基因克隆的酶学基础.ppt

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1、基因克隆的酶学基础现在学习的是第1页，共71页分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用l限制性内切酶限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割 lDNA甲基化酶甲基化酶用于DNA分子的甲基化 l核酸酶核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割 l核酸聚合酶核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 l核酸连接酶核酸连接酶用于DNA和RNA的连接 l核酸末端修饰酶核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰 l其其它它酶酶类类-用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。现在学习的是第2页，共71页第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶现在学习的是第3页，共71页一一.限制性内切酶的发现限制性内切酶

2、的发现1.细菌限制修饰系统的发现细菌限制修饰系统的发现WernerArber于于1962-1968年发现，年发现，1968年分离到年分离到I型限制型限制酶。酶。2.限制酶限制酶HindII的发现的发现HOSmith和和Wilox于于1970年首次从流感嗜血杆菌年首次从流感嗜血杆菌（H.influenzae）中发现并分离到）中发现并分离到HindII限制酶。限制酶。3.SV40限制图谱和转录图谱的绘制限制图谱和转录图谱的绘制D.Nathans（1971年）用年）用HindII绘制绘制SV40的限制酶谱。的限制酶谱。现在学习的是第4页，共71页二二.限制修饰系统的种类限制修饰系统的种类1.I型型：

3、由三个基因构成，由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色体上，三个基因构成一个复合）位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（腺苷甲硫腺苷甲硫氨酸）。氨酸）。2.II型型：限制与修饰基因产物独立起作用，在限制与修饰基因产物独立起作用，在.coli中这两种基因位于质粒上。中这两种基因位于质粒上。3.III型型：修饰酶与型酶相同，修饰酶与型酶相同，hsd与与hsd基因产基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。物结合成一

4、亚单位，限制酶是独立存在的。上述三个系统中，只有上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。现在学习的是第5页，共71页三三.限制性内切酶的定义、命名限制性内切酶的定义、命名1.定义定义：广义指上述三个系统中的限制酶；广义指上述三个系统中的限制酶；狭义狭义指指II型限制酶。型限制酶。2.命名命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。编号、分离顺序。例如：例如：Hind前三个字母来自于菌种名称前三个字母来自于菌种名称H.i

5、nfluenzae，“”表示菌系为型血清型；表示菌系为型血清型；“”表示分离到的第三个限制酶。表示分离到的第三个限制酶。EcoRIEscherichia coliRIHindHaemophilusinfluensae dSacI(II)Streptomycesachromagenes I()现在学习的是第6页，共71页四限制酶的特点四限制酶的特点1.识别顺序和酶切位点识别顺序和酶切位点）识别）识别-8个相连的核苷酸个相连的核苷酸MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CC BamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPy NotIGCGGCCGC；SfiIGGCCNNNNNG

6、GCCCCGGNNNNNCCGG FokI5-()9-33-()13-5外侧，产生外侧，产生-端突起端突起）富含）富含现在学习的是第7页，共71页）对称性）对称性双双对称对称EcoRI5-GAATTC-33-CTTAAG-5）切点大多数在识别顺序之内，也有例外）切点大多数在识别顺序之内，也有例外）限制酶切后产生两个末端，末端结构是）限制酶切后产生两个末端，末端结构是-和和-2.末端种类末端种类）-端突起端突起，个数为或个核苷酸，个数为或个核苷酸Pst I5-CTGCAG-35-CTGCAG-33-GACGTC-53-GACGTC-5）-端突起端突起，个数为或个核苷酸，个数为或个核苷酸EcoRI

7、5-GAATTC-35-GOHPAATTC-33-CTTAAG-53-CTTAAPHOG-5现在学习的是第8页，共71页）平齐末端平齐末端SmaI5-CCCGGG-35-CCCGGG-33-GGGCCC-53-GGGCCC-5）非互补的粘性末端）非互补的粘性末端）切点在识别顺序之外的，如：）切点在识别顺序之外的，如：FokI FokI5-GGATG()9-35-GGATG(N)93-CCTAC()13-53-CCTAC(N)13）能识别简并顺序的，如：）能识别简并顺序的，如：AvaIAvaI5-CPyCGPuG-3CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG现在学习的是第9页，共71

