、酵母菌酵母菌鸡鸡 、人、人胡萝卜胡萝卜等等3、重要用途：、重要用途：制备单克隆抗体制备单克隆抗体。现在学习的是第9页，共40页二、单克隆抗体二、单克隆抗体 什么是抗体？什么是抗体？抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能抗体是机体受抗原刺

5、激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。的球蛋白。现在学习的是第10页，共40页三、单克隆抗体三、单克隆抗体1、抗体是由何种细胞产生的？、抗体是由何种细胞产生的？浆细胞（效应浆细胞（效应B细胞）细胞）2、抗体是如何产生的？、抗体是如何产生的？B B淋巴细胞淋巴细胞抗原抗原增殖分化成浆细胞增殖分化成浆细胞3、一种、一种B淋巴细胞能产生几淋巴细胞能产生几种抗体？种抗体？一种一种现在学习的是第11页，共40页（一）获得抗体的传统方法（一）获得抗体的传统方法1 1、把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物、把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动

6、物血清中分离出所需的抗体。血清中分离出所需的抗体。2 2、缺点：、缺点：产量低，纯度低，产量低，纯度低，特异性差特异性差。现在学习的是第12页，共40页人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的的B B淋巴细胞可以产生多达百万种以上的特异性淋巴细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每一个抗体，但是每一个B B细胞只分泌一种特异性抗体。细胞只分泌一种特异性抗体。要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的B B淋巴细胞，形成细胞群淋巴细胞，形成细胞群。1 1、请从以上文字资料中找出、请从以上文字资料中找出单克隆抗体

7、单克隆抗体的概念的概念用用单个单个B B淋巴细胞淋巴细胞进行（无性繁殖）克隆，得到的进行（无性繁殖）克隆，得到的基因基因型相同型相同的的细胞群能够分泌一种细胞群能够分泌一种化学性质单一化学性质单一、特异性强特异性强的抗体，这种抗体就叫做单克隆抗体。的抗体，这种抗体就叫做单克隆抗体。现在学习的是第13页，共40页思考：思考：思考：思考：1、在体外培养的条件下，一个、在体外培养的条件下，一个B淋巴细胞有没有可能淋巴细胞有没有可能无限增殖？无限增殖？不可能不可能2、我们学过的什么细胞具有这样的能力？、我们学过的什么细胞具有这样的能力？癌细胞癌细胞3、有什么办法让、有什么办法让B淋巴细胞也具有这样的能

8、力？淋巴细胞也具有这样的能力？细胞融合细胞融合现在学习的是第14页，共40页一个一个B B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体淋巴细胞只分泌一种特异性抗体骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖杂种细胞杂种细胞动物细胞培养技术动物细胞培养技术、实验原理：、实验原理：动物细胞融合动物细胞融合创始人：米尔斯坦创始人：米尔斯坦单克隆单克隆抗体抗体既能产生特异性抗体，既能产生特异性抗体，又能大量繁殖又能大量繁殖柯勒柯勒现在学习的是第15页，共40页如何大量生产单克隆抗体？如何大量生产单克隆抗体？利用利用B B淋巴细胞产生抗体的功能。淋巴细胞产生抗体的功能。利用肿瘤细胞无限增殖的特性。利用肿

9、瘤细胞无限增殖的特性。利用细胞融合的技术将两种细胞融合利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有获得具有B B淋巴细胞和肿瘤细胞特性淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞。的杂交瘤细胞。利用利用动物细胞培养动物细胞培养技术大量培养杂交技术大量培养杂交瘤细胞。瘤细胞。现在学习的是第16页，共40页应用：应用：动物细胞融合动物细胞融合设计方案：设计方案：一个一个B B淋巴细胞淋巴细胞只分泌一种特异性抗体只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖能无限增殖化学性质单一、特异性强化学性质单一、特异性强杂种细胞杂种细胞单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备单克隆抗体的特点：单克隆抗体的特点：现在学习

10、的是第17页，共40页单克隆抗体的制备过程单克隆抗体的制备过程现在学习的是第18页，共40页3.3.过程：过程：免疫动物免疫动物注射抗原的目的是什么？获得能产生相应抗体的B淋巴细胞（浆细胞）诱导细胞融合常用方法是什么？灭活的仙灭活的仙台病毒台病毒如何进行筛选？具有筛选作用的培养基（HAT培养基）？种？种BB、B瘤瘤、瘤瘤瘤瘤、杂交细胞杂交细胞如何获得大量的单克隆抗体？免疫免疫B细胞和骨髓瘤细胞的制备细胞和骨髓瘤细胞的制备细胞融合细胞融合杂交瘤细胞的选择培养杂交瘤细胞的选择培养杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立单克隆抗体的大量制备单克