8、页）相容性末端）相容性末端如：如：BamHIGGATCC BglIIAGATCT MboI,Sau3AINGATCN上上述述几几种种限限制制酶酶产产生生的的DNA片片段段仍仍可可相相连连，由由此此形形成成的的重重组组分分子子能能被被MboI和和Sau3AI识别和酶切，但识别和酶切，但BamHI和和BglII的识别机率只有的识别机率只有1/16。BamHI+MboIA/C/G/TGATCT/C/G/ABamHI和和BglII(AGATCT)两两种种酶酶产产生生的的相相容容性性末末端端，相相连连后后不不能能为为两两种酶所识别和酶切。种酶所识别和酶切。BamHI+BglIIA/GGATCT/C 不同

9、末端的连接特性不同末端的连接特性:除第除第4 4种末端不能进行不同种末端不能进行不同DNA分子或分子或同种同种DNA分子不同切点产生的末端相连外，其余分子不同切点产生的末端相连外，其余4 4种末端可以种末端可以相互连接。相互连接。现在学习的是第10页，共71页五五.异源同序酶（异源同序酶（isoschizomer，同裂酶），同裂酶）1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制限制酶酶2.特点：特点：1）识别相同顺序）识别相同顺序2）切割位点的异同）切割位点的异同 KpnIGGTACCAsp718GGTACC SstICCGCGGSacICCGCG

10、G六六.限制酶的星反应（限制酶的星反应（staractivity）1.特点特点:限制酶识别序列特异性降低限制酶识别序列特异性降低2.发生星反应的限制酶和条件（见下页）发生星反应的限制酶和条件（见下页）3.星反应的利用和避免星反应的利用和避免现在学习的是第11页，共71页表表1 1 具有星反应的限制性内切酶与条件具有星反应的限制性内切酶与条件限制酶诱发星活性的条件限制酶诱发星活性的条件a a识别序列识别序列AvaAvaI 1,2,4I 1,2,4BamBamHI 1-5,8 G GATCN,G PuATCCHI 1-5,8 G GATCN,G PuATCCBstBstI 2,4I 2,4BsuB

11、suI 2,4,6I 2,4,6EcoEcoRI 1,2,4-6 N AATTNRI 1,2,4-6 N AATTNHaeHae 2,4 2,4HhaHhaI 2,4,7I 2,4,7HinHind 6d 6HpaHpaI 1,2,4I 1,2,4PstPstI 1,2,4,7I 1,2,4,7PvuPvu 2,4 2,4SalSalI 1,2,4,7I 1,2,4,7ScaScaI 4-6,8 I 4-6,8 SstSst 2,4 2,4XbaXbaI 2,4,7I 2,4,7a.1a.1：亚乙二醇：亚乙二醇(45%)(45%)；2:2:甘油甘油(12%)(12%)；3 3：乙醇：乙醇(12

12、%)(12%)；4 4：高酶：高酶/DNA/DNA比比(25U/g)(25U/g)；5：Mn+代替代替Mg+；6:pH8.5;7:二甲基亚砜二甲基亚砜(8%);8:无无NaCl。现在学习的是第12页，共71页七七.其它特异性的内切酶及其用途其它特异性的内切酶及其用途1.末端酶（末端酶（terminase）：）：5-GGGCGGCGACCTN-3N-5，出现的频率约，出现的频率约412分子量为分子量为117,000=1A（74,000）+2Nul（21,000）2.Omega核酸酶（核酸酶（I-SceI）：）：由内含子编码，用于由内含子编码，用于rRNA的剪切，出现的频率约的剪切，出现的频率约4

13、18=6.9X1010bp，其识别顺序为其识别顺序为5-TAGGGATAACAGGGTAAT-3TATT3.I-PpoI：来自于来自于Physarum polycephalum识别序列：识别序列：CTCTCTTAAGGTAGCAATT4.用途用途遗传标记，遗传标记，构建载体构建载体现在学习的是第13页，共71页八八.限制酶的用途限制酶的用途1.DNA重组重组2.限制酶（物理）图谱绘制限制酶（物理）图谱绘制3.突变分析（突变分析（RFLP分析）分析）4.限制酶的部分酶切与完全酶切限制酶的部分酶切与完全酶切附：附：IIS型限制酶的特点型限制酶的特点1.具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有对

14、具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有对称结构。称结构。2.酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点的一侧，的一侧，1-20nt。3.酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。4.产生粘性末端可以是产生粘性末端可以是1-5个核苷酸。个核苷酸。5.均为单体，分子量为均为单体，分子量为47108kD。现在学习的是第14页，共71页第二节第二节DNA甲甲 基基 化化 酶酶现在学习的是第15页，共71页一一.甲基化酶的种类与识别顺序甲基化酶的种类与识别顺序1.限制修饰系统限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶型中的

15、甲基化酶三个系统中的甲基化酶可使细菌三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤：甲基腺嘌呤：在在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。如：如：M.EcoRIGAmATTCCEcoRIGAATTC不同不同MHpaICmCGGHpaICCGG相同相同现在学习的是第16页，共71页2.Ecoli的的dam、dc

16、m甲基化酶甲基化酶这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统。饰系统。damGmATC，dcmCmCA/TGG3.哺乳动物的甲基化酶哺乳动物的甲基化酶该酶可使该酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与DNA复制、基因转录等过程有关。复制、基因转录等过程有关。4.Ecoli中依赖于甲基化的限制修饰系统中依赖于甲基化的限制修饰系统mrr（mA/A）、）、mcr(Am5CG)、merB（Pum5C）现在学习的是第17页，共71页二二.甲基化酶活性对限制酶活性的影响甲基化酶活性对限制酶活性的影响1.dcm和和dam甲

17、基化酶对限制酶的影响甲基化酶对限制酶的影响1）抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序是完全）抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序是完全重叠还是边界重叠重叠还是边界重叠如：完全重叠如：完全重叠BclIdam(GATC)；ScrFIdcm(CCA/TGG)边界重叠边界重叠ClaI-dam；Sau96I-dcm2）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重叠）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重叠如：如：dam-BamHI，Sau3AI，BglII，PvuI；dcm-BstNI现在学习的是第18页，共71页表表2 2 对甲基化敏感的限制性内切酶对甲基化敏感的限

18、制性内切酶限制酶限制酶 识别序列识别序列*甲基化酶甲基化酶AvaAva GG(A/T)GG(A/T)CCCC(A/T)GG(A/T)GG dcmdcmBclBcl T TGATCGATCA A dam dam ClaCla G GATCATCGATGAT dam dam EcoEcoR R CC(A/T)GGCC(A/T)GG dcmdcmHphHph GGTGGTGAGATCTC dam damMboMbo GATCGATC dam damNruNru GAGATCTCGCGAGCGA dam damSauSau96 96 GGNGGNCCCC(A/T)GG(A/T)GG dcmdcmSau

19、SauF F CC(A/T)GGCC(A/T)GG dcmdcmStuStu AGGAGGCCTCCTGGGG dcmdcmTagTag GATCGATCGA damGA damXbaXba TCTATCTAGAGATCTC dam dam *下横线字母表示限制酶识别序列下横线字母表示限制酶识别序列,绿色字母表示绿色字母表示damdam甲基化酶识甲基化酶识别序列别序列,红色字母表示红色字母表示dcmdcm甲基化酶识别序列甲基化酶识别序列现在学习的是第19页，共71页2.II型甲基化酶对限制酶活性的影响型甲基化酶对限制酶活性的影响）抑制同种限制酶的活性抑制同种限制酶的活性M.BamHIGGATm

20、CCBamHI(G GATCC)M.EcoRIGAmATTCEcoRI(G AATTC)）抑制不同种限制酶的活性抑制不同种限制酶的活性a.顺序完全重叠顺序完全重叠如：如：M.ClaI（ATCGmAT）-TaqI（TCGmA）b.顺序边界重叠顺序边界重叠如：如：M.BamHI（GGATmCC）-MepI（mCCGG）抑制不同种限制酶的部分活性抑制不同种限制酶的部分活性MTaqI（TCGmA）-HindII（GTPyPuAC）：）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC3.甲基化酶的用途甲基化酶的用途）改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成改变某些限制酶识别顺序的特异性

21、，以便重组体的形成）在建立基因文库时，可先使在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限分子部分甲基化，然后再用限制酶切制酶切现在学习的是第20页，共71页表表3 3 甲基化酶与识别序列甲基化酶与识别序列甲基化酶甲基化酶 识别序列识别序列a a 受甲基化影响的限制酶受甲基化影响的限制酶b b M.Alu AG M.Alu AGmCT CT Alu Alu,BamBamH,H,BspBsp12861286 DdeDde,HgiHgiA,A,NheNhe,Pst Pst M.BamH GGAT M.BamH GGATmCC CC BamBamH,H,MspMsp M.Cla ATCG