11、隆抗体的大量制备现在学习的是第19页，共40页？抗原抗原 效应效应B细胞细胞筛选筛选 筛选筛选 （AAAA型、型、BBBB型）型）AB型杂交瘤细胞型杂交瘤细胞能产生所需抗体的细胞能产生所需抗体的细胞现在学习的是第20页，共40页过程：过程：抗原抗原小鼠小鼠效应效应B B细胞细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞融合、筛选细胞融合、筛选多孔培养板单个细胞培养，筛选多孔培养板单个细胞培养，筛选能产生特定抗体的细能产生特定抗体的细胞群胞群体外培养体外培养 体内培养体内培养提取出单克隆抗体提取出单克隆抗体现在学习的是第21页，共40页1.1.在制备单克隆抗体的过程中，选用在制备单克隆抗体的过

12、程中，选用哪两种细胞进行融合？为什么选择这哪两种细胞进行融合？为什么选择这两种细胞？两种细胞？浆细胞和骨髓瘤细胞浆细胞和骨髓瘤细胞浆细胞能产生浆细胞能产生单一抗体单一抗体，但不能无限增，但不能无限增殖；骨髓瘤细胞殖；骨髓瘤细胞能无限增殖能无限增殖，但不能产，但不能产生单一抗体。生单一抗体。现在学习的是第22页，共40页2 2、在这过程中进行了几次筛选？分别在、在这过程中进行了几次筛选？分别在哪个步骤进行筛选？哪个步骤进行筛选？两次筛选。第一次在两次筛选。第一次在B细胞和骨髓瘤细胞细胞和骨髓瘤细胞融合以后筛选出杂交瘤细胞；融合以后筛选出杂交瘤细胞；第二次在杂交瘤细胞中筛选出能产生所第二次在杂交瘤

13、细胞中筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。需抗体的杂交瘤细胞。现在学习的是第23页，共40页四、单克隆抗体的应用四、单克隆抗体的应用 请同学们根据自己所收集请同学们根据自己所收集的资料，谈谈单克隆抗体的应的资料，谈谈单克隆抗体的应用。用。可用于作为诊断试剂：有准确，高效，快速的优点可用于作为诊断试剂：有准确，高效，快速的优点可用于疾病治疗可用于疾病治疗可用于运载药物（作为可用于运载药物（作为运载运载对应疾病的药物的对应疾病的药物的“生物导弹生物导弹“。）。）“生物导弹生物导弹”单克隆抗体药物单克隆抗体药物现在学习的是第24页，共40页现在学习的是第25页，共40页 细胞细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细

14、胞融合细胞融合 浆浆筛选筛选 瘤细胞瘤细胞 杂交杂交细胞培养细胞培养选出能产生选出能产生特定抗体的特定抗体的细胞群继续细胞群继续培养培养体外培养体外培养 体内培养体内培养从培养液或小鼠从培养液或小鼠腹水中取出腹水中取出 单克隆抗体单克隆抗体现在学习的是第26页，共40页植物体细胞杂交、植物体细胞杂交、动物细胞融合的比较动物细胞融合的比较四四.细胞工程比较细胞工程比较主要用于制备主要用于制备单克隆抗体单克隆抗体获得杂种植株获得杂种植株用途用途物理、化学法物理、化学法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒物理（离心、振物理（离心、振荡、电刺激）荡、电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）诱导方法诱导

15、方法使细胞分散后使细胞分散后诱导细胞融合诱导细胞融合去除细胞壁后诱去除细胞壁后诱导原生质体融合导原生质体融合细胞融合的方法细胞融合的方法细胞膜流动性细胞膜流动性细胞增殖细胞增殖细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、植物细胞全能性植物细胞全能性原理原理动物细胞融合动物细胞融合植物体细胞杂交植物体细胞杂交比较项目比较项目克服远缘杂交不克服远缘杂交不亲和性的障碍亲和性的障碍现在学习的是第27页，共40页练习：练习：1 1、动物细胞融合和植物原生质体融合比较，、动物细胞融合和植物原生质体融合比较，在动物细胞融合中有特殊性的是（在动物细胞融合中有特殊性的是（）A A、融合的原理、融合的原理 B B、融合的优点

16、、融合的优点C C、融合的诱导手段、融合的诱导手段 D D、融合的过程、融合的过程现在学习的是第28页，共40页练习：练习：2 2、动物细胞融合的目的中最重要的是（、动物细胞融合的目的中最重要的是（）A A、克服远缘杂交不亲和、克服远缘杂交不亲和 B B、制备单克隆抗体、制备单克隆抗体C C、培育新物种、培育新物种 D D、生产杂种细胞、生产杂种细胞现在学习的是第29页，共40页练习：练习：3 3、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是（体，与骨髓瘤细

17、胞融合的是（）A A、经过免疫的、经过免疫的B B淋巴细胞淋巴细胞 B B、不经过免疫的、不经过免疫的T T淋巴细胞淋巴细胞 C C、经过免疫的、经过免疫的T T淋巴细胞淋巴细胞 D D、不经过免疫的、不经过免疫的B B淋巴细胞淋巴细胞现在学习的是第30页，共40页练习：练习：4.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）淋巴细胞淋巴细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞自身融淋巴细胞自