22、M.Cla ATCGmAT AT Cla Cla,MboMbo,TaqTaq dam G dam GmATCATC c c dcm CCA/TGG dcm CCA/TGG c c M.EcoR GA M.EcoR GAmATTC ATTC EcoEcoRR M.HI M.HId d GCNGC GG GCNGC GGmCC CC MstMst,PstPst,PvuPvu M.Hae GG M.Hae GGmCC CC BanBan,BglBgl,BspBsp1286,1286,BstBstX,X,HaeHae,MspMsp,NaeNae,NcoNco,SacSac,SauSau9696 M.H

23、ha G M.Hha GmCGC CGC AhaAha,FnuFnuD,D,HhaHha M.Hpa C M.Hpa CmCGG CGG AhaAha,AvaAva,AvaAva,HpaHpa,ScrScrFF M.Hph T M.Hph TmCACC CACC HinHinf,f,HphHph,SauSau3A3A M.Msp M.Msp mCCGG CCGG BamBamH,H,Msp Msp M.Pst CTGC M.Pst CTGCmAG AG AluAlu,PstPst M.Taq TCG M.Taq TCGmA A AluAluI,I,AvaAva,EcoEcoRV,RV,HinH

24、inC,C,HinHinf,f,MboMbo,TaqTaq,XmnXmna.a.标在碱基的左上角的标在碱基的左上角的m m表示该碱基被甲基化表示该碱基被甲基化;b.;b.所列出的限制酶均已商品化所列出的限制酶均已商品化;c.;c.参见表参见表2;d.M.HI2;d.M.HI分离自噬菌体污分离自噬菌体污染的细菌细胞，它可识别两个序列，染的细菌细胞，它可识别两个序列，GCNGCGCNGC的甲基化位点尚未确定。的甲基化位点尚未确定。现在学习的是第21页，共71页M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3与载体相连与载体相连甲基甲基化酶化酶人工人工接头接头

25、RE用于基因组文库的建立用于基因组文库的建立用于用于cDNA的连接的连接RERERE现在学习的是第22页，共71页第三节第三节核核 酸酸 酶酶现在学习的是第23页，共71页ds-DNA结构结构:切口切口,缺口缺口,断口断口缺口缺口(gap)切口切口(nick)断口断口(cut)3HOP53HOP5现在学习的是第24页，共71页一一.外切酶外切酶III（ExoIII）1.一般特点：一般特点：来自于来自于E.coli，分子量，分子量28,000kD2.催化反应类型催化反应类型1)外切酶活性：外切酶活性：35，产生，产生5-单磷酸核苷酸和具各种单磷酸核苷酸和具各种结构的结构的ds-DNA，pH7.6

26、-8.52)核酸酶核酸酶H活性：除去活性：除去DNA-RNA杂交分子中的杂交分子中的RNA分子，分子，pH7.6-8.53)3-磷酸酶活性：除去磷酸酶活性：除去3-磷酸基后形成磷酸基后形成3-OH端，端，有利于有利于DNA聚合酶反应，聚合酶反应，pH6.8-7.44)内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开，键切开，pH7.6-8.5现在学习的是第25页，共71页3.外切酶活性特点外切酶活性特点1)反应底物：互补反应底物：互补ds-DNA2)碱基释放速度：碱基释放速度：CA-TG3)反应产物：反应产物：5-单磷酸核苷和具缺口或单磷酸核苷和具缺口或5-端突起的

27、端突起的ds-DNA，过度反应将导致，过度反应将导致DNA降解降解4.用途用途1)核酸（核酸（DNA）标记）标记2)基因突变基因突变-缺失缺失3)DNA序列测定时作顺序缺失序列测定时作顺序缺失5.使用注意事项使用注意事项1)正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度2)在一定条件下，在一定条件下，ExoIII不能作用不能作用GC富集区富集区(来自于来自于cDNA加尾加尾)现在学习的是第26页，共71页5P5P5P5P5P3HO3HO3HO3HO3HO3HO3HO3HOOH3OH3OH3OH3P5P5P5P5P5P5P53HOP5OH3P5RNaseHExo

28、III的外切酶和的外切酶和RNaseH的作用的作用现在学习的是第27页，共71页1234abc1234abc1234abc1234abc1234abc234abc34abc4abcabcExoIII用于顺序缺失用于顺序缺失ExoIIIExoIII-32P-32PdCTPdCTP5PP55PP53HOOH33HOOH3ExoIII用于用于DNA标记标记现在学习的是第28页，共71页二二.外切酶外切酶1.反应特点反应特点1)作用底物作用底物:要求要求5-PO4基基;不作用含切口的不作用含切口的DNA分子分子2)作用方向与产物：作用方向与产物：53;产生产生5-P核苷和核苷和3-突起的突起的ds-D

29、NA2.用途：用途：DNA定序测定定序测定;除去除去5-端突起，产生端突起，产生3-端突起，端突起，便于加尾便于加尾3HO3HO3HOOH3OH3OH35P5P5PP5P5P5AAAAAAAAAAAATdT+dATP现在学习的是第29页，共71页三三.核酸酶核酸酶Bal311.一般特点：一般特点：胞外酶；具胞外酶；具DNase和和RNase活性；由活性；由“快快”和和“慢慢”两种成分构成两种成分构成2.催化反应特点催化反应特点1)底物：底物：ss-DNA，ds-DNA，RNA(外切与内切活性外切与内切活性)2)作用方向与产物：作用方向与产物：53和和35同时进行，但反应速度同时进行，但反应速度

30、不同；不同；产生产生5-单磷酸核苷和缩短的单磷酸核苷和缩短的ds-DNA3.用途：用途：基因突变基因突变-缺失缺失;绘制限制酶谱绘制限制酶谱;DNA定序定序(与与ExoIII相相同同)，其优点是，其优点是Bal31酶活依赖于酶活依赖于Ca+和和Mg+，Ca+在反应完毕后在反应完毕后可用可用EGTA（乙二醇四乙酸）灭活而不影响（乙二醇四乙酸）灭活而不影响Mg+浓度，后者是浓度，后者是限制酶活性必需的限制酶活性必需的4.使用注意事项：使用注意事项：1)应作预备实验，因每批酶制品的应作预备实验，因每批酶制品的“快快”“慢慢”酶含量不同酶含量不同2)DNA两条链碱基组成不同，终止反应时存在单链突起，两

31、条链碱基组成不同，终止反应时存在单链突起，需要补平需要补平现在学习的是第30页，共71页5PP53HOOH3核酸酶核酸酶Bal31的活性的活性现在学习的是第31页，共71页四四.核酸酶核酸酶S11.一般特点：一般特点：糖蛋白糖蛋白(含糖量含糖量8%)，最佳，最佳pH4.5，对热稳定，对热稳定，抗变性剂抗变性剂2.催化反应类型催化反应类型:ss-DNA;ss-RNA;双螺旋变性区双螺旋变性区3.用途用途1)基因突变基因突变-缺失，常与外切酶，如缺失，常与外切酶，如ExoIII、外切酶、外切酶、Bal31连用连用2)DNA定序分析定序分析3)S1作图法作图法4)基因结构分析基因结构分析5)tRNA

32、结构分析结构分析4.使用注意事项使用注意事项1)避免长时间反应，因最适酸性避免长时间反应，因最适酸性pH将导致将导致DNA断裂或降解断裂或降解2)避免使用高浓度酶量，以免避免使用高浓度酶量，以免DNA被降解被降解(因产生切口因产生切口)现在学习的是第32页，共71页ExoIIIS1S1S1S1S1S1Poly(A)Poly(A)555555核酸酶核酸酶S1活性活性现在学习的是第33页，共71页五五.绿豆核酸酶绿豆核酸酶1.与与S1酶相同点：酶相同点：作用于作用于ss-DNA和和RNA，对，对5-端的突端的突起核苷酸作用速度为起核苷酸作用速度为GCAT2.与与S1酶的不同点酶的不同点最适最适pH

33、接近中性，不会产生切口接近中性，不会产生切口;不使具切口的不使具切口的ds-DNA断断裂裂3.用途：用途：与与S1酶相同酶相同六六.外切酶外切酶作用于作用于ss-DNA的的3-与与5-端，产物为低聚核苷酸端，产物为低聚核苷酸除去单链除去单链DNA形成平整末端形成平整末端七七.牛脾磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶作用含作用含5-羟基端的羟基端的ss-DNA和和RNA，产生，产生3-单磷酸核苷单磷酸核苷用于短链用于短链RNA和和DNA的定序分析的定序分析现在学习的是第34页，共71页八八.蛇毒磷酸二酯酶蛇毒磷酸二酯酶作用作用3-羟基单、双链羟基单、双链DNA和和RNA，产生，产生5-单磷酸核苷单磷酸核苷用