18、身融 合细胞合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞 杂交瘤细胞杂交瘤细胞 A B C D 现在学习的是第31页，共40页练习：练习：5 5、研究单克隆抗体治疗癌症的思路是（、研究单克隆抗体治疗癌症的思路是（）A A利用单克隆抗体特异性地对抗癌细胞利用单克隆抗体特异性地对抗癌细胞 B B以单克隆抗体作抗癌药物杀死癌细胞以单克隆抗体作抗癌药物杀死癌细胞C C抗癌物质在克隆细胞中大量合成抗癌物质在克隆细胞中大量合成D D单克隆抗体携带抗癌药物特异性地与癌细胞结单克隆抗体携带抗癌药物特异性地与癌细胞结合合现在学习的是第32页，共40页练习：练习：6 6只能使动物细胞融合的常用诱导方

19、法（只能使动物细胞融合的常用诱导方法（）A APEGPEG B B灭活的病毒灭活的病毒 C C电刺激电刺激 D D离心离心7 7、“生物导弹生物导弹”是指是指 （）A.A.单克隆抗体单克隆抗体 B.B.杂交瘤细胞杂交瘤细胞 C.C.产生特定抗体的产生特定抗体的B B淋巴细胞淋巴细胞 D.D.在单抗上连接抗癌药物在单抗上连接抗癌药物现在学习的是第33页，共40页练习：练习：8 8、下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中，、下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中，不正确的是（不正确的是（）A AB B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般不淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般不 需要灭活的仙台病毒或聚乙二醇

20、诱导需要灭活的仙台病毒或聚乙二醇诱导B B融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又 能产生单克隆抗体能产生单克隆抗体C C体外培养时，一个效应体外培养时，一个效应B B淋巴细胞可以产生淋巴细胞可以产生 抗体，但不能无限增殖抗体，但不能无限增殖D D单克隆抗体与常规抗体相比，特异性强，灵单克隆抗体与常规抗体相比，特异性强，灵 敏度高，优越性明显敏度高，优越性明显A现在学习的是第34页，共40页9.9.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B B淋巴细胞淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在诱导融合后，要用特定培养基

21、筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）淋巴细胞淋巴细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞B B淋巴细胞自身融合细胞淋巴细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞 A A B B C C D D C现在学习的是第35页，共40页现在学习的是第36页，共40页在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤细胞的在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤细胞的情况下，培养得到的细胞群是单个杂交瘤细胞克情况下，培养得到的细胞群是单个杂交瘤细胞克隆得来的，所以产生的抗体必然是化学性质单一隆得来的，所以产生的抗体必然是化学性质单一

22、的，特异性强的单克隆抗体。这里的的，特异性强的单克隆抗体。这里的单克隆单克隆确有确有单个细胞克隆单个细胞克隆的含义，只不过的含义，只不过克隆的克隆的不是不是B B淋淋巴细胞，而巴细胞，而是杂交瘤细胞是杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能迅速大量繁殖，又能产生专一杂交瘤细胞既能迅速大量繁殖，又能产生专一抗体。抗体。现在学习的是第37页，共40页思考与探究1.1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同？不同？植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，不同的是植物体细胞融合

23、前需去掉细胞壁，然后然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融合。再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融合。诱导融合方法不同：动物细胞诱导融合所用的方法诱导融合方法不同：动物细胞诱导融合所用的方法比植物体细胞杂交多一类灭活的病毒诱导；结果不比植物体细胞杂交多一类灭活的病毒诱导；结果不同：植物体细胞杂交培养成了杂种植株，而动物细同：植物体细胞杂交培养成了杂种植株，而动物细胞融合只培养出了杂交细胞。胞融合只培养出了杂交细胞。现在学习的是第38页，共40页2.2.制备单克隆抗体时，为什么要选用制备单克隆抗体时，为什么要选用B B淋巴细胞和淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？骨髓瘤细胞融合形成杂交

24、瘤细胞？哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的B B淋巴细胞，淋巴细胞，B B淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过程中，每一种免疫反应的过程中，每一种B B淋巴细胞能分泌一种特异性抗淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的的B B淋巴细胞大量增殖。淋巴细胞大量增殖。B B淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体但不能在

25、体外增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。因此，把一种因此，把一种B B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性它会兼有两个亲本细胞的特性在体外培养条件下能在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。现在学习的是第39页，共40页知识拓展知识拓展3 3.为什么不只用两个而要用多个细胞进行动物细胞间为什么不只用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的融合？的融合？就目前常用的细胞融合方法来

26、看，不管是用物理的、化学的方就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是法，还是生物的方法，其融合率都不可能是100%100%。仅用两个细。仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。更重要的是，胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备。我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。我们体的制备。我们以制备单克

27、隆抗体为例来说明这一问题。我们知道，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每知道，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个一个B B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含胞（含B B淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。抗体的杂交瘤细胞。现在学习的是第40页，共40页