34、于用于RNA和和DNA的定序分析的定序分析表表4几种常用外切酶的特点几种常用外切酶的特点外切酶外切酶作用方向作用方向作用底物作用底物反应产物反应产物ExoIII35dsDNA单核苷酸单核苷酸外切酶外切酶53ss和和dsDNA同上同上Bal3135和和53ss和和dsDNA,RNA同上同上S135和和53ssRNA和和ssDNA低、核苷酸低、核苷酸绿豆核酸酶绿豆核酸酶35和和53ssRNA和和ssDNA同上同上ExoVII35和和53ssDNA低聚核苷酸低聚核苷酸牛脾磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶53ssRNA，ssDNA同上同上蛇毒磷酸二酯酶蛇毒磷酸二酯酶35ss，dsRNA和和DNA同上同上现在学

35、习的是第35页，共71页九九.RNase大部分用于大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去的核苷酸序列分析或除去DNA样品样品或蛋白质合成系统中的或蛋白质合成系统中的RNA分子。分子。RNase的识别序列和特的识别序列和特点见点见表表5。1.RNaseA分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100加热加热15min仍具活性）仍具活性）,用于除去用于除去DNA样品中的样品中的RNA分子分子2.核酸酶核酸酶S7，亦称微球菌核酸酶，对亦称微球菌核酸酶，对RNA敏感，用于除去蛋敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源白质合成系统中的内源mRNA十十.RNaseH作用于作用于DN

36、A-RNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链，用于链，用于cDNA文库建文库建立时除去立时除去DNA链以便第二条链链以便第二条链cDNA链的合成。链的合成。现在学习的是第36页，共71页表表5核糖核酸酶反应特点核糖核酸酶反应特点核酸酶核酸酶特异性反应特异性反应核酸酶核酸酶特异性反应特异性反应APyp/NPhyMAp/N或或Up/NCL3Cp/N,Ap/N和和Cp/N B.cereusCp/N,Up/NT1Gp/NP1无特异性反应无特异性反应T2无特异性反应无特异性反应S7Np/A和和Np/UU2Pup/N或或Ap/NPhy1Ap/N,Gp/N和和Up/N现在学习的是第37页，共71页十一十一.D

37、NaseI1.特点：特点：具内切酶活性，作用于具内切酶活性，作用于ds-DNA，但无核苷酸序，但无核苷酸序列特异型，产生列特异型，产生5-P低聚核苷酸低聚核苷酸;Ca2+,Mg2+或或Ca2+,Mn2+可使酶活达最大值可使酶活达最大值当酶浓度很低时，当酶浓度很低时，ds-DNA分子上将形成切口，不同类分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：Mg2+存存在时，两条链上的切口独立无关在时，两条链上的切口独立无关Mn2+存在时，两条链上的存在时，两条链上的切口几乎在同一位置切口几乎在同一位置2.用途用途1)切口移位，制备切口

38、移位，制备DNA探针探针2)制备制备RNA样品时除去样品时除去DNA分子分子3)基因突变时产生切口基因突变时产生切口现在学习的是第38页，共71页Mn+存在时存在时Mg+存在时存在时DNaseI作用特点作用特点DNaseIHOP535353DNaseI与与PolI的的切口移位切口移位PolI现在学习的是第39页，共71页第四节第四节DNA聚聚 合合 酶酶现在学习的是第40页，共71页一一.E.coli DNA聚合酶聚合酶I（polI）1.E.coli的的DNA聚合酶系统聚合酶系统PolI参与参与DNA修复修复,具具35和和53外切酶活性外切酶活性polII同上同上具具35外切酶活性外切酶活性p

39、olIII参与参与DNA复制复制,具具35和和53外切酶活性外切酶活性2.E.colipolI的特点的特点1）具两种外切酶活性和）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具53外切酶活性，外切酶活性，大片段具大片段具35外切酶活性外切酶活性(大片段亦称为大片段亦称为Klenow片段片段,polIK)2）聚合酶活性，聚合酶活性，53,要求要求3-OH引物和模板引物和模板DNA，其延续性，其延续性受反应条件的影响（表受反应条件的影响（表6）3）外切酶活性外切酶活性现在学习的是第

40、41页，共71页3.用途用途1）除去除去3-端突起的单链端突起的单链DNA（在无（在无dNTP时）时）2）补齐补齐5-突起端突起端3）合成第二条合成第二条cDNA4）切口移位制备探针切口移位制备探针其中用途其中用途2)和和3)常用大片段常用大片段表表6E.coli DNAPolI的延续性的延续性DNA模板模板-引物类型引物类型反应条件反应条件延续性延续性(碱基数碱基数)切口切口ColE137C,低盐低盐8缺口缺口ColE137C,低盐低盐47切口切口/缺口胸腺缺口胸腺DNA37C,低盐低盐24polyd(AT)37C,低盐低盐188polyd(AT)5C,低盐低盐14polyd(AT)5C,高

41、盐高盐3现在学习的是第42页，共71页二二.T4DNA聚合酶聚合酶1.特点：特点：53聚合酶活性，聚合酶活性，1500nt/min,为为polI的两倍的两倍35外外切酶活性，可作用于切酶活性，可作用于ss-DNA和和dsDNA,其切除速度分别为其切除速度分别为40和和4000nt/min2.用途：用途：制备高比活性探针制备高比活性探针(1010cpm/gDNA);DNA末端修饰末端修饰-缺缺失失5CAGCAACGT3dATPCAGCAACGT3S1T33GTCGTTGCA5T4聚合酶聚合酶A5A5外切酶活性外切酶活性聚合酶活性聚合酶活性无无dNTPdNTP现在学习的是第43页，共71页三三.反

42、转录酶反转录酶1.AMV反转录酶反转录酶1）结构与酶活性结构与酶活性反转录酶以反转录酶以，形式存在，其中形式存在，其中（无活性）（无活性）P32（内切酶活性）（内切酶活性）+聚合酶聚合酶+P24（RNaseH活性），各步反应由蛋白酶催化活性），各步反应由蛋白酶催化2）聚合酶活性）聚合酶活性a.RNA，DNA引物（大于引物（大于8nt）cDNA链链bDNA-RNA引物引物互补互补DNA链链c(rA)1100(dT)12-18(dT)nor(rc)n.dGn(dG)n现在学习的是第44页，共71页反转录酶的结构和活性反转录酶的结构和活性 P24 P24190kD160kD65kD24kDP32RN

43、aseH聚合酶聚合酶5AAAAA3引物引物5AAAAA3TTTTT5反转录反应反转录反应53533535 全长全长cDNA提前终止反应提前终止反应现在学习的是第45页，共71页2.M-MLV反转录酶反转录酶1)特点：特点：不具内切酶活性不具内切酶活性;RNaseH活性低活性低;稳定性差稳定性差2)与与AMV反转录酶比较反转录酶比较a合成短链合成短链cDNA(0.6kb)时，两者相同，但时，两者相同，但M-MLV反转反转录酶需要量大，可能与其稳定性差有关录酶需要量大，可能与其稳定性差有关b合成长链合成长链cDNA(4.5-7.5kb)时，它比时，它比AMV反转录酶有反转录酶有效得多，这与它无内切

44、酶活性有关。效得多，这与它无内切酶活性有关。3)用途用途a.cDNA合成用于文库建立合成用于文库建立;b.制备制备cDNA探针探针;c.DNA序列分析序列分析;d.填补填补5-突起末端以获平端突起末端以获平端现在学习的是第46页，共71页四四.TaqDNA聚合酶聚合酶1.特点：特点：分离自水生栖热菌，分子量为分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度，最适反应温度75，对对95高温具良好稳定性，该酶不存在高温具良好稳定性，该酶不存在35外切外切酶活性酶活性2.用途：用途：主要用于主要用于DNA的体外扩增，经的体外扩增，经25次循环后才进入酶次循环后才进入酶的反应稳定期，一个的反应稳定

45、期，一个DNA分子因而可被扩增分子因而可被扩增4106倍倍DNA扩增技术又称为扩增技术又称为聚合酶链式反应聚合酶链式反应，它包括以下三，它包括以下三个步骤：个步骤：DNA模板变性模板变性(95)与与DNA引物退火引物退火(45)引物延引物延伸伸(75)现在学习的是第47页，共71页TaqPol和和PCR53变性变性3553引物引物35复性复性535335引物引物3553延伸延伸533535现在学习的是第48页，共71页五五.DNA定序酶定序酶用基因工程方法去除用基因工程方法去除35外切酶活性的外切酶活性的TaqDNA聚聚合酶合酶六六.TthDNA聚合酶聚合酶93kD，75，含有二级结构，含有二

46、级结构DNA分子的定序分子的定序七七.TliDNA聚合酶聚合酶100仍具酶活，仍具酶活，35外切酶活性，外切酶活性，85kDDNA的切平反应和补平反应的切平反应和补平反应DNA聚合酶和核酸酶聚合酶和核酸酶S1或绿豆核酸酶连用或绿豆核酸酶连用,可用可用于于DNA末端结构的修饰末端结构的修饰现在学习的是第49页，共71页5AAGCTT3HindIII5AAGCTT33TTCGAA53TTCGAA5S1dNTP+klenowfrag5AT35AAGCTAGCTT33TA53TTCGATCGAA5T4DNA连接酶连接酶T4DNA连接酶连接酶5AT35AAGCTAGCTT33TA53TTCGATCGAA

47、5切平反应和补平反应切平反应和补平反应现在学习的是第50页，共71页四种不同补平反应四种不同补平反应5-GGATCC-3BamHI5-GGATCC-33-CCTAGG-53-CCTAGG-5dNTPdGTPdGTP/dATPdGTP/dATP/dTTP5-GGATC5-GG5-GGA5-GGAT3-CCTAG3-CCTAG3-CCTAG3-CCTAGGATCC-3GATCC-3GATCC-3GATCC-3CTAGG-5GG-5AGG-5TAGG-5IS1S1S15-GGCC-35-GGATCC-35-GGATATCC-33-CCGG-53-CCTAGG-53-CCTATAGG-5IIIII现在

48、学习的是第51页，共71页第第 五五 节节RNA聚聚 合合 酶酶现在学习的是第52页，共71页一一.SP6RNA聚合酶聚合酶1、特点：、特点：依赖于依赖于DNA的的RNA聚合酶，具聚合酶，具SP6启动子特异型启动子特异型2、用途：、用途：主要用于主要用于RNA分子的体外合成，分子的体外合成，RNA分子可用于：分子可用于：1）RNA分子的拼接研究分子的拼接研究2）标记的标记的RNA常用于杂交，常用于杂交，RNA-DNA比比DNA-DNA分子更稳定，两条链均可标记，产生的分子更稳定，两条链均可标记，产生的RNA具高放射具高放射比活性比活性3）DNA的定序分析的定序分析4）基因结构的研究，其中包括内

49、含子数目，长度和位置基因结构的研究，其中包括内含子数目，长度和位置5）还可以用于蛋白质的合成研究还可以用于蛋白质的合成研究现在学习的是第53页，共71页RNA聚聚合合酶酶活活性性现在学习的是第54页，共71页二二.T7RNA聚合酶聚合酶特异性识别特异性识别T7噬菌体基因启动子噬菌体基因启动子三三.T3RNA聚合酶聚合酶特异性识别特异性识别T3噬菌体基因启动子噬菌体基因启动子基因启动子识别的特异性比较：基因启动子识别的特异性比较：SP6T7T3四四.E.coliRNA聚合酶聚合酶五五.多聚核苷酸磷酸化酶多聚核苷酸磷酸化酶现在学习的是第55页，共71页第第 六六 节节连连 接接 酶酶现在学习的是第

50、56页，共71页一一.T4DNA连接酶连接酶1.特点：特点：只连接只连接ds-DNA分子，要求分子，要求3-羟基和羟基和5-磷酸基磷酸基2.用途：用途：1)相同或相容粘性末端的连接相同或相容粘性末端的连接2)平整末端的相连平整末端的相连DNA平端来源：限制酶作用结果平端来源：限制酶作用结果;限制酶与其它酶共同限制酶与其它酶共同作用结果作用结果。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多所需的酶量也多3.抑制剂：抑制剂：PO43-5mM,NaCl25mM,Ca+0.1mM现在学习的是第57页，共71页5-AAGCTT-35-AOHPAGCTT-